Screening per fitoestrogeni utilizzando un recettore degli estrogeni a base cellulare β test reporter

Utilizziamo questo test per valutare se gli alimenti vegetali contengono fitosteriodi, che possono influenzare i processi fisiologici negli animali, nonché il comportamento e il successo riproduttivo. Questo test fornisce un metodo semplice e affidabile per determinare se le piante producono composti estrogenici con attività biologica. Questo metodo è stato sviluppato inizialmente per lo screening di farmaci con attività xenoestrogenica per applicazioni in medicina.

Ad esempio, l'inibizione della proliferazione cellulare. Lo stiamo usando per fornire informazioni sull'ecologia e l'evoluzione dei primati. È importante fare pratica con la tecnica asettica in un ambiente pulito prima di tentare questo test, poiché è molto sensibile alla contaminazione.

Inizia liofilizzando gli oggetti vegetali freschi con il liofilizzatore, quindi macinali finemente utilizzando un mulino di macinazione con un vaglio a maglie da 0,85 millimetri. Conservare i campioni macinati in sacchetti al buio fino all'estrazione. Per estrarre eventuali fitosteroidi nelle piante, aggiungere un campione essiccato a un pallone di dimensioni adeguate, quindi a metanolo di grado HPLC.

Coprire la soluzione di metanolo vegetale con un foglio di alluminio e impostarla in modo che ruoti a 100 giri/min per tre giorni su un agitatore orbitale. Dopo tre giorni, utilizzare la carta da filtro per decantare il supernato e in un sistema di filtrazione a goccia. Essiccare l'estratto vegetale con un evaporatore rotante fino a quando non si sarà addensato, ma versabile in un pallone a fondo tondo da 300 millilitri.

Versare il campione in un pallone da 50 millilitri e sciacquare il pallone grande con una piccola quantità di metanolo, quindi continuare ad asciugare il campione nel pallone piccolo fino a quando il metanolo non è completamente evaporato. Al termine, pesare il residuo del campione con una bilancia analitica e registrare la massa. Sciogliere l'estratto vegetale in DMSO a una concentrazione di 0,1 grammi di estratto in due millilitri di DMSO e agitarlo fino a quando non si omogeneizza.

Il DMSO non è tossico di per sé, ma è un veicolo che consente ad altre sostanze di attraversare le membrane. Dal momento che non sappiamo se le nostre piante contengono sostanze chimiche tossiche, tutte vengono trattate come se fossero pericolose. Non lasciare che la soluzione tocchi la pelle, sostituire i guanti se contaminati e indossare scarpe spesse e chiuse e camici da laboratorio.

Conservare il campione a quattro gradi Celsius in fiale di vetro ambrato fino al momento dell'uso. Agitare i campioni, quindi aggiungere quattro microlitri di ciascun campione a 496 microlitri di terreno di vagliatura composto per ottenere una soluzione di DMSO allo 0,8%. Disinfettare la superficie esterna di una provetta di terreno di recupero cellulare preriscaldata con etanolo al 70% e trasferire 10 millilitri di terreno in una provetta di cellule reporter congelate per scongelarle.

Chiudere il tubo delle cellule reporter e metterlo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 5-10 minuti. Dopo aver recuperato le cellule dal bagnomaria, capovolgere delicatamente la provetta più volte per rompere gli aggregati di cellule e produrre una sospensione omogenea, quindi pulire la superficie della provetta con etanolo al 70%. Utilizzare una pipetta multicanale per erogare 100 microlitri di sospensione di cellule reporter in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti, quindi erogare 100 microlitri di campioni in triplicato nei pozzetti appropriati.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 22-24 ore. Poco prima della fine dell'incubazione della piastra, rimuovere il substrato di rivelazione e il tampone di rivelazione dal frigorifero e posizionarli in un'area con scarsa illuminazione fino a quando non si sono equilibrati a temperatura ambiente, quindi capovolgere delicatamente ciascuna provetta per miscelare le soluzioni. Immediatamente prima del completamento dell'incubazione su piastra, versare l'intero contenuto del tampone di rilevazione nella provetta del substrato di rilevazione per creare il reagente di rilevazione della luciferasi.

Mescolare delicatamente il tubo in modo da non produrre schiuma. Gettare il contenuto della piastra del campione in un contenitore per rifiuti inappropriato e picchiettarlo delicatamente su un tovagliolo di carta assorbente pulito per rimuovere le ultime goccioline dai pozzetti. Aggiungere 100 microlitri di reagente per la rilevazione della luciferasi a ciascun pozzetto e lasciare riposare la piastra del saggio a temperatura ambiente per 15 minuti, quindi quantificare la luminescenza utilizzando un luminometro a 96 pozzetti.

22 estratti di frutta e verdura che si trovano comunemente nelle diete umane sono stati sottoposti a screening per la presenza di composti estrogenici. L'attività estrogenica si presenta in modo qualitativo ordinale di attività alta, media, bassa o assente. La soia biologica e non biologica è stata sottoposta a screening ad alti livelli di attività, mentre tutti gli altri prodotti ortofrutticoli non hanno registrato alcuna attività.

Confrontando i risultati della soia con la curva standard si nota anche che hanno alti livelli di attività estrogenica a questa concentrazione. L'estratto di soia, una nota potente fonte di isoflavoni, daidzeina e genisteina, è stato ulteriormente utilizzato per determinare la diluizione producendo un segnale del 50% al massimo. Questo estratto richiede una diluizione 422 volte superiore per produrre metà del segnale del nostro protocollo di diluizione standard.

I campioni identificati con attività potrebbero essere inviati per l'analisi mediante spettrometria di massa per identificare le sostanze chimiche attive. Utilizzando un metodo antagonista, potremmo anche determinare se il cibo vegetale contiene sostanze chimiche che riducono il legame e l'attività degli estrogeni endogeni. Questa tecnica ci consente di approfondire la nostra comprensione di quanto siano prevalenti gli alimenti estrogenici nelle diete dei primati, nonché di come il consumo di fitoestrogeni influenzi la fisiologia e il comportamento quando il test è combinato con le analisi degli ormoni fecali e i dati sul campo.