Induzione di cellule leptomeningeali Modifica tramite iniezione intracisternale

La nostra procedura chirurgica consente l'editing genico specifico delle cellule leptomeningeali per studiarne la funzione in molte condizioni fisiologiche e patologiche come il neurosviluppo e la diffusione della meningite batterica. Per ridurre al minimo i danni durante l'erogazione intracisternale dell'endoxifene, utilizziamo un ago piegato che può essere fissato contro il bordo caudale del cranio per evitare che penetri più in profondità nel tessuto. La procedura può essere utilizzata per sondare il ruolo dei geni che esprimono cellule leptomeningeali attraverso la perdita e il guadagno di esperimenti di funzione.

Può anche essere adottato per tracciare il flusso del fluido cerebrospinale. La dimostrazione visiva di questo metodo garantirà una corretta identificazione del sito di iniezione per l'iniezione intracisternale e la comprensione su come fissare l'ago contro l'osso occipitale. Inizia preparando una siringa Hamilton con un ago smussato calibro 30 per iniezione.

Utilizzare le pinie per piegare l'ago a 30 gradi a tre millimetri dalla punta. Successivamente, diluire l'endoxifene nel 10%DMSO con una concentrazione di un milligrammo per millilitro e riempire la siringa. Anestetizza l'animale nella camera isoflurane.

Quindi regolare il supporto della testa del mouse in modo che il bocchino sia approssimativamente ad un angolo di 30 gradi dalla superficie del tavolo chirurgico e fissare la testa dell'animale sul supporto. Per migliorare l'accessibilità alla cisterna magna, posizionare il corpo dell'animale a circa 30 gradi dalla superficie del tavolo con la testa inclinata verso il basso che stabilirà un angolo di 120 gradi con il resto del corpo ed estenderà la parte posteriore del collo per facilitare l'accesso alla cisterna magna. Una volta che l'animale è posizionato correttamente, applicare un unguento oftalmico, radersi la parte posteriore del collo e sanificare l'area con salviette alcoliche e Betadine.

Utilizzare forbici chirurgiche per fare un'incisione della linea mediana a partire dal livello dell'osso occipitale ed estendendosi posteriormente. Separare delicatamente il tessuto connettivo superficiale e i muscoli del collo tirando lateralmente dalla linea mediana con pinzette a punta fine che esporranno la membrana durale sovrastante la cisterna magna. Posizionare un piccolo separatore chirurgico per consentire la visualizzazione della cisterna magna durante tutta la procedura.

Identificare l'estremità caudale dell'osso occipitale e inserire immediatamente sotto l'ago piegato in precedenza. Una volta perforata la dura, lasciare che la punta piegata dell'ago penetri sotto la superficie tirando delicatamente la siringa verso l'alto e parallelamente al corpo dell'animale, il che garantirà una migliore stabilità. Iniettare lentamente il composto per evitare interferenze con il flusso naturale del liquido cerebrospinale.

Dopo l'iniezione, lasciare riposare l'ago all'interno per un minuto, quindi rimuoverlo con cura con l'aiuto di pini a punta fine. Chiudere la pelle con alcune gocce di adesivo cianoacrilato e applicare l'anestetico locale nel sito di iniezione. Rimuovere l'animale dal supporto e posizionare in una gabbia pulita su una pastiglia riscaldante.

Quindi assicurati di monitorare l'animale fino a quando non riprende conoscenza. Iniezione intracisternale di endoxifene in topi transgenici che esprimono CreER sotto il promotore Cx30, un reporter fluorescente inducibile consente una ricombinazione specifica delle cellule leptomeningeali senza etichettare il vicino Cx30 esprimendo astrociti superficiali e astrociti parenchimali nella corteccia. Questo protocollo di iniezione sfrutta il movimento fisiologico del liquido cerebrospinale in modo che la soluzione di endoxifene sia distribuita in tutto lo spazio subaracnoideo per ricombinare in modo efficiente le cellule leptomeningeali che sovrapano i bulbi olfattivi, la corteccia e il cervelletto.

La soluzione non attraversa la barriera meningea cerebrale o entra in contatto con cellule astrogliali del parenchima rispetto alla somministrazione sistemica attraverso il gavage orale. La ricombinazione delle cellule leptomeningeali dopo iniezione intracisternale è stata identificata attraverso la reattività Pdgfr-alfa mentre gli astrociti superficiali e parenchimali che esprimono Gfap sono rimasti senza etichetta. Quando si tenta questo esperimento, è importante individuare il sito di iniezione per l'erogazione intracisternale.

Questa dimostrazione visiva fornisce il know-how tecnico per eseguire la procedura riducendo al minimo il rischio di danneggiare il tessuto neurale sottostante. Gli studi di ablazione genica possono essere eseguiti con questa tecnica per studiare il ruolo delle cellule leptomeningeali nella corticogenesi e nella regolazione della formazione di liquidi cerebrospinali e per identificare siti aggiuntivi per la diffusione di batteri nello spazio subaracnoideo.