Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Analisi per la Determinazione Quantitativa della Palmitoylation delle Proteine della Membrana Cerebrale
March 29th, 2020
Palmitoylation comporta l'incorporazione di una moiety palmitativa 16-carbonio ai residui di cisteina delle proteine bersaglio in modo reversibile. Qui, descriviamo un approccio biochimico, l'analisi ApegS (acyl-PEGyl exchange gel shift), per studiare lo stato di palmitoylation di qualsiasi proteina di interesse nei lismi cerebrali dei topi.
Questo metodo biochimico consente la determinazione dello stato di palmitoilazione di qualsiasi proteina di membrana espressa nel cervello per la quale è disponibile un anticorpo adatto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non richiede la purificazione dell'affinità e utilizza invece cambiamenti nella mobilità del gel per determinare il numero di modifiche di una proteina di interesse. Dopo aver sezionato il cervello, omogeneizzarlo immediatamente in 10 millilitri di tampone di omogeneizzazione in un omogeneizzatore di vetro sul ghiaccio.
Usando circa 12 colpi, centrifuga i lisati per 15 minuti a 1400 volte G e quattro gradi Celsius. Trasferire il supernatante su un nuovo tubo sul ghiaccio. Rimescolare il pellet in 10 millilitri di tampone di omogeneizzazione.
Omogeneizzarlo usando circa sei tratti. Centrifugare la sospensione a 710 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Combina i supernatanti e centrifugali a 40.000 volte G e quattro gradi Celsius per 20 minuti.
Scartare il supernatante e rimescolare la frazione di membrana pelletata in un tampone di omogeneizzazione rompendo il pellet con una punta di pipetta e tubazione su e giù. Eseguire il test ABCA per quantificare i livelli proteici. Per eseguire il test APEGS, posizionare 470 microlitri di tampone A in un tubo da 1,5 millilitri e aggiungere circa 100-200 milligrammi di proteine.
Sonicare il tubo e quindi separare la proteina insolubile centrifugando il tubo a 25 gradi Celsius e un minimo di 13.000 volte G per 10 minuti. Trasferire la proteina solubalizzata in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. In primo luogo, interrompere i legami del disolfuro incubando la proteina solubalizzata in 25 microlitri di TCEP per 60 minuti a 55 gradi Celsius.
Quindi, bloccare le cisteine libere incubando la soluzione con 12,5 microlitri della soluzione stock di NEM per tre ore a temperatura ambiente. Quindi, iniziare il processo di precipitazione del metanolo cloroformio. Trasferire la soluzione proteica dal tubo da 1,5 millilitri a un tubo di polipropilene o vetro che può essere centrifugato in un rotore a secchio oscillante a velocità modesta.
Aggiungere brevemente due millilitri di metanolo e vortice. Aggiungere brevemente un millilitro di cloroformio e vortice. Quindi aggiungere di nuovo brevemente 1,5 millilitri di acqua deionizzata e vortice.
Se necessario, invertire il tubo per garantire una miscelazione accurata. Centrifugare i campioni a 3000 volte G e 25 gradi Celsius per 30 minuti in un rotore a secchio oscillante. Rimuovere e scartare con cura la fase superiore della soluzione in un tubo.
Aggiungere 1,5 millilitri di metanolo. Mescolare delicatamente ma accuratamente con una delicata inversione del tubo, facendo attenzione a non frammentare il pancake proteico opaco. Centrifugare il campione a 3000 volte G e 25 gradi Celsius per 10 minuti in un rotore a secchio oscillante.
Utilizzando una pipetta sierologica in vetro, rimuovere il più possibile la fase superiore della soluzione senza disturbare il pancake proteico. Risciacquare con cura il pellet con un millilitro di metanolo e lasciare asciugare all'aria per almeno 10 minuti. Con la precipitazione del metanolo cloroformio completa, iniziare la scissione dei collegamenti palmitoil tioestere rimescolando il precipitato proteico in 125 microlitri del tampone A.Trasferimento in un nuovo tubo da 1,5 millilitri.
Sonicare brevemente il tubo e quindi centrifugarlo a 13.000 volte G o superiore e 25 gradi Celsius per 10 minuti per rimuovere il materiale insolubile. Trasferire la proteina solubalizzata in nuovi tubi da 1,5 millilitri e aggiungere 375 microlitri di tampone H o tampone T.Dopo aver incubato i campioni per 60 minuti a temperatura ambiente, ripetere la precipitazione del metanolo cloroformio. Per aggiungere m-PEG alle cisteine non protette, iniziare riutilizzando il pellet in 100 microlitri di tampone A contenenti 10 mil o più TCEP.
Quindi trasferire la sospensione su un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere 25 microlitri di soluzione m-PEG 5K di serie e mescolare mediante pipettazione. Incubare a temperatura ambiente con rotazione end-over-end.
Dopo 60 minuti di incubazione, rimuovere m-PEG 5K non incorporato eseguendo nuovamente la precipitazione del metanolo cloroformio. Centrifuga a più di 13.000 volte G e 25 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere con cura la fase superiore come prima, evitando il pancake denso e flocculento.
Aggiungere un millilitro di metanolo e mescolare delicatamente ma accuratamente. Centrifuga a più di 13.000 volte G e 25 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere con cura il supernatante e risciacquare il pellet con un millilitro di metanolo.
Ancora una volta, centrifuga a più di 13.000 volte G e 25 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver asciugato all'aria il pellet, riprenorlo in 50 microlitri di tampone A senza TCEP o qualsiasi agente riducente. Riservare 5 microlitri della soluzione per la quantificazione delle proteine BCA.
Dopo la quantificazione, aggiungere una quantità appropriata di tampone campione 4x Laemmli. Caricare il campione in un gel di pagina SDS. Utilizzare protocolli standard di trasferimento e rilevamento della separazione per l'blotting occidentale.
Per studiare lo stato di palmitoilazione delle proteine SynDIG, le frazioni di membrana P2 provenienti da cervelli di topo omogeneizzati sono state sottoposte al test APEGS. La separazione e il sondaggio con gli anticorpi hanno dimostrato che SynDIG1, SynDIG4 Prrt1 e Prrt2 sono palmitoilati nel cervello del topo. Lo scopo della precipitazione del metanolo cloroformio è quello di impedire a una sostanza chimica, come il NEM, di interferire con la fase successiva del protocollo.
Una corretta precipitazione del metanolo cloroformio rimuoverà le sostanze chimiche indesiderate riducendo al minimo la perdita di proteine. Questo metodo può essere applicato ai lysati cerebrali di topi di età diverse o provenienti da diverse regioni cerebrali per indagare le normative spazio-temporali della palmitoilazione.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo biochimico per investigare lo stato di palmitoilazione delle proteine nei lisati di cervello di topo. Il test di spostamento del gel di scambio acil-PEGyl (APEGS) permette l'analisi delle proteine di membrana senza la necessità di purificazione per affinità.
Componenti chiave dello studio
Area di Scienza
- Neuroscienza
- Biochimica
- Modifica delle proteine
Sfondo
- La palmitoilazione è una modifica reversibile che comporta l'aggiunta di palmitato ai residui di cisteina.
- Questa modifica gioca un ruolo cruciale nella funzione e localizzazione delle proteine di membrana.
- Comprendere la palmitoilazione può fornire informazioni su vari processi neurologici.
- I metodi attuali per analizzare la palmitoilazione spesso richiedono passaggi di purificazione complessi.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo semplice per valutare lo stato di palmitoilazione delle proteine nel tessuto cerebrale.
- Eliminare la necessità di purificazione per affinità nell'analisi delle proteine di membrana.
- Fornire uno strumento per i ricercatori che studiano le modificazioni proteiche in neuroscienza.
Metodi utilizzati
- Omogenizzazione del tessuto cerebrale di topo in un buffer specifico.
- Centrifugazione per separare il surnatante contenente le proteine di interesse.
- Applicazione del test APEGS per determinare gli stati di palmitoilazione basandosi sugli spostamenti di mobilità in gel.
- Utilizzo di anticorpi adatti per rilevare le proteine bersaglio.
Risultati principali
- Il test APEGS identifica con successo gli stati di palmitoilazione di varie proteine di membrana.
- I cambiamenti nella mobilità in gel correlano con il grado di palmitoilazione.
- Questo metodo fornisce un mezzo rapido ed efficiente per analizzare le modificazioni proteiche.
- I risultati dimostrano la versatilità del test su diverse proteine.
Conclusioni
- Il test APEGS è uno strumento prezioso per studiare la palmitoilazione in neuroscienza.
- Questo metodo semplifica l'analisi delle modificazioni proteiche nei tessuti cerebrali.
- Le applicazioni future potrebbero migliorare la nostra comprensione delle funzioni delle proteine di membrana.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Assessing palmitoylation states in brain membrane proteins supports target validation for synaptic signaling pathways. The APEGS assay enables quantitative determination of lipid modifications without affinity purification, reducing workflow complexity. This approach provides mechanistic de-risking for CNS drug discovery by linking post-translational modifications to receptor trafficking and synaptic plasticity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by determining palmitoylation status of synaptic proteins like SynDIG1 that regulate AMPAR trafficking.
- Operational Value: Enables functional target validation through gel mobility shifts that correlate with modification states in native brain lysates.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying activity-dependent palmitoylation changes relevant to excitatory synapse development.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by confirming palmitoylation-dependent localization of membrane proteins.
- Operational Value: Addresses assay standardization through quantitative gel shift outputs that reflect modification stoichiometry.
- Platform Value: Highlights screening readiness via a reusable method applicable to multiple SynDIG family proteins in mouse brain.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by linking SynDIG1 palmitoylation to activity-dependent excitatory synapse formation, a process altered in neuropsychiatric disorders.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling spatial-temporal analysis of palmitoylation across brain regions and ages.
- Risk-Adjusted Advancement: Focuses on predictive de-risking by providing a biomarker-aligned readout for synaptic protein function.
Pipeline & Workflow Integration
The APEGS assay fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation by providing modification-state data that informs target druggability and pathway engagement.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by revealing palmitoylation-dependent regulation of synaptic scaffold proteins.
- Screening: Describes assay readiness through quantitative gel mobility shifts that enable comparison of modification states under different conditions.
- Analytics: Highlights measurements such as band shifts in SDS-PAGE that help teams compare palmitoylation levels across experimental groups.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by allowing assessment of palmitoylation in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for analyzing any brain-expressed membrane protein with a suitable antibody.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct assessment of palmitoylation states in native tissue.
- Operational Value: Standardization and scalability via a gel-based readout compatible with standard Western blotting infrastructure.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity around lipid-dependent protein localization.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization by enabling early detection of modification states that influence synaptic protein function and drug target suitability.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in protein biochemistry and Western blotting techniques.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include centrifuges, sonicators, and gel electrophoresis systems.
- Cross-team standardization requirements for consistent chloroform methanol precipitation and PEGylation steps.
- Adaptation considerations across model systems such as different mouse ages or brain regions to study spatial-temporal regulation.
- Practical limitations include the need for high-quality antibodies and optimization of protein loading for clear gel shift resolution.
