Tracciamento delle gambe completamente automatizzato negli insetti in movimento liberamente utilizzando la segmentazione e il tracciamento delle gambe di apprendimento delle funzionalità (FLLIT)
23 aprile 2020
Descriviamo protocolli dettagliati per l'utilizzo di FLLIT, un metodo di apprendimento automatico completamente automatizzato per il monitoraggio del movimento degli artigli delle gambe in Drosophila melanogaster e altri insetti in movimento libero. Questi protocolli possono essere utilizzati per misurare quantitativamente i sottili movimenti dell'andatura deatrale in mosche di tipo selvatico, mosche mutanti e modelli di mosca di neurodegenerazione.
FLLIT è un algoritmo che calcola le composizioni del corpo e delle gambe di un animale tracciato. E questo è utile per caratterizzare i circuiti che sono alla base sia dei comportamenti normali che di deaeleggio delle malattie. La cosa unica di FLLIT è che non richiede set di dati annotati dall'utente per la formazione ed è quindi completamente automatizzato.
Ma analizza automaticamente anche i dati della traccia producendo una serie di misurazioni dell'andatura, grafici di andatura per la visualizzazione e un video di traccia. A dimostrare la procedura sarà Animesh Banerjee, un collega post-dottorato del mio laboratorio. Prima di iniziare un esperimento, conferma che la stazione di registrazione ha una telecamera ad alta velocità con un palco sopra di essa per tenere la camera dell'arena.
Posizionare le luci a LED a infrarossi nella parte superiore del palco con un diffusore tra la fotocamera e il campione. Circa 40 minuti prima di iniziare la registrazione, trasferire le mosche in un vile vuoto sul ghiaccio per cinque o sette minuti. Mentre le mosche vengono sedate, utilizzare acqua e una salvietta per cancellare l'arena e gli scivoli di vetro della camera e nastro uno degli scivoli di vetro sotto la camera.
Utilizzando un pennello pulito, trasferire una mosca anestetizzata nella camera e fissare la camera con una seconda diapositiva e nastro adesivo. Quindi lasciare che la mosca a camera si acclimati a temperatura ambiente per 15-20 minuti. Per generare video per l'analisi FLLIT, in primo luogo, accendere la fonte di alimentazione e aprire l'applicazione visualizzatore sul sistema informatico collegato.
Modificare la frequenza fotogrammi di registrazione su 1.000 fotogrammi al secondo e impostare la velocità dell'otturatore su un millisecondo. Posizionare la camera con la mosca sull'arena di registrazione e fare clic sul pulsante LIVE. Confermato che la fotocamera è focalizzata sulle punte delle gambe quando la mosca cammina in posizione verticale sul pavimento della camera e fare clic su Registra.
Durante la registrazione, assicurarsi che la mosca cammini in una traiettoria relativamente dritta senza toccare il bordo dell'arena, cammina per almeno tre passi per gamba, non si ferma durante la passeggiata e che la distanza percorsa è l'equivalente di almeno una lunghezza del corpo e mezza. Al termine dell'analisi, fare clic su Registra fatto per interrompere la registrazione e salvare i file in formato mraw o tiff nelle cartelle appropriate. Per installare FLLIT, scaricare prima il programma su qualsiasi sistema operativo.
Estrarre il contenuto del file zip e scaricare set di dati di esempio. Per installare FLLIT in Ubuntu, passate alla directory FLLIT/Compiled e fate clic con il pulsante destro del mouse per selezionare Apri in terminale (Open in Terminal). Scaricate un set di dati di esempio e create un dato di cartella in FLLIT-master/Compiled in cui verranno inserite le cartelle del set di dati.
Installare le librerie di runtime MATLAB in HOME/MCR. Al termine dell'installazione della libreria di runtime MATLAB, rilasciare il comando per assicurarsi che i diritti eseguibili vengano registrati su FLLIT. Immettete quindi il comando per eseguire FLLIT.
Per la segmentazione del video, convertite il file in singoli file TIFF e salvate i file convertiti nella cartella dati FLLIT. Una volta trasferiti tutti i file, eseguire FLLIT. Nella finestra popup, selezionare 0 per eseguire solo la segmentazione delle gambe o selezionare 1 per includere il tracciamento delle gambe con la segmentazione delle gambe.
Selezionare la cartella contenente le immagini TIFF fotogramma per fotogramma del video da tenere traccia e il file di interesse e fare clic su Aggiungi. Quindi fate clic su Fatto (Done) per avviare la segmentazione e il rilevamento del video selezionato. Per verificare l'accuratezza del rilevamento ed eseguire le correzioni di errore, fare clic su Seleziona cartella dati, quindi selezionare la cartella da tenere traccia.
Fate clic su Visualizza tracciamento (View Tracking) e selezionate l'etichettatura per tutte le gambe del primo fotogramma. Se una gamba è etichettata in modo errato ed è necessaria una correzione, fare clic su Sospendi visualizzazione e regola previsione. Nel pannello Gamba da regolare, selezionate la gamba che richiede la correzione e fate doppio clic sulla posizione corretta di questa gamba nella finestra dell'immagine.
Quindi fare clic su Salva ed esci. Per elaborare i dati segmentati e tracciati, fare clic su Processo dati. Innanzitutto, calcola il campo visivo effettivo del video acquisito in modo che i parametri del gate possano essere misurati.
Nella finestra popup immettere il numero di fotogrammi al secondo in cui il video viene registrato e immettere il campo visivo calcolato in millimetri. Per accedere ai risultati del rilevamento, aprire i risultati e tenere traccia delle cartelle. Per generare un video della mosca tracciata, selezionare Crea video.
Dopo la segmentazione delle gambe, il tracciamento e l'elaborazione dei dati, FLLIT genera automaticamente dati grezzi per le posizioni del corpo e ogni artiglio della gamba, 20 parametri di andatura e grafici di accompagnamento e video tracciati. SCA3 è caratterizzati da un'andatura atassica con veering del corpo, posizionamento irregolare del piede e brevi gradini di in agguato. Per caratterizzare l'andatura delle mosche SCA3 mutanti e per indagare se mostrano un'andatura simile a quella dei pazienti umani, è possibile analizzare i parametri di andatura pertinenti generati da FLLIT.
Le mosche SCA3-Q84 mostrano più curve, posizionamento irregolare del piede come mostrato da una bassa regolarità ingombro e aumento della sovrapposizione del dominio delle gambe, domini di gambe ingranditi in lunghezza e area e ridotta lunghezza del passo. FLLIT può anche generare un video che mostra la mosca tracciata e le gambe nelle viste centrate sull'arena e centrato sul corpo, la traiettoria del corpo, la direzione di direzione e gli spostamenti verticali e laterali di ogni gamba. Rispetto alle mosche SCA3-Q27, le mosche SCA3-Q84 mostrano domini di gambe intersecanti irregolari di diverse dimensioni, indicativi di un'andatura atassica in agguato.
I dati grezzi per le posizioni degli artigli del corpo e delle gambe possono essere ulteriormente analizzati per specifici movimenti di interesse. Ad esempio, l'uso di FLLIT ha permesso al nostro gruppo di determinare che i fenotipi rigidi visualizzati dai modelli Drosophila del morbo di Parkinson sono causati dalla disfunzione neuronale dopaminergica.
Panoramica
Questo articolo presenta protocolli per FLLIT, un metodo di apprendimento automatico automatizzato per il tracciamento dei movimenti degli artigli delle zampe in Drosophila melanogaster e altri insetti. Il metodo misura quantitativamente movimenti sottili dell'andatura in vari modelli di moscerini, inclusi quelli con neurodegenerazione.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Analisi del Comportamento
- Apprendimento Automatico
Sfondo
- FLLIT è un algoritmo completamente automatizzato per il tracciamento dei movimenti animali.
- Non richiede set di dati annotati dall'utente per l'addestramento.
- Il metodo fornisce misurazioni dettagliate della deambulazione e relative visualizzazioni.
- È applicabile sia a moscerini di tipo selvatico che mutanti.
Scopo dello studio
- Analizzare quantitativamente l'andatura della camminata in Drosophila.
- Studiare le anomalie dell'andatura in modelli di neurodegenerazione.
- Fornire un protocollo standardizzato ai ricercatori.
Metodi Utilizzati
- Preparazione del sistema di registrazione con telecamere ad alta velocità.
- Utilizzo di luci LED a infrarossi per una visibilità ottimale.
- Analisi automatizzata dei video per il tracciamento delle zampe e la misurazione dell'andatura.
- Elaborazione dei dati per generare parametri relativi all'andatura e visualizzazioni.
Risultati principali
- FLLIT genera dati grezzi relativi alle posizioni del corpo e delle zampe.
- Identificazione di anomalie della deambulazione in moscerini mutanti per SCA3.
- Dimostrazione di differenze nei modelli di deambulazione tra modelli di moscerini.
- Forniti spunti sui meccanismi sottostanti alla neurodegenerazione.
Conclusioni
- FLLIT è uno strumento potente per l'analisi della locomozione negli insetti.
- Può aiutare a chiarire gli effetti delle mutazioni genetiche sull'andatura.
- Il metodo migliora la nostra comprensione delle malattie neurodegenerative.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
La quantificazione automatizzata della locomozione degli insetti consente lo screening fenotipico ad alto rendimento per modelli di malattie neurodegenerative. FLLIT fornisce misurazioni oggettive dell'andatura che supportano la validazione degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nella fase iniziale della scoperta. Il suo flusso di lavoro completamente automatizzato riduce il bias dell'operatore e aumenta la riproducibilità per team interfunzionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando le anomalie nei movimenti delle zampe nei modelli di malattia.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico mediante fenotipizzazione obiettiva e ad alta risoluzione dell'andatura.
- Valore predittivo: Produce dati quantitativi che contribuiscono alla selezione del portafoglio e all'identificazione dei composti guida.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce sistemi biologici standardizzati per lo screening di composti successivi.
- Riproducibilità: Fornisce parametri quantitativi della deambulazione costanti tra repliche sperimentali.
- Scalabilità: Permette il riutilizzo della piattaforma per campagne di screening ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella i fenotipi di andatura atassica umana in moscerini con mutazione SCA3.
- Continuità traslazionale: Collega le scoperte alla validazione preclinica attraverso endpoint misurabili dell'andatura.
- Decisioni basate sul rischio: Fornisce indicazioni sui criteri di avanzamento in base al potenziale di normalizzazione dell'andatura.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
FLLIT si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio fino alla valutazione preclinica, fornendo fenotipi quantificabili della locomozione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante il tracciamento automatico degli arti.
- Screening: Permette la standardizzazione dei saggi e l'ottenimento di risultati quantitativi riproducibili per la valutazione dei composti.
- Analisi: Fornisce 20 parametri della deambulazione e visualizzazioni che facilitano il confronto tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega ai lavori preclinici attraverso anomalie della deambulazione rilevanti per le malattie nei modelli di neurodegenerazione.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità riutilizzabile in diversi modelli di malattia basati su insetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nei fenotipi locomotori.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e scalabilità attraverso un processo completamente automatizzato.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo metriche oggettive dell'andatura per la validazione del modello.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio basata sulla normalizzazione dell'andatura nei modelli di malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nei flussi di lavoro di apprendimento automatico e nell'analisi video.
- Necessita di un'infrastruttura con telecamere ad alta velocità e un sistema di illuminazione controllato.
- Richiede standardizzazione tra diversi gruppi di lavoro per l'interpretazione dei dati e la definizione delle soglie.
- Comporta considerazioni di adattamento per diverse specie di insetti e modelli di andatura.
- Dipende da una lunghezza del passo sufficiente e da una traiettoria rettilinea per un tracciamento accurato.
Domande frequenti di biotecnologie farmaceutiche
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
System Setup
1:05
Fly Preparation
1:47
Video Generation for Feature Learning Leg Segmentation and Tracking (FLLIT) Analysis
2:52
FLLIT Installation
3:50
Automated Leg Tracking
5:13
Data Processing and Video Generation
7:31
Conclusion
5:54
Representative Results: Automated Leg Movement Tracking in Freely-Moving Insects
