Analisi della citometria del flusso di sottoinsiemi di cellule immunitarie all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei nodi linfociti e del tessuto sinoviale in un modello di osteoartrite

Il nostro protocollo consente l'identificazione dettagliata e l'analisi di monociti e macrofagi e cellule T e dei loro sottoinsiemi rilevanti all'interno dei neuroni e dell'ovio e di vari altri tessuti del sistema immunitario. La nostra tecnica facilita il raccolto affidabile di cellule immunitarie della vita dal sinovio e da altri tessuti rilevanti per una caratterizzazione completa della risposta immunitaria osteoartritica. Per l'isolamento dei tessuti di interesse da un topo modello di osteoartrite, con il topo in posizione supina, pulire il torace, l'addome e le gambe con il 70% di etanolo.

Utilizzare le forbici per aprire attentamente la pelle lungo la linea mediana dell'addome lasciando intatta la cavità addominale. E tirare delicatamente la pelle sul lato destro dell'animale lontano dal muscolo sottostante, lasciando il tessuto adiposo sottocutaneo attaccato alla pelle. Posizionare il mouse sotto un microscopio sezionante e utilizzare due forcelle sottili curve per stuzzicare delicatamente il tessuto adiposo situato alla coscia.

Dopo aver identificato i tre vasi trasversali, utilizzare le forcep di sezionamento fine per rimuovere il linfonodo inguinale situato all'intersezione dei vasi, facendo attenzione a non rompersi la capsula. Utilizzare le forcep per rimuovere il grasso rimanente dalla superficie del linfonodo e aprire la cavità addominale. Se non è possibile vedere grasso rimanente, posizionare immediatamente il linfonodo in una piastra di pozzo precedentemente preparata ed etichettata piena di 0,5 millilitri di supporti RPMI.

D'ora in poi, aprire la cavità addominale. Utilizzare forbici fini per asportare la milza ed estrarre delicatamente l'intestino per esporre l'aorta e la sua biforcazione. D'ora in poi, posizionare immediatamente la milza in un sei ben riprodotti, precedentemente preparati ed etichettati, riempiti con 0,5 millilitri di supporti RPMI.

Rimuovere il linfonodo iliaco situato nel segmento terminale dell'aorta addominale e l'origine dell'arteria iliaca comune e rimuovere con cura la pelle da entrambi gli arti posteriori. Posizionare immediatamente il linfonodo in una piastra di sei piastre precedentemente preparata ed etichettata con 0,5 millilitri di mezzi RPMI che raggruppano tutti i linfonodi di due animali. Usando forbici fini o un bisturi pulire il femore sinistro del tessuto muscolare attaccato e scollegare con cura sia il soffocamento che l'articolazione dell'anca, lasciando intatto l'intero osso rimuovendo il femore.

Quindi posizionare il femore in una piastra di pozzo precedentemente preparata ed etichettata piena di 0,5 millilitri di supporti RPMI. Identificare il tendine di rotula dell'articolazione soffocante destra e utilizzare forbici fini per rimuovere il tessuto muscolare adiacente prossimale all'articolazione fino a quando non sono esposti circa cinque millilitri del tendine del quadricipite prossimale alla rotula. Tagliare il tendine del quadricipite di circa tre-quattro millimetri prossimale alla rotula per formare un manico e utilizzare forcep fini per allontanare delicatamente la tensione dall'articolazione per esporre i bordi dell'attacco della capsula articolare.

A partire dal femore e muovendosi verso la tibia, utilizzare un bisturi per tagliare con cura lungo i bordi della capsula articolare su entrambi i lati mantenendo una leggera trazione sul tendine del quadricipite. Quando il blocco di tessuto sinoviale è attaccato solo alla tibia, il cuscinetto di grasso intraarticolare dovrebbe essere chiaramente visibile distale alla rotula e può essere delicatamente staccato dall'aspetto articolare e anteriore della Minsky. Quindi, tagliare lungo la parte rimanente della capsula articolare per rimuovere il blocco di tessuto sinoviale e posizionarlo immediatamente in una piastra di pozzo precedentemente preparata ed etichettata piena di 1,5 millilitri di supporti RPMI.

Una volta raccolti tutti i tessuti, posizionare due milza in pool per condizione su un colino cellulare da 70 micrometri in un tubo da 15 millilitri e utilizzare uno stantuffo sterile a tre millilitri per far salire delicatamente i tessuti attraverso il filtro a rete lavando frequentemente il colino con un totale di sei millilitri di mezzo RPMI 1640 integrati con 10%FBS. Sedimentare le cellule mediante centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet in cinque millilitri di lysis puffer di globuli rossi. Dopo cinque minuti, interrompere la reazione con 10 millilitri di PBS e centrifugare le cellule.

Quando non si osservano più globuli rossi, sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di PBS fresco per il conteggio. Per la lavorazione dei linfonodi posizionare tutti e quattro i linfonodi su un filtro cellulare da 70 micrometri in un nuovo tubo da 15 millilitri e utilizzare un nuovo pistone sterile da tre millilitri per stuzzicare delicatamente i linfonodi attraverso la rete in un'unica sospensione cellulare, quindi centrifugare le cellule a 500 volte G per cinque minuti, scartare il supernatante e sospendere il pellet in 500 microlitri di PBS per il conteggio. Per isolare il midollo osseo, utilizzare un pollice di tessuto per afferrare attentamente il femore intatto e utilizzare forbici affilate per tagliare l'estremità stessa del femore prossimale.

Inserire un ago calibro 23 al centro della tacca intercondilare del femore e ruotare l'ago mentre si applica una pressione delicata per praticare un foro nella tacca. Cambiando l'ago se necessario, sciacquare il contenuto osseo con sei millilitri di RPMI integrati con 10%FBS su un filtro cellulare da 70 micrometri su un nuovo tubo da 15 millilitri e utilizzare un nuovo pistone per siringhe da tre millilitri per premere delicatamente il midollo osseo attraverso la rete. Di seguito, eseguire il passaggio RBC come dimostrato per la milza.

Quando non si osservano più globuli rossi, sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di PBS fresco per il conteggio. Per la lavorazione del tessuto sinoviale utilizzare forbici chirurgiche fini per dadire i due blocchi di tessuto sinoviale in piccoli pezzi e trasferire i campioni in un nuovo tubo da 15 millilitri. Risciacquare il contenitore di raccolta con 500 microlitri di mezzo per raccogliere eventuali cellule e tessuti sinoviali rimanenti e tirare il lavaggio nel tubo di raccolta del campione.

Successivamente, aggiungere un volume sufficiente di enzima per ottenere in un'unità per millilitro la concentrazione finale e digerire il campione di tessuto sinoviale a 37 gradi Celsius in un'incubatrice per due ore di un rotatore. Garantire un movimento sufficiente quando si posizionano i tubi nel rotatore. Al termine dell'incubazione, interrompere la digestione con otto millilitri di RPMI integrati con 10%FBS e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un nuovo tubo da 15 millilitri.

Risciacquare il vecchio tubo da 15 millilitri con cinque millilitri di mezzo e utilizzarlo per lavare il filtro. Quindi, sedimentare le cellule mediante centrifugazione e rimosogliere il pellet in 500 microlitri di PBS per il conteggio. Per eseguire la colorazione di vitalità delle cellule immunitarie isolate, aggiungere cinque volte 10 alle cinque cellule di ogni sospensione cellulare ai pozzi appropriati di due diverse piastre 96 ben u-bottom e raccogliere le cellule sul fondo di ogni pozzo.

Includere sempre come controlli negativi sufficienti cellule non contaminate di ogni tipo di tessuto. Lavare le celle con 200 microlitri di PBS e sospendere di nuovo i pellet in 100 microlitri di cella in colorante reattivo amina permeante per pozzo per un'incubazione di 15 minuti a quattro gradi Celsius protetti dalla luce. Al termine dell'incubazione lavare le cellule due volte in 200 microlitri di tampone FACS per lavaggio e sospendere di nuovo ogni pellet in 100 microlitri dell'anticorpo appropriato di interesse o cocktail di controllo.

Se sia la colorazione intra che extracellulare viene condotta nello stesso modo, eseguire ora il passaggio di colorazione extracellulare. Dopo 30 minuti di incubazione a quattro gradi Celsius protetti dalla luce lavare le cellule due volte con 200 microlitri di tampone FACS per pozzo e sospendere nuovamente le cellule e la piastra del pannello del sottoinsieme monocito in 250 microlitri di tampone FACS integrati con un EDTA millimolare. Eseguire questo passaggio solo se non è pianificata alcuna colorazione intracellulare, altrimenti passare all'aspetto di colorazione intracellulare del protocollo.

Quindi, trasferire ogni campione di sottoinsieme di monociti nell'appropriato tubo FACS corrispondente su ghiaccio protetto dalla luce. Per la colorazione intercellulare delle celle del pannello del sottoinsieme a cellule T, sospendere di nuovo i pellet in 200 microlitri di tampone di fissaggio da un kit di fissazione e permeabilizzazione appropriato per un'incubazione di 40 minuti a quattro gradi Celsius protetti dalla luce. Al termine dell'incubazione lavare le cellule due volte con 200 microlitri di tampone di lavaggio permeabilizzazione e sospendere di nuovo i pellet in 100 microlitri dell'anticorpo appropriato di interesse o controllare il cocktail per un'incubazione di 40 minuti a quattro gradi Celsius protetti dalla luce.

Quindi, lavare le cellule due volte in 200 microlitri di tampone di lavaggio permeabilizzazione per lavaggio. E sospendere di nuovo le celle in 250 microlitri di FACS più tampone EDTA prima di trasferire i campioni negli appropriati tubi FACS corrispondenti su ghiaccio protetto dalla luce. Qui, si può osservare la strategia gerarchica di gating per il pannello del sottoinsieme monocito sulle cellule immunitarie raccolte dal midollo osseo degli animali trattati con DMM.

I troll non macchiati possono essere usati per determinare i veri negativi per la macchia viva morta e le porte possono essere regolate ogni volta che l'esperimento viene condotto secondo necessità. In questa analisi rappresentativa, le cellule immunitarie sono state isolate dai tessuti sinoviali e macchiate con marcatori di superficie extracellulari, sei settimane dopo l'intervento chirurgico di DMM o finto controllo. Una percentuale più elevata di macrofagi Ly-SC positivi MHC2 negativi e M2 si osserva negli animali trattati con DMM rispetto alle popolazioni cellulari osservate nei topi chirurgici fittizi.

Qui, si può osservare la strategia gerarchica di gating per il pannello extra e intracellulare delle cellule T sulle cellule immunitarie isolate dalla milza di animali trattati con DMM. Una percentuale più elevata di cellule TH1 si osserva nei linfonodi e nei tessuti sinoviali degli animali DMM, nonché un numero maggiore di cellule regolatorie T e cellule TH17. Per garantire l'acquisizione di campioni di alta qualità, i tessuti devono essere raccolti in modo rapido, meticoloso e coerente.

Una volta isolate le cellule immunitarie, possono essere condotte altre analisi a valle come RTPCR, coltura cellulare e riposo sul sangue per far luce sui processi molecolari di interesse.