Name: Analisi della citometria del flusso di sottoinsiemi di cellule immunitarie allinterno della milza murina, del midollo osseo, dei nodi linfociti e del tessuto sinoviale in un modello di osteoartrite (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Impara la citometria a flusso per identificare sottoinsiemi di cellule immunitarie nella milza, nel midollo osseo, nei linfonodi e nel tessuto sinoviale di modelli murini di osteoartrite.

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Ringraziamo Andrew Lim, Ph.D. e Giles Best, Ph.D. per il loro aiuto nella creazione del citometro di flusso. Questo progetto è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) assegnata alla PH.

<ol><li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology%2C+treatment%2C+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).</li>
<li>Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+in+Osteoarthritis%3A+Alterations+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond.</a> Frontiers in Immunology. 8, 356(2017).</li>
<li>Woolf, A. D., Pfleger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+major+musculoskeletal+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Burden of major musculoskeletal conditions.</a> Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).</li>
<li>Little, C. B., Hunter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-traumatic+osteoarthritis%3A+from+mouse+models+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials.</a> Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).</li>
<li>Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+post-traumatic+OA+with+a+view+to+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research%3A+Clinical+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention.</a> Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).</li>
<li>Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+knee+injuries+and+knee+osteoarthritis%3A+a+meta-analysis+of+observational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).</li>
<li>Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+subsets+in+osteoarthritis+versus+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Egyptian+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis.</a> Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).</li>
<li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+accumulation+of+activated+Th1+cells+not+only+in+rheumatoid+arthritis+but+also+in+osteoarthritis+joints%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints.</a> Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).</li>
<li>Sakkas, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+and+T-cell+cytokine+transcripts+in+the+synovial+membrane+in+patients+with+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+and+Diagnostics+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis.</a> Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).</li>
<li>Guo, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+CD%284%29%28%2B%29+CD%282%29%285%29%28%2B%29+Foxp%283%29%28%2B%29+Treg+with+the+recovery+of+joint+function+after+total+knee+replacement+in+rats+with+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Research%22%5BJournal%5D)">Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis.</a> Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).</li>
<li>Moradi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29%2FhighCD127low%2F%28-%29+regulatory+T+cells+are+enriched+in+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis+joints--analysis+of+frequency+and+phenotype+in+synovial+membrane%2C+synovial+fluid+and+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood.</a> Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97(2014).</li>
<li>Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cellular+infiltrate+in+inflammatory+synovia+of+osteoarthritic+knees%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+macrophage+M1+polarisation+exacerbates+experimental+osteoarthritis+partially+through+R-spondin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).</li>
<li>Culemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+renewing+resident+synovial+macrophages+provide+a+protective+barrier+for+the+joint%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint.</a> Nature. 572, 670-675 (2019).</li>
<li>Mocellin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+immune+cell+density+and+cytokine+gene+profile+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).</li>
<li>Ward, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+markers+for+the+rodent+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical markers for the rodent immune system.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).</li>
<li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology%2C+treatment%2C+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).</li>
<li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+%28DMM%29+model+of+osteoarthritis+in+the+129%2FSvEv+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li>
<li>Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Staining+and+Flow+Cytometry+to+Identify+Lymphocyte+Subsets+within+Murine+Aorta%2C+Kidney+and+Lymph+Nodes+in+a+Model+of+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55266(2017).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Protocol+for+the+Comprehensive+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+in+Normal+and+Inflamed+Murine+Non-Lymphoid+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).</li>
<li>Lorenz, J., Grassel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+osteoarthritis+models+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental osteoarthritis models in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).</li>
<li>Christiansen, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+mouse+models+of+post-traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+alteration+of+lymphatic+vessels+in+knee+joints+of+normal+and+osteoarthritic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice.</a> Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).</li>
<li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+mapping+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Lymph node mapping in the mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+culture+and+isolation+of+murine+synovial+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts.</a> Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).</li>
<li>Belluzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Infrapatellar+Fat+Pad+and+Synovial+Membrane+to+Knee+Osteoarthritis+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain.</a> BioMed Research International. 2019, 18(2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I metodi descritti in questo protocollo sono stati progettati e testati per identificare in modo affidabile vari sottoinsiemi sia da monociti/macrofagi che da cellule T all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei linfonodi e del tessuto sinoviale in un modello murino di osteoartrite (OA). L'attuale protocollo può essere facilmente modificato per studiare diversi tipi di tessuto, o altri tipi di cellule scambiando anticorpi, e può essere utilizzato per modelli murini alternativi di OA. Quando si testano altri t...

L'osteoartrite (OA) è una malattia debilitante e dolorosa che coinvolge varie patologie di tutti i tessuti associati all'articolazione1. Colpisce circa il 3,8% della popolazione mondiale2, OA è una delle malattie muscolo-scheletriche più diffuse ed è quello di diventare la4a causa leader di disabilità in tutto il mondo entro il 20203. L'OA post-traumatico si verifica dopo un infortunio articolare e rappresenta almeno il 12% di tutto l'OA e fino al 25% di OA in articolazioni suscettibili comeil ginocchio 4,5. Inoltre, lesioni articolari aumenta il rischio di vita di OA di più di cinque volte6. Non tutti gli infortuni con instabilità apparentemente simile andranno a sviluppare OA, e quindi la definizione dei fattori che guidano il rischio di OA a lungo termine rimane difficile. È fondamentale per sviluppare trattamenti efficaci per prevenire e/o trattare l'OA post-traumatico, per indagare e definire meglio la patologia, le cause e i meccanismi specifici della lesione che predispongono all'OA1.
OA e la sua distruzione della cartilagine che definisce è stata precedentemente attribuita interamente allo stress meccanico e, pertanto, OA è stata considerata una malattia non infiammatoria2. Tuttavia, studi più recenti hanno mostrato un'infiltrazione infiammatoria delle membrane sinoviali e un aumento delle cellule infiammatorie nel tessuto sinoviale nei pazienti con OA rispetto ai controllisani 2, facendo luce su un componente infiammatorio come potenziale forza motrice in OA. Ulteriori studi hanno indicato che le anomalie sia nel profilo delle cellule T CD4 che in quello del CD8, nonché nei monociti/macrofagi del sistema immunitario innato possono contribuire alla patogenesi di OA2,7. Indagini dettagliate su queste anomalie hanno rivelato ruoli rilevanti per vari sottoinsiemi di cellule T2, come Th18, Th29, Th178 e T regulatory (Treg)popolazioni 10,11. Nonostante questa prova convincente, la relazione causale tra l'alterazione delle risposte delle cellule T e lo sviluppo e la progressione dell'OA è ancora sconosciuta2.
Oltre a specifiche cellule T che hanno un ruolo nell'OA, studi recenti suggeriscono che macrofagi polarizzati/attivati in modo differenziale possono essere associati alla patogenesi dell'OA12. In particolare, i macrofagi provenienti dai monociti del sangue si accumulano nel sinovio e si polarizzano in macrofagi attivati in modo classico (M1) o in alternativa macrofagi attivati (M2) durante lo sviluppo dell'OA, implicando una correlazione tra macrofagi derivati da monociti e OA13. Al contrario, alcuni sottoinsiemi di macrofagi popolano gli organi precocemente durante lo sviluppo e si autosufficiano il loro numero in una materia indipendentemonocita 14. Recentemente, una funzione di protezione articolare mediata da una barriera a giunzione stretta è stata mostrata per questi macrofagi residenti con tessuto sinoviale (STRMs)14. Questi risultati indicano che le anomalie in particolare i sottoinsiemi di macrofagio possono svolgere un ruolo cruciale durante lo sviluppo dell'OA. Tuttavia, le interazioni tra questa risposta cellulare infiammatoria e i cambiamenti strutturali nell'articolazione successiva al trauma sono sconosciute.
Storicamente, l'analisi delle cellule immunitarie nel tessuto sinoviale era limitata all'immunohistochimica (IHC) o all'espressione dell'mRNA mediante reazione a catena di polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR)si avvicina 15,16. Tuttavia, sia IHC che RT-PCR non hanno la capacità di identificare più tipi di cellule diverse e i loro sottoinsiemi contemporaneamente, limitando così l'applicabilità di questi metodi. Inoltre, L'IHC è limitato all'analisi di piccoli campioni di tessuto e può perdere accumuli di cellule infiammatorie focali. Nel corso degli ultimi anni, è stata sviluppata una miriade di marcatori di superficie per vari tipi di cellule, e sottoinsiemi di cellule immunitarie possono ora essere identificati in modo affidabile da combinazioni distinte di questi marcatori. A causa del costante progresso tecnico, i citometri di flusso sono ora in grado di identificare una moltitudine di diversi fluorocromi che consentono contemporaneamente l'analisi di grandi pannelli anticorpali multicolore.
La citometria del flusso fornisce ai ricercatori una potente tecnica che consente l'identificazione simultanea e la quantificazione di una moltitudine di cellule immunitarie e dei loro sottoinsiemi a livello di singola cellula. Abbiamo sviluppato e ottimizzato sia un saggio di colorazione extracellulare per identificare monociti/macrofagi e i loro sottoinsiemi, sia un saggio di colorazione extra/intracellulare per identificare le cellule T e i loro sottoinsiemi all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei linfonodi e del tessuto sinoviale. Ogni fase di questo protocollo è stato ottimizzato e testato con conseguente un saggio altamente riproducibile che può essere utilizzato per altri modelli di mouse OA chirurgici e nonchirurgici 17.

<table><tbody><tr><td>APC anti-topo CD194 (CCR4)</td><td>BioLegend</td><td>131212</td><td>T-Cell Panel</td></tr><tr><td>Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst</td><td>BD</td><td>566385</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi Fixable Viability Stain 510, 100 &; g</td><td>BD</td><td>564406</td> Tinta di vitalità fissabile <td>con pannello T-Cell</td></tr><tr><td>510, 100 & micro; g</td><td>BD</td><td>564406</td><td>Pannello di monociti</td></tr><tr><td>Liberase,</td> enzima <td>Roche</td><td>5401127001</td> per <td>la ricerca per il tessuto sinoviale</td></tr><tr><td>Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 &; g</td><td>BD</td><td>564985</td><td>Pannello Monociti</td></tr><tr><td>Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>562454</td><td>Pannello Monocita</td></tr><tr><td>Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>742274</td><td>Pannello Cellule</td></tr><tr><td>T Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 & micro; g</td><td>BD</td><td>565250</td><td>Pannello monocita</td></tr><tr><td>Ms CD25 BV605 PC61, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>563061</td><td>Pannello Cellule T</td></tr><tr><td>Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>557596</td><td>Pannello Cellule T</td></tr><tr><td>Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>552775</td><td>Pannello Cellule T</td></tr><tr><td>Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 &; micro; g</td><td>BD</td><td>565480</td><td>Pannello Cellule</td></tr><tr><td>T Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 &; g</td><td>BD</td><td>565261</td><td>Pannello Cellule</td></tr><tr><td>T Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>740664</td><td>Pannello T</td></tr><tr><td>Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>563687</td><td>Pannello Monociti</td></tr><tr><td>Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>563332</td><td>Pannello T</td></tr><tr><td>Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 &; g</td><td>BD</td><td>565411</td><td>Pannello Monociti</td></tr><tr><td>Ms Foxp3 PE MF23, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>560408</td><td>Pannello T</td></tr><tr><td>Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>563414</td><td>Pannello Monociti</td></tr><tr><td>Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>560593</td><td>Pannello Monociti</td></tr><tr><td>Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>560600</td><td>Pannello monocita</td></tr><tr><td>Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>564143</td><td>Pannello T</td></tr><tr><td>Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>562894</td><td>Pannello Cellule T</td></tr><tr><td>Tampone per lisi di globuli rossi</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Tamponi</td></tr><tr><td>Fattore di trascrizione Set di tamponi 100Tst</td><td>BD</td><td>562574</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi della citometria del flusso di sottoinsiemi di cellule immunitarie all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei nodi linfociti e del tessuto sinoviale in un modello di osteoartrite

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

L'osteoartrite (OA) è una delle malattie muscolo-scheletriche più diffuse, che colpisce i pazienti affetti da dolore e limitazioni fisiche. Prove recenti indicano una potenziale componente infiammatoria della malattia, sia con cellule T che monociti/macrofagi potenzialmente associati alla patogenesi dell'OA. Ulteriori studi postularono un ruolo importante per sottoinsiemi di entrambi i lignaggi delle cellule infiammatorie, come i linfociti di Th1, Th2, Th17 e T-regulatory, e M1, M2 e macrofagi residenti con tessuto sinovi. Tuttavia, l'interazione tra la risposta cellulare infiammatoria sinoviale locale e sistemica e i cambiamenti strutturali nell'articolazione è sconosciuta. Per comprendere appieno il modo in cui le cellule T e i monociti/macrofagi contribuiscono all'OA, è importante essere in grado di identificare quantitativamente queste cellule e i loro sottoinsiemi contemporaneamente nel tessuto sinoviale, negli organi linfatici secondari e sistemicamente (la milza e il midollo osseo). Al giorno d'oggi, i diversi sottoinsiemi di cellule infiammatorie possono essere identificati da una combinazione di marcatori di superficie cellulare che fanno della citometria del flusso multi colore una potente tecnica nello studiare questi processi cellulari. In questo protocollo, descriviamo passi dettagliati per quanto riguarda il raccolto di tessuto sinoviale e organi linfatici secondari, nonché la generazione di sospensioni a singola cellula. Inoltre, presentiamo sia un saggio di colorazione extracellulare per identificare i monociti/macrofagi e i loro sottoinsiemi, sia un saggio di colorazione extra e intracellulare per identificare le cellule T e i loro sottoinsiemi all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei linfonodi e del tessuto sinoviale. Ogni fase di questo protocollo è stata ottimizzata e testata, con conseguente analisi altamente riproducibile che può essere utilizzata per altri modelli di mouse OA chirurgici e non chirurgici.

Di seguito sono descritti i risultati rappresentativi del pannello Sottoinsieme monocito e del pannello Sottoinsieme di celle t.
La figura 1 illustra la strategia gerarchica di gating per il pannello del sottoinsieme di monociti sulle cellule immunitarie raccolte dal midollo osseo degli animali trattati con DMM. La stessa strategia è stata utilizzata e verificata in tutti gli altri tipi di tessuto. Durante l'impostazione dell'esperimento, è stata determinata la te...

Qui, descriviamo un protocollo di citometria di flusso dettagliato e riproducibile per identificare sottoinsiemi monociti/macrofamiglia e t-cell utilizzando saggi di colorazione extra e intracellulare all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei linfonodi e del tessuto sinoviale, utilizzando un modello chirurgico stabilito di osteoartrite murina.

Analisi della citometria del flusso di sottoinsiemi di cellule immunitarie all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei nodi linfociti e del tessuto sinoviale in un modello di osteoartrite

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Il nostro protocollo consente l'identificazione dettagliata e l'analisi di monociti e macrofagi e cellule T e dei loro sottoinsiemi rilevanti all'interno dei neuroni e dell'ovio e di vari altri tessuti del sistema immunitario. La nostra tecnica facilita il raccolto affidabile di cellule immunitarie della vita dal sinovio e da altri tessuti rilevanti per una caratterizzazione completa della risposta immunitaria osteoartritica. Per l'isolamento dei tessuti di interesse da un topo modello di osteoartrite, con il topo in posizione supina, pulire il torace, l'addome e le gambe con il 70% di etanolo.Utilizzare le forbici per aprire attentamente la pelle lungo la linea mediana dell'addome lasciando intatta la cavità addominale. E tirare delicatamente la pelle sul lato destro dell'animale lontano dal muscolo sottostante, lasciando il tessuto adiposo sottocutaneo attaccato alla pelle. Posizionare il mouse sotto un microscopio sezionante e utilizzare due forcelle sottili curve per stuzzicare delicatamente il tessuto adiposo situato alla coscia.Dopo aver identificato i tre vasi trasversali, utilizzare le forcep di sezionamento fine per rimuovere il linfonodo inguinale situato all'intersezione dei vasi, facendo attenzione a non rompersi la capsula. Utilizzare le forcep per rimuovere il grasso rimanente dalla superficie del linfonodo e aprire la cavità addominale. Se non è possibile vedere grasso rimanente, posizionare immediatamente il linfonodo in una piastra di pozzo precedentemente preparata ed etichettata piena di 0,5 millilitri di supporti RPMI.D'ora in poi, aprire la cavità addominale. Utilizzare forbici fini per asportare la milza ed estrarre delicatamente l'intestino per esporre l'aorta e la sua biforcazione. D'ora in poi, posizionare immediatamente la milza in un sei ben riprodotti, precedentemente preparati ed etichettati, riempiti con 0,5 millilitri di supporti RPMI.Rimuovere il linfonodo iliaco situato nel segmento terminale dell'aorta addominale e l'origine dell'arteria iliaca comune e rimuovere con cura la pelle da entrambi gli arti posteriori. Posizionare immediatamente il linfonodo in una piastra di sei piastre precedentemente preparata ed etichettata con 0,5 millilitri di mezzi RPMI che raggruppano tutti i linfonodi di due animali. Usando forbici fini o un bisturi pulire il femore sinistro del tessuto muscolare attaccato e scollegare con cura sia il soffocamento che l'articolazione dell'anca, lasciando intatto l'intero osso rimuovendo il femore.Quindi posizionare il femore in una piastra di pozzo precedentemente preparata ed etichettata piena di 0,5 millilitri di supporti RPMI. Identificare il tendine di rotula dell'articolazione soffocante destra e utilizzare forbici fini per rimuovere il tessuto muscolare adiacente prossimale all'articolazione fino a quando non sono esposti circa cinque millilitri del tendine del quadricipite prossimale alla rotula. Tagliare il tendine del quadricipite di circa tre-quattro millimetri prossimale alla rotula per formare un manico e utilizzare forcep fini per allontanare delicatamente la tensione dall'articolazione per esporre i bordi dell'attacco della capsula articolare.A partire dal femore e muovendosi verso la tibia, utilizzare un bisturi per tagliare con cura lungo i bordi della capsula articolare su entrambi i lati mantenendo una leggera trazione sul tendine del quadricipite. Quando il blocco di tessuto sinoviale è attaccato solo alla tibia, il cuscinetto di grasso intraarticolare dovrebbe essere chiaramente visibile distale alla rotula e può essere delicatamente staccato dall'aspetto articolare e anteriore della Minsky. Quindi, tagliare lungo la parte rimanente della capsula articolare per rimuovere il blocco di tessuto sinoviale e posizionarlo immediatamente in una piastra di pozzo precedentemente preparata ed etichettata piena di 1,5 millilitri di supporti RPMI.Una volta raccolti tutti i tessuti, posizionare due milza in pool per condizione su un colino cellulare da 70 micrometri in un tubo da 15 millilitri e utilizzare uno stantuffo sterile a tre millilitri per far salire delicatamente i tessuti attraverso il filtro a rete lavando frequentemente il colino con un totale di sei millilitri di mezzo RPMI 1640 integrati con 10%FBS. Sedimentare le cellule mediante centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet in cinque millilitri di lysis puffer di globuli rossi. Dopo cinque minuti, interrompere la reazione con 10 millilitri di PBS e centrifugare le cellule.Quando non si osservano più globuli rossi, sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di PBS fresco per il conteggio. Per la lavorazione dei linfonodi posizionare tutti e quattro i linfonodi su un filtro cellulare da 70 micrometri in un nuovo tubo da 15 millilitri e utilizzare un nuovo pistone sterile da tre millilitri per stuzzicare delicatamente i linfonodi attraverso la rete in un'unica sospensione cellulare, quindi centrifugare le cellule a 500 volte G per cinque minuti, scartare il supernatante e sospendere il pellet in 500 microlitri di PBS per il conteggio. Per isolare il midollo osseo, utilizzare un pollice di tessuto per afferrare attentamente il femore intatto e utilizzare forbici affilate per tagliare l'estremità stessa del femore prossimale.Inserire un ago calibro 23 al centro della tacca intercondilare del femore e ruotare l'ago mentre si applica una pressione delicata per praticare un foro nella tacca. Cambiando l'ago se necessario, sciacquare il contenuto osseo con sei millilitri di RPMI integrati con 10%FBS su un filtro cellulare da 70 micrometri su un nuovo tubo da 15 millilitri e utilizzare un nuovo pistone per siringhe da tre millilitri per premere delicatamente il midollo osseo attraverso la rete. Di seguito, eseguire il passaggio RBC come dimostrato per la milza.Quando non si osservano più globuli rossi, sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di PBS fresco per il conteggio. Per la lavorazione del tessuto sinoviale utilizzare forbici chirurgiche fini per dadire i due blocchi di tessuto sinoviale in piccoli pezzi e trasferire i campioni in un nuovo tubo da 15 millilitri. Risciacquare il contenitore di raccolta con 500 microlitri di mezzo per raccogliere eventuali cellule e tessuti sinoviali rimanenti e tirare il lavaggio nel tubo di raccolta del campione.Successivamente, aggiungere un volume sufficiente di enzima per ottenere in un'unità per millilitro la concentrazione finale e digerire il campione di tessuto sinoviale a 37 gradi Celsius in un'incubatrice per due ore di un rotatore. Garantire un movimento sufficiente quando si posizionano i tubi nel rotatore. Al termine dell'incubazione, interrompere la digestione con otto millilitri di RPMI integrati con 10%FBS e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un nuovo tubo da 15 millilitri.Risciacquare il vecchio tubo da 15 millilitri con cinque millilitri di mezzo e utilizzarlo per lavare il filtro. Quindi, sedimentare le cellule mediante centrifugazione e rimosogliere il pellet in 500 microlitri di PBS per il conteggio. Per eseguire la colorazione di vitalità delle cellule immunitarie isolate, aggiungere cinque volte 10 alle cinque cellule di ogni sospensione cellulare ai pozzi appropriati di due diverse piastre 96 ben u-bottom e raccogliere le cellule sul fondo di ogni pozzo.Includere sempre come controlli negativi sufficienti cellule non contaminate di ogni tipo di tessuto. Lavare le celle con 200 microlitri di PBS e sospendere di nuovo i pellet in 100 microlitri di cella in colorante reattivo amina permeante per pozzo per un'incubazione di 15 minuti a quattro gradi Celsius protetti dalla luce. Al termine dell'incubazione lavare le cellule due volte in 200 microlitri di tampone FACS per lavaggio e sospendere di nuovo ogni pellet in 100 microlitri dell'anticorpo appropriato di interesse o cocktail di controllo.Se sia la colorazione intra che extracellulare viene condotta nello stesso modo, eseguire ora il passaggio di colorazione extracellulare. Dopo 30 minuti di incubazione a quattro gradi Celsius protetti dalla luce lavare le cellule due volte con 200 microlitri di tampone FACS per pozzo e sospendere nuovamente le cellule e la piastra del pannello del sottoinsieme monocito in 250 microlitri di tampone FACS integrati con un EDTA millimolare. Eseguire questo passaggio solo se non è pianificata alcuna colorazione intracellulare, altrimenti passare all'aspetto di colorazione intracellulare del protocollo.Quindi, trasferire ogni campione di sottoinsieme di monociti nell'appropriato tubo FACS corrispondente su ghiaccio protetto dalla luce. Per la colorazione intercellulare delle celle del pannello del sottoinsieme a cellule T, sospendere di nuovo i pellet in 200 microlitri di tampone di fissaggio da un kit di fissazione e permeabilizzazione appropriato per un'incubazione di 40 minuti a quattro gradi Celsius protetti dalla luce. Al termine dell'incubazione lavare le cellule due volte con 200 microlitri di tampone di lavaggio permeabilizzazione e sospendere di nuovo i pellet in 100 microlitri dell'anticorpo appropriato di interesse o controllare il cocktail per un'incubazione di 40 minuti a quattro gradi Celsius protetti dalla luce.Quindi, lavare le cellule due volte in 200 microlitri di tampone di lavaggio permeabilizzazione per lavaggio. E sospendere di nuovo le celle in 250 microlitri di FACS più tampone EDTA prima di trasferire i campioni negli appropriati tubi FACS corrispondenti su ghiaccio protetto dalla luce. Qui, si può osservare la strategia gerarchica di gating per il pannello del sottoinsieme monocito sulle cellule immunitarie raccolte dal midollo osseo degli animali trattati con DMM.I troll non macchiati possono essere usati per determinare i veri negativi per la macchia viva morta e le porte possono essere regolate ogni volta che l'esperimento viene condotto secondo necessità. In questa analisi rappresentativa, le cellule immunitarie sono state isolate dai tessuti sinoviali e macchiate con marcatori di superficie extracellulari, sei settimane dopo l'intervento chirurgico di DMM o finto controllo. Una percentuale più elevata di macrofagi Ly-SC positivi MHC2 negativi e M2 si osserva negli animali trattati con DMM rispetto alle popolazioni cellulari osservate nei topi chirurgici fittizi.Qui, si può osservare la strategia gerarchica di gating per il pannello extra e intracellulare delle cellule T sulle cellule immunitarie isolate dalla milza di animali trattati con DMM. Una percentuale più elevata di cellule TH1 si osserva nei linfonodi e nei tessuti sinoviali degli animali DMM, nonché un numero maggiore di cellule regolatorie T e cellule TH17. Per garantire l'acquisizione di campioni di alta qualità, i tessuti devono essere raccolti in modo rapido, meticoloso e coerente.Una volta isolate le cellule immunitarie, possono essere condotte altre analisi a valle come RTPCR, coltura cellulare e riposo sul sangue per far luce sui processi molecolari di interesse.

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