Modello di sistema autonomo translaminare per la modulazione della pressione intraoculare e intracranica nei segmenti posteriori del donatore umano

Questo nuovo sistema autonomo translaminare oculare utilizza il segmento posteriore umano per regolare in modo indipendente le pressioni intraoculari e intracraniche per generare un gradiente di pressione translaminare. Il modello TAS consente la valutazione della pressione intracranica umana in un modo ex vivo, preclinico che in precedenza non poteva essere studiato. Questo modello potrebbe potenzialmente essere utilizzato per studiare malattie come il glaucoma, le lesioni cerebrali traumatiche, l'ipertensione intracranica idiopatica e la sindrome neuro-oculare associata al volo spaziale.

Per impostare le siringhe di afflusso, caricare una siringa da 30 millilitri con 30 millilitri del liquido di perfusione di interesse e collegare un rubinetto di arresto a tre vie alla siringa. Collegare un filtro idrofilo da 0,22 micrometri al rubinetto di arresto e collegare un adattatore per tronchetto luer calibro 15 al filtro idrofilo da 0,22 micrometri. Dopo aver rimosso le bolle d'aria dalla siringa, collegare il tubo all'adattatore del tronchetto luer e chiudere la porta laterale del rubinetto di arresto con un tappo di blocco universale non ventilato.

Dopo aver impostato una seconda siringa di afflusso come appena dimostrato, etichettare un canale della siringa un ICP e etichettare l'altra siringa del canale due IOP. Quindi impostare le siringhe di deflusso come appena dimostrato, ma senza caricare le siringhe con il mezzo di infusione. Per preparare un campione di globo oculare umano intero, rimuovere la guaina del nervo ottico e rimuovere l'umor vitreo dal segmento posteriore.

Per garantire un buon adattamento alla cupola rotonda della camera IOP, tagliare la sclera aggiuntiva dal segmento posteriore, se necessario, e utilizzare una pinza per garantire che la retina sia distribuita uniformemente sulla parte posteriore umana del segmento. Quindi posizionare il segmento nella camera IOP del TAS sopra la cupola rotonda con il nervo ottico rivolto verso l'alto e utilizzare un O-ring in resina epossidica e quattro viti per sigillare il segmento posteriore. Per configurare la camera IOP, inserire il tubo nelle porte di ingresso e uscita della camera e inserire la siringa di afflusso IOP nella porta di ingresso.

Inserire la siringa di deflusso IOP vuota nella porta di uscita e utilizzare il metodo push/pull per infondere lentamente il mezzo di perfusione nella porta di afflusso per riempire la conchiglia oculare posteriore, estraendo contemporaneamente lentamente il mezzo di perfusione attraverso la siringa di deflusso per rimuovere eventuali bolle d'aria dalle linee. Una volta che entrambi i tubi di ingresso e di uscita sono privi di bolle d'aria, arrestare l'infusione e bloccare i rubinetti di arresto in posizione off. Rimuovere la siringa dall'IOP nel gruppo filtro della porta e riempire nuovamente la siringa con altri 30 millimetri di terreno, quindi reinserire la siringa nel gruppo filtro.

Per impostare la camera ICP, posizionare la camera sul retro del segmento posteriore, facendo attenzione che il nervo ottico si trovi all'interno della camera superiore, e sigillare la camera superiore con quattro viti, quindi inserire il tubo nelle porte di ingresso e di uscita della camera ICP, la siringa di ingresso ICP nella porta di ingresso, e la siringa di deflusso ICP vuota nella porta di uscita per lavare il sistema con il fluido come appena dimostrato. Per configurare il sistema di registrazione dati, accendere la fonte di alimentazione a otto canali e il computer e avviare il software di acquisizione dati. Selezionare File e Nuovo, quindi selezionare Impostazioni configurazione e canale.

Selezionare tre canali e rinominarli come indicato. Selezionare due millivolt per l'intervallo su tutti i canali e nella colonna Calcolo, selezionare Nessun calcolo per i canali uno e due. Selezionare Aritmetica per il canale tre Nella finestra Formula, in Canali, selezionare Canale 2.

In Funzione selezionare Matematica e Meno e in Canali selezionare Canale 1. Per impostare e calibrare i trasduttori di pressione idrostatica, collegare i trasduttori di pressione idrostatica alle linee del trasduttore collegate all'amplificatore a ponte multicanale e collegare una siringa vuota da 30 millilitri alla porta laterale del trasduttore di pressione ICP a canale uno. Collegare uno sfigmomanometro alla parte inferiore del trasduttore di pressione ICP del canale e fare clic sulla freccia accanto al tempo di campionamento per impostare la velocità di campionamento su 100.

Selezionare Bridge Amp, Filtro di rete e Zero e attendere che il sistema si azzeri, facendo attenzione a non spostare il trasduttore di pressione. Quindi, pizzicare le linguette bianche del trasduttore di pressione e spingere l'aria attraverso il trasduttore fino a ottenere 40 millimetri di mercurio sullo sfigmomanometro, quindi rilasciare le linguette bianche e rimuovere la siringa e lo sfigmomanometro. Nella pagina Conversione unità selezionare meno ed evidenziare il plateau più alto per indicare 40 millimetri di mercurio.

Fare clic sulla freccia per 0,1, immettere 100 ed evidenziare l'altopiano più basso per indicare zero millimetri di mercurio. Fare clic sulla freccia per 0,2, immettere zero, selezionare i millimetri di mercurio per le unità e fare clic su OK. Nella finestra Bridge Amp, fare clic su OK e calibrare i trasduttori di pressione idrostatica per la IOP del canale due come appena dimostrato, utilizzando 100 millimetri di mercurio per il plateau più alto e zero per il plateau più basso.

Per collegare l'unità del segmento posteriore TAS al sistema di acquisizione dati, posizionare l'unità del segmento posteriore TAS in un incubatore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, e collegare il tubo ICP dalla porta di uscita del trasduttore di pressione ICP del canale uno. Collegare il tubo IOP dalla porta di uscita al trasduttore di pressione IOP a due canali. Nella pagina Visualizzazione grafico, selezionare Avvia campionamento e impostare la velocità di campionamento su Lenta e un minuto.

Quindi regolare le siringhe sul supporto ad anello verso l'alto o verso il basso per regolare le pressioni ICP e IOP in base ai requisiti del protocollo, oppure posizionarle sulle pompe di perfusione per regolare la pressione. In questa analisi rappresentativa, il mantenimento dei differenziali di pressione normali medi in entrambe le camere è stato testato attraverso vari parametri delle condizioni IOP e ICP. Per garantire la vitalità del tessuto, il terreno nel tessuto è stato sostituito ogni 48 ore.

Aumenti minimi della pressione si sono verificati al momento dello scambio del mezzo e non hanno influenzato la vitalità o la morfologia della testa del nervo ottico, come osservato dall'analisi immunoistochimica e dall'espressione del collagene IV nei giorni 14 e 30 dell'esperimento. L'aumento della IOP o la diminuzione dell'ICP in vari punti temporali consente il mantenimento di un intervallo di gradiente di pressione translaminare elevato per sette giorni. A sette giorni di elevato gradiente di pressione translaminare, sono stati osservati coppettazione e ispessimento nei segmenti posteriori e l'espressione del collagene IV mostra fasci ispessiti con un aumento dell'espressione del segnale durante il periodo sperimentale.

L'imaging di fase rivela cellule gangliari retiniche sane all'interno dello strato di cellule gangliari senza coppettazione nei segmenti di controllo, mentre le immagini provenienti da colture con gradiente di pressione translaminare elevato mostrano un'estesa coppettazione senza cellule gangliari retiniche rimaste all'interno dello strato di fibre nervose retiniche e un aumento del rimodellamento della matrice extracellulare. Questa tecnica consentirà ai ricercatori di studiare efficacemente i paradigmi delle malattie biomeccaniche e di scoprire la pressione translaminare mirata alla patogenesi molecolare nell'occhio umano.