Name: Rilevamento di Protein S-Acylation utilizzando Acyl-Resin Assisted Capture (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Scopri il metodo Acyl-RAC per rilevare la S-acilazione proteica in campioni biologici come cellule, tessuti primari e campioni congelati. Questa tecnica sensibile supera i limiti dei metodi di marcatura metabolica.

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Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health grants 5R01GM115446 e 1R01GM130840.

I topi utilizzati in questo protocollo sono stati eutanasiati secondo le linee guida NIH. L'Animal Welfare Committee dell'Università del Texas Health Science Center di Houston ha approvato tutto il lavoro sugli animali.
1. Preparazione dei lismi cellulari
<ol><li>Preparare il buffer di lisi come descritto nella tabella 1. A 10 mL di PBS, aggiungere 0,1 g di detergente n-dodecyl (DDM) e ruotare per sciogliere. Aggiungete 100 l di fosphatase inhibitor cocktail 2, ML211 (10 m), PMSF (10 mM) e cocktail inibitore della proteasi (1x) e raffreddare il tampone sul ghiaccio prima dell'uso.</li>
	<li>Trasferire i supporti necessari contenenti le cellule dell'incubatrice in tubi conici da 15 mL o 50 mL e le cellule di spin a 350 x g per 5 min e aspirare per sbarazzarsi di eventuali detriti cellulari. NOTA: Abbiamo usato 1 x 107 celle per ogni reazione acilo-RAC da eseguire.</li>
	<li>Lavare il pellet rispendendolo in 5 mL di PBS e ruotando a 350 x g per 5 min. NOTA: Eseguire rapidamente il passaggio 1.3 per evitare la lisi cellulare a causa di un'incubazione prolungata in PBS.</li>
	<li>Aggiungere 600 lofildi di lisi tampone preparato al punto 1.1 al pellet e lo sileria a 1500 giri/m in uno shaker termico per 30 min a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Lisati chiari per centrifugazione a 20.000 x g a 4 gradi centigradi per 30 min a pellet detersivo-materiali solubili. Raccogliere il lisato eliminato in tubi di microfuge pre-raffreddati da 1,5 mL e tenerli sul ghiaccio.</li>
	<li>Eseguire un saggio Bradford/BCA per stimare la concentrazione di proteine. È fondamentale garantire la stessa quantità di proteine tra campioni diversi prima di eseguire l'esperimento. Si consiglia di utilizzare almeno 500 g di proteine per reazione. NOTA: Negli esperimenti descritti, abbiamo usato cellule coltivate (Jurkat) e splenociti primari dal tessuto dei topi. Il metodo di lisi descritto sopra può essere adottato anche ad altri tipi di cellule. La concentrazione media di proteine ottenuta per i tipi di cellule di cui sopra è di circa 500 g per 1 x 107 cellule. Le cellule Jurkat sono state mantenute in RPMI-1640 media modificato per contenere 2 mM L-glutamine, 10 m HEPES, 1 mM di pyruvate di sodio, 4.500 mg/l di glucosio e 1.500 mg/L bicarbonato di sodio integrato con 10% FBS a 37 s.C con 5% CO2. Abbiamo usato 1 x 107 cellule Jurkat per reazione. Gli splenociti primari sono stati isolati dal tessuto della milza del topo come descritto26. In breve, il tessuto della milza è stato macerato sul ghiaccio, seguito da lisi di eritrociti in soluzione ipotonica e separazione dai linfociti dalla centrifugazione. Abbiamo usato 1 x 107 cellule primarie per reazione.</li>
</ol>2. Acyl-RAC: Blocco dei gruppi thiol liberi
NOTA: tutti i passaggi successivi possono essere eseguiti a temperatura ambiente (RT).
<ol><li>Trasferire il lisato in un nuovo tubo di microfuge da 1,5 ml ed eseguire la precipitazione cloroformio-metanolo (CM) come descritto di seguito.<ol>
<li>Aggiungere metanolo (MeOH) e cloroformio (CHCl3) al lisato ad un rapporto finale di lisato: MeOH: CHCl3 di 2:2:1 e agitare vigorosamente per creare una sospensione omogenea.</li>
		<li>Girare a 10.000 x g per 5 min per formare un pellet ("pancake") all'interfase tra fasi acquose e organiche.</li>
		<li>Inclinare il tubo e aspirare il più possibile il solvente utilizzando un ago o una punta di carico gel.</li>
		<li>Asciugare l'aria del pellet proteico per alcuni minuti e lavarlo delicatamente aggiungendo 600 lofe di MeOH e mescolando delicatamente per evitare di rompere il pellet</li>
		<li>Rimuovere con cura il restante MeOH e asciugare il pellet proteico su un banco per circa 5 minuti.</li>
		<li>(Facoltativo) Eseguire un ulteriore passo di centrifugazione per ruotare verso il basso qualsiasi pellet rotto dopo il lavaggio MeOH per evitare la perdita di campione. NOTA: l'esperimento può essere interrotto dopo la fase di precipitazione CM. Una volta ottenuto, il pellet può essere conservato in 500 gradi di MeOH in -20 gradi centigradi fino a una settimana.<ol>
<li>Sciogliere il pellet proteico in un buffer da 2SHB da 2SHB vortice a 42 s/1500 rpm in uno shaker termico fino a quando il pellet non viene sciolto.</li>
		</ol>
</li>
		<li>(Facoltativo) Incubare per altri 5-10 min in un bagno d'acqua sonicante per sciogliere il pellet. NOTA: La durata della sonicazione varia a seconda della solubilità del materiale. Tuttavia, la sonicazione prolungata può causare la degradazione delle proteine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare lo 0,2% di metano metilethiosulfonate (MMTS) (v/v) in 2SHB aggiungendo 2 L di MMTS a 998 l l di buffer 2SHB. NOTA: utilizzare 0,2% MMTS appena preparato per ogni esperimento.</li>
	<li>Aggiungere 200 L dello 0,2% MMTS in 2SHB ad ogni tubo ad una concentrazione finale dello 0,1% MMTS. Incubare per 15 min a 42 sc con agitazione a 1500 giri/m in uno shaker termico.</li>
</ol>3. Acyl-RAC: Scissione dell'idrossilamina (HAM) e cattura delle proteine Aciolate S
<ol><li>Ripetere le precipitazioni 3-4x CM come descritto in precedenza per rimuovere MMTS. La rimozione di MMTS può essere stimata dalla mancanza di odore distinto di MMTS. Dopo ogni precipitazione, sciogliere il pellet in un buffer da 100 gradi di 2SHB vorticendo a 42 s/1500 giri/min in uno shaker termico fino a quando il pellet si dissolve, quindi diluire con 300L di buffer A.</li>
	<li>Dopo la precipitazione finale, sciogliere i campioni in 200 - L di buffer 2SHB come descritto sopra e diluire con 240 L del buffer A.</li>
	<li>In caso di confronto dei cambiamenti nella S-acylation in risposta a diverse condizioni di trattamento, misurare nuovamente la concentrazione di proteine e procedere con la stessa quantità di proteine per ogni condizione.</li>
	<li>Conservare 40 l da ogni campione come controllo di input.</li>
	<li>Suddividere i campioni in due parti uguali di 200 -L e marcare i tubi come "HAM" e "- HAM". Aggiungere 50 L di 2 M HAM neutro appena preparato (pH 7,0-7,5) ad una concentrazione finale di 400 mM a uno dei tubi (HAM) e 50 L di 2 M NaCl neutro al secondo tubo (- HAM), che verrà utilizzato come controllo negativo. Procedere con l'aggiunta di perline tiopropile-sefarose (TS). NOTA: l'esperimento può essere interrotto dopo una qualsiasi delle fasi di precipitazione CM. Una volta ottenuto, il pellet può essere conservato in 500 gradi di MeOH in -20 gradi centigradi fino a una settimana. PH neutro di 2 M HAM garantisce la sua selettività per il legame acyl-cysteine thioester e deve essere regolato con attenzione. Prestare attenzione quando si maneggiano campioni nel buffer 2SHB per evitare la perdita di campione a causa di schiuma eccessiva. Tutti i passaggi seguenti sono identici per - campioni di HAM e HAM.</li>
	<li>Aggiungere 30 lofan di tallone-slurry ad ogni tubo e ruotare i tubi per 1-2 h a RT.</li>
	<li>Lavare le perline TS 4x con 1% SDS nel buffer A per rimuovere il HAM residuo.<ol>
<li>Girare delicatamente verso il basso tutti i campioni di tallone utilizzando un microfugo per 1 min e aspirare con attenzione il supernatante.</li>
		<li>Risospendere le perline in 500 -L dell'1% di SDS nel buffer A.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 3.7.1–3.7.2 tre volte. NOTA: il tiopropile-sepharose (TS) attivato viene fornito liofilizzato in presenza di additivi che devono essere lavati via al pH neutro prima dell'accoppiamento. L'acqua distillata è raccomandata per il gonfiore e il lavaggio. Pesare 0,1 g di perline e risospendere in 1 mL di acqua distillata e lasciarla gonfiare mentre ruota per 30 min-1 h a RT. Lavare perline 1x con buffer A e preparare un liquame con buffer A, in un rapporto del 50% stabilizzato medio al 50% tampone. Swollen TS può essere conservato a pH neutro in presenza di 20% etanolo a 4 gradi centigradi fino a una settimana. Non usare azide di sodio come agente batteriostatico poiché gli ioni di azide reagiscono con i gruppi disulfide 2-pyridyl. Per una maggiore efficienza, preparare perline fresche. Durante la manipolazione delle perline, la punta di una punta di pipetta P200 può essere tagliata leggermente in modo da evitare danni. NOTA: l'esperimento può essere interrotto in qualsiasi fase dopo la precipitazione CM. Il pellet può essere conservato in 500 gradi L di MeOH in -20 gradi centigradi fino a una settimana.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Elusione e rilevamento di proteine acilate A S
<ol><li>Dopo l'ultimo lavaggio, girare delicatamente verso il basso le perline come descritto sopra e aspirare quanto più supernatante possibile senza disturbare le perline.</li>
	<li>Recuperare le proteine da perline con 4x sDS buffer campione con DTT.<ol>
<li>Aggiungete 50 l di 4x buffer di campione SDS alle perline e incubate a 80 gradi centigradi, 1500 giri/m per 15 min in uno shaker termico. Lasciare raffreddare i tubi.</li>
		<li>Centrifugare le perline a 5.000 x g per 3 min per pellet completamente le perline e trasferire le proteine eluite in un tubo fresco da 1,5 mL utilizzando una punta di carico del gel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire SDS-PAGE e analizzare S-acylation delle proteine di interesse da gonfiore occidentale.</li>
</ol>

<ol><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li>
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<li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li>
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<li>Rami, N., Hannoush, N. A. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+lipidome%3A+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li>
<li>Kostiuk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+palmitoylated+mitochondrial+proteins+using+a+bio-orthogonal+azido-palmitate+analogue%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.</a> FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).</li>
<li>Charron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Fluorescent+Detection+of+Protein+Fatty-Acylation+with+Chemical+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).</li>
<li>Roth, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li>
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<li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Crystals%22%5BJournal%5D)">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li>
<li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+%28LYPLA1%29+and+lysophospholipase+2+%28LYPLA2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Probe+Reports+from+the+NIH+Molecular+Libraries+Program%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li>
<li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li>
<li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li>
<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Qui, abbiamo utilizzato con successo il saggio acyl-RAC per rilevare l'acilazione S di proteine selezionate sia nelle cellule umane coltivate che nelle cellule primarie derivate dal tessuto del topo. Questo metodo è semplice, sensibile e può essere facilmente eseguito con requisiti minimi di attrezzatura utilizzando tecniche di biochimica standard. È stato dimostrato che questo metodo identifica con successo nuove proteine S-acilato, come la sottounità z del sistema di traslocazione delle proteine (Sec61b), la proteina r...

La S-acylation è una modifica post-traduzionale reversibile che comporta l'aggiunta di una catena di acili grassi a un residuo di cisteina interno su una proteina bersaglio tramite un legame di tioestro labile1. È stato segnalato per la prima volta come una modifica delle proteine con palmitate, un acido grasso 16-carbonio saturo2, e quindi questa modifica è spesso indicata come S-palmitoylation. Oltre al palmitato, le proteine possono essere reversibilmente modificate da una varietà di acidi grassi più lunghi e più brevi saturi (miristata e stearate), monoinsaturi (oleati) e polinsaturi (arachidonate ed eicosapentanoa)acidigrassi 3,4,5,6,7. Nelle cellule eucariotiche, la S-acylation è catalizzata da una famiglia di enzimi noti come acyltransferesteraes proteici DHHC e la reazione inversa della deacylazione dei cistein è catalizzata da tiosi proteici, la maggior parte dei quali rimangono ancora enigmatici8.
La leggibilità del legame di tioestro rende reversibile questa modifica dei lipidi, permettendogli di regolare dinamicamente il clustering proteico, la localizzazione della membrana plasmatica, il traffico intracellulare, le interazioni proteina-proteina e la stabilità proteica9,10. Di conseguenza, l'acilazione scisa è stata collegata a diversi disturbi tra cui la Malattia di Huntington, il morbo di Alzheimer e diversi tipi di cancro (prostata, gastrica, vescica, polmone, colorettale), che richiede lo sviluppo di metodi affidabili per rilevare questa modifica delle proteine post-traduzionale11.
L'etichettatura metabolica con palmita radioattiva ([3H], [14C] o [125I]) è stato uno dei primi approcci sviluppati per formulare la proteina S-acylation12,13,14. Tuttavia, i metodi basati sulla radioetichettatura presentano problemi di salute, non sono molto sensibili, richiedono molto tempo e rilevano solo la lipidazione di proteine altamente abbondanti15. Un'alternativa più veloce e non radioattiva alla radioetichettatura è l'etichettatura metabolica con sonde di acidi grassi bioortogonali, che viene utilizzata regolarmente per testare la dinamica della proteina S-acylation16. In questo metodo, un acido grasso con un reporter chimico (gruppo alchine o azide) è incorporato nella proteina S-acilato da un acyltransferase proteico. La reazione di cicloaddition Azide-alkyne Huisgen (chimica del clic) può quindi essere utilizzata per attaccare un gruppo funzionato, come un fluoroforo o biotina, all'acido grasso integrato che consente di rilevare la proteina S-acilata17,18,19.
Lo scambio di acyl-biotin (ABE) è uno dei metodi biochimici ampiamente utilizzati per la cattura e l'identificazione di proteine S-acylated che bypassa alcune delle carenze dell'etichettatura metabolica come l'inadeguatezza per i campioni di tessuto15. Questo metodo può essere applicato per l'analisi di S-acylation in una vasta gamma di campioni biologici, tra cui tessuti e campioni di cellule congelate20,21. Questo metodo si basa sulla scissione selettiva del legame tra il gruppo acileere e il residuo di cisteina da idrossilamina neutra. I gruppi tioli liberati vengono poi catturati con un derivato della biotina thiol-reattiva. Le proteine biotinylate generate vengono quindi purificate dall'affinità con streptavidin agarose e analizzate mediante immunoblotting.
Un approccio alternativo chiamato acyl-resina assistita capture (Acyl-RAC) è stato successivamente introdotto per sostituire la fase di biotinylazione con coniugazione diretta di cistein liberi da una resina thiol-reattiva22,23. Questo metodo ha meno passaggi rispetto ad ABE e allo stesso modo può essere utilizzato per rilevare proteina S-acylation in una vasta gamma di campioni1.
Acyl-RAC è costituito da 4 passaggi principali (Figura 1), 1. Blocco dei gruppi di thiol liberi; 2. Scissione selettiva del legame cisteina-acilo con idrossilamina neutra (HAM) per esporre i gruppi di cisteina; 3. Cattura dei cistein lipidati con una resina thiol-reattiva; 4. Arricchimento selettivo delle proteine aclatato da S dopo l'eluizione con riduzione del tampone.
Le proteine catturate possono quindi essere analizzate mediante immunoblotting o sottoposte a proteometria di massa (MS) per valutare il proteoma aclato da S in una vasta gamma di specie e tessuti22,24,25. I singoli siti di S-acylation possono anche essere identificati mediante la digestione della trypsin acquisizione delle proteine catturate e l'analisi dei peptidi risultanti da LC-MS/MS22. Qui, dimostriamo come acyl-RAC può essere utilizzato per il rilevamento simultaneo di S-acylation di più proteine sia in una linea cellulare che in un campione di tessuto.

<table><tbody><tr><td>Compresse da cocktail con inibitore della proteasi cOmplete</td><td>Sigma</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620444</td><td></td></tr><tr><td>idrossilammina (HAM)</td><td>Sigma</td><td>159417</td><td></td></tr><tr><td>metil metanetisolfonato (MMTS)</td><td>Sigma</td><td>64306</td><td></td></tr><tr><td>Mini rotatore per tubi</td><td>LabForce</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ML211</td><td>Cayman</td><td>17630</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000-HC</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecil &beta;-D-maltoside (DDM)</td><td>Sigma</td><td>D641</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della fosfatasi 2</td><td>Sigma</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>Tiopropil-Sefarosio 6B (TS)</td><td>Sigma</td><td>T8387</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonics Quantrex Sonicator</td><td>L &; R</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento di protein s-acylation utilizzando acyl-resin assisted capture

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Protein S-acylation, noto anche come S-palmitoylation, è una modifica post-traduzionale reversibile dei residui di cisteina con acidi grassi a catena lunga tramite un legame di tioestro labile. La S-acylation, che sta emergendo come un meccanismo regolatore diffuso, può modulare quasi tutti gli aspetti dell'attività biologica delle proteine, dalla formazione complessa al traffico di proteine e alla stabilità delle proteine. I recenti progressi nella comprensione della funzione biologica della proteina S-acylation sono stati raggiunti in gran parte grazie allo sviluppo di nuovi strumenti biochimici che consentono il rilevamento robusto e sensibile della proteina S-acylation in una varietà di campioni biologici. Qui, descriviamo la cattura assistita da resina acilosa (Acyl-RAC), un metodo recentemente sviluppato basato sulla cattura selettiva di proteine endogeneamente Aclaate con perline sepharose thiol-reattive. Rispetto agli approcci esistenti, Acyl-RAC richiede meno passaggi e può produrre risultati più affidabili se accoppiato con spettrometria di massa per l'identificazione di nuovi obiettivi S-acylation. Una delle principali limitazioni di questa tecnica è la mancanza di capacità di discriminare tra le specie di acidi grassi attaccate ai cistein attraverso lo stesso legame di tiopee.

Seguendo il protocollo descritto sopra, abbiamo usato per la prima volta acyl-RAC per rilevare simultaneamente l'acilazione S di diverse proteine nelle cellule Jurkat, una linea cellulare T immortalata originariamente derivata dal sangue periferico di un paziente con leucemia delle cellule T27. Proteine cellulari T regolatorie precedentemente identificate come S-acylated9,28,29 sono stati scelti per dimos...

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) è un metodo altamente sensibile, affidabile e facile da eseguire per rilevare la modifica reversibile dei lipidi dei residui di cisteina (S-acylation) in una varietà di campioni biologici.

Rilevamento di Protein S-Acylation utilizzando Acyl-Resin Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

La cattura assistita acil-resina o Acyl-RAC è un metodo sensibile e affidabile che può essere utilizzato per rilevare la proteina S-acilazione in una varietà di campioni biologici. Questo protocollo ignora alcune delle limitazioni dell'etichettatura metabolica e dell'etichettatura radio, e consente il rilevamento simultaneo della S-acilazione di più proteine. Non solo cellule vive, ma anche tessuti primari e campioni congelati.La s-acilazione può regolare una varietà di processi cellulari come il traffico proteico, il targeting della membrana plasmatica, la trasduzione del segnale, il trasporto del ferro e le interazioni proteina-proteina. È importante utilizzare una soluzione di idrossilammina preparata al momento con pH accuratamente regolato per ogni esperimento per garantire una scissione efficiente e specifica del legame tioestere. Con una dimostrazione di questo metodo è fondamentale per passi come il cloroformio, la precipitazione del metanolo.Il pellet a forma di pancake ottenuto durante questo passaggio deve essere maneggiato con molta attenzione. Può essere fragile e la perdita parziale del campione durante il passaggio può portare a un recupero irregolare del campione. A dimostrare la procedura sarà Savannah West, una studentessa laureata del nostro laboratorio.Per ottenere lisati cellulari, raccogliere le cellule di interesse in un tubo di centrifuga conico. E rimuovere eventuali detriti cellulari per centrifugazione. Lavare il pellet in 5 millilitri di PBS.E ha immediatamente rimescolato le cellule in 600 microlitri di tampone di lysis appena preparato. Agitare il campione a 1.500 giri al minuto in un termo agitatore per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Prima di sgombrare il coperchio, il detersivo a pellet e il materiale solubile mediante centrifugazione.Al termine della centrifugazione, raccogliere il lisato sgombrato in un tubo di microcentrifugo pre-raffreddato da 1,5 millilitri sul ghiaccio. Ed eseguire un test dell'acido bradford o bicinchoninico per stimare la concentrazione proteica secondo protocolli standard. Aggiungere metanolo e cloroformio per il lysato con un rapporto 2:1.Agitare rigorosamente per creare una sospensione omogenea e centrifugare il campione per raccogliere un pellet proteico all'interfaccia tra le fasi acquose e organiche. Inclinando il tubo, utilizzare un ago o una punta di caricamento del gel per aspirare il più solvente possibile. Asciugare all'aria il pellet proteico per alcuni minuti.Prima di mescolare delicatamente il contenuto del tubo con 600 microlitri di metanolo, facendo attenzione a non rompere il pellet. Dopo aver rimosso con cura il lavaggio del metanolo, asciugare il pellet proteico su un piano di banco per circa cinque minuti. Successivamente, resuspend il pellet proteico in 200 microlitri di tampone 2SHB.E vortice a 42 gradi Celsius e 1.500 giri al minuto in un termo agitatore. Quando il pellet viene sciolto, aggiungere al campione 200 microlitri dello 0,2%MMTS in 2SHB. E incubare la proteina per 15 minuti a 42 gradi Celsius e 1.500 giri al minuto in un termo shaker.Alla fine dell'incubazione, eseguire precipitazioni di cloroformio-metanolo 3:4 come dimostrato. Per rimuovere l'MMTS, sciogliere il pellet in 100 microlitri di tampone 2SHB fresco con vortice. E diluire il campione con 300 microlitri di tampone A dopo ogni precipitazione.Dopo la precipitazione finale, sciogliere i campioni in 200 microlitri di tampone 2SHB e diluire con 240 microlitri del tampone A.Misurare nuovamente la concentrazione proteica e mettere da parte 40 microlitri per ciascun campione come controlli di input. Dividere i campioni in due volumi uguali di 200 microlitri. E contrassegnare i tubi come più idrossilammina e meno idrossilammina.Aggiungere 50 microlitri di idrossilammina molare neutra appena preparata a una concentrazione finale di 400 millimolare al tubo più idrossilammina. E 50 microlitri di cloruro di sodio molare neutro al controllo negativo, un tubo meno idrossilammina. Quindi aggiungere 30 microlitri di liquami di perline TS a ciascun tubo.E ruotare i tubi per una o due ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione lavare le perline quattro volte con 1%SDS nel tampone A per rimuovere eventuali idrossilammine residue. Dopo l'ultimo lavaggio, lavare tutti i campioni di perline con tre delicati microcentrifugazioni di un minuto.Aspirando con cura i supernaganti e rimospendendo le perline in 500 microlitri di 1%SDS nel tampone A ad ogni lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, girare delicatamente lungo le perline come dimostrato. E aspirare il più supernatante possibile senza disturbare le perline.Per recuperare le proteine dalle perline, aggiungere 50 microlitri di tampone campione 4%SDS a ciascun tubo e incubare i campioni a 80 gradi Celsius e 1.500 giri al minuto per 15 minuti in un termo agitatore. Al termine dell'incubazione, lasciare raffreddare i campioni prima di centrifugare per pelletare completamente le perline. Quindi utilizzare una punta di caricamento del gel per trasferire le proteine eluite in nuovi tubi da 1,5 millilitri.Ed eseguire i campioni su un gel SDS-PAGE per analizzare la S-acilazione delle proteine di interesse mediante gonfiore occidentale. La tirosina chinasi Lck può essere rilevata nei lisati trattati con idrossilammina molare neutra. per spezzare il legame tioestere tra i residui di cisteina e la moietà degli acidi grassi.Lo stripping e il riprobing con anticorpi contro le proteine Fyn e LAT dimostrano che il saggio di cattura assistita da resina acile può essere utilizzato per analizzare la S-acilazione di più proteine contemporaneamente. Inoltre, la S-acilazione di Lck, Fyn e LAT può essere facilmente rilevata negli splenociti primari del topo. Indicando che questa modifica è conservata tra due specie.Oltre all'identificazione di nuove proteine S-acilate, questo metodo può anche essere utilizzato per valutare i cambiamenti nella S-acilazione proteica in diverse condizioni biologiche. Il numero di proteine S-acilate appena identificate è aumentato enormemente dopo che il doppio up ha significato una tecnica veloce e affidabile come Acyl-RAC. Oltre all'identificazione di nuove proteine S-acilate, questo metodo può anche essere utilizzato per valutare i cambiamenti nella S-acilazione proteica in diverse condizioni biologiche.

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Composti cattura sono trifunzionale piccole molecole per ridurre la complessità del proteoma funzionale reversibile da piccola molecola-proteina seguiti da foto-reticolazione e purificazione. Qui si usa un composto di cattura...

Profilatura di metiltransferasi e altri S-Adenosil- L-Omocisteina-binding proteine ​​mediante spettrometria di massa Compound Capture (CCMS)

Proteine ​​di superficie cellulare sono biologicamente importante e ampiamente glicosilata. Vi presentiamo qui un approccio glicopeptide-capture per solubilizzare, arricchire, e deglycosylate queste proteine ​​per facili analisi proteomica basati LC-MS.

Glicopeptide Capture per Proteomica cellulari di superficie

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per eseguire saggi di deacetilazione in vitro e in vivo al fine di stabilire il ruolo delle proteine come substrati specifici di deacetilazione per le sirtuine e studiare ulteriormente il ruolo dell'acetilazione reversibile della lisina come modifica post-traduzionale.

Deacetilazione saggi di svelare l&#39;interazione tra sirtuine (SIRT2) e specifici Protein-substrati

Descriviamo un metodo per generare linee cellulari stabili inducibili marcate con localizzazione e purificazione di affinità (LAP) per studiare la funzione delle proteine, la localizzazione subcellulare spaziotemporale e le reti di interazione proteina-proteina.

Inducibile LAP-tagged linee cellulari stabili per indagare la funzione delle proteine, Spatiotemporal Localizzazione e reti di interazione proteina

Acido sialico è una tipica unità di monosaccaride trovata nei glycoconjugates. È coinvolto in una pletora di interazioni cellulari e molecolari. Qui presentiamo un metodo per modificare l'espressione di superficie acido sialico cellulare utilizzando glycoengineering metabolica con N- monosaccaridico derivati.

Glycoengineering metabolica di acido sialico utilizzando N-acil-per volta Mannosamines

Indagando più, modificazioni post-traduzionali endogeni per una proteina bersaglio possono essere estremamente impegnativi. Tecniche descritte qui utilizzano un sistema di tampone e di filtro ottimizzato Lisi sviluppato con PTM-targeting specifico, matrici di affinità per rilevare le modifiche di fosforilazione di acetilazione, ubiquitinazione, sumoilazione 2/3 e tirosina per una destinazione proteine utilizzando un unico sistema semplificato.

Che utilizzano un sistema di arricchimento di immunoprecipitazione completa per identificare un profilo di modificazione post-traduzionale endogeno per proteine bersaglio

Qui, presentiamo imparziale quantificazione di occupazione acetilazione e/o succinylation site-specific protein (stechiometria) di un intero proteoma attraverso un'analisi raziometrici endogeno modifiche modifiche introdotte dopo quantitativa Acilazione chimica utilizzando anidridi con etichetta isotopo stabile. In combinazione con spettrometria di massa sensibile acquisizione dati-indipendente, sito accurata occupazione misurazioni sono ottenute.

Quantificazione di site-specific Protein lisina acetilazione e stechiometria Succinylation usando la spettrometria totale di acquisizione dati-indipendente

Presentiamo un metodo per la purificazione, il rilevamento e l'identificazione di peptidi diGly che provengono da proteine ubiquitinate da campioni biologici complessi. Il metodo presentato è riproducibile, robusto e supera i metodi pubblicati rispetto al livello di profondità dell'analisi dell'ubiquitinome.

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

Questo flusso di lavoro descrive contemporaneamente le prestazioni dell'arricchimento in termini di tempo ed efficiente in termini di costi di più modifiche post-traslazionali proteiche (PPM) per l'analisi proteomica globale quantitativa. Il protocollo utilizza l'arricchimento PTM a livello di peptide con più anticorpi coniugati, seguito dall'analisi della spettrometria di massa di acquisizione indipendente dai dati per ottenere informazioni biologiche sul crosstalk PTM.

Arricchimento simultaneo dell'affinità di due modifiche post-traduzionali per la quantificazione e la localizzazione del sito

Lo studio dell'acilazione grassa ha importanti implicazioni nelle interazioni proteiche cellulari e nelle malattie. Qui viene presentato un protocollo modificato per migliorare il rilevamento della chimica dei clic delle proteine acilate grasse, che può essere applicato in vari tipi di cellule e combinato con altri saggi, tra cui pulse-chase e spettrometria di massa.

Incorporazione ottimizzata di analoghi degli acidi grassi alchinici per il rilevamento di proteine acilate grasse utilizzando la chimica dei clic

L'ossidazione del tiolo proteico ha implicazioni significative in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche normali. Descriviamo i dettagli di un metodo di proteomica redox quantitativa, che utilizza la cattura assistita da resina, la marcatura isobarica e la spettrometria di massa, consentendo l'identificazione sito-specifica e la quantificazione dei residui di cisteina ossidati in modo reversibile delle proteine.

Cattura assistita da resina accoppiata con etichettatura isobarica Tandem Mass Tag per la quantificazione multiplexata dell'ossidazione del tiolo proteico

Scopri il metodo Acyl-RAC per rilevare la S-acilazione proteica in campioni biologici come cellule, tessuti primari e campioni congelati. Questa tecnica sensibile supera i limiti dei metodi di marcatura metabolica.

Rilevamento di Protein S-Acylation utilizzando Acyl-Resin Assisted Capture

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