Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Analisi per la Determinazione Quantitativa della Palmitoylation delle Proteine della Membrana Cerebrale
29 marzo 2020
Palmitoylation comporta l'incorporazione di una moiety palmitativa 16-carbonio ai residui di cisteina delle proteine bersaglio in modo reversibile. Qui, descriviamo un approccio biochimico, l'analisi ApegS (acyl-PEGyl exchange gel shift), per studiare lo stato di palmitoylation di qualsiasi proteina di interesse nei lismi cerebrali dei topi.
Questo metodo biochimico consente la determinazione dello stato di palmitoilazione di qualsiasi proteina di membrana espressa nel cervello per la quale è disponibile un anticorpo adatto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non richiede la purificazione dell'affinità e utilizza invece cambiamenti nella mobilità del gel per determinare il numero di modifiche di una proteina di interesse. Dopo aver sezionato il cervello, omogeneizzarlo immediatamente in 10 millilitri di tampone di omogeneizzazione in un omogeneizzatore di vetro sul ghiaccio.
Usando circa 12 colpi, centrifuga i lisati per 15 minuti a 1400 volte G e quattro gradi Celsius. Trasferire il supernatante su un nuovo tubo sul ghiaccio. Rimescolare il pellet in 10 millilitri di tampone di omogeneizzazione.
Omogeneizzarlo usando circa sei tratti. Centrifugare la sospensione a 710 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Combina i supernatanti e centrifugali a 40.000 volte G e quattro gradi Celsius per 20 minuti.
Scartare il supernatante e rimescolare la frazione di membrana pelletata in un tampone di omogeneizzazione rompendo il pellet con una punta di pipetta e tubazione su e giù. Eseguire il test ABCA per quantificare i livelli proteici. Per eseguire il test APEGS, posizionare 470 microlitri di tampone A in un tubo da 1,5 millilitri e aggiungere circa 100-200 milligrammi di proteine.
Sonicare il tubo e quindi separare la proteina insolubile centrifugando il tubo a 25 gradi Celsius e un minimo di 13.000 volte G per 10 minuti. Trasferire la proteina solubalizzata in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. In primo luogo, interrompere i legami del disolfuro incubando la proteina solubalizzata in 25 microlitri di TCEP per 60 minuti a 55 gradi Celsius.
Quindi, bloccare le cisteine libere incubando la soluzione con 12,5 microlitri della soluzione stock di NEM per tre ore a temperatura ambiente. Quindi, iniziare il processo di precipitazione del metanolo cloroformio. Trasferire la soluzione proteica dal tubo da 1,5 millilitri a un tubo di polipropilene o vetro che può essere centrifugato in un rotore a secchio oscillante a velocità modesta.
Aggiungere brevemente due millilitri di metanolo e vortice. Aggiungere brevemente un millilitro di cloroformio e vortice. Quindi aggiungere di nuovo brevemente 1,5 millilitri di acqua deionizzata e vortice.
Se necessario, invertire il tubo per garantire una miscelazione accurata. Centrifugare i campioni a 3000 volte G e 25 gradi Celsius per 30 minuti in un rotore a secchio oscillante. Rimuovere e scartare con cura la fase superiore della soluzione in un tubo.
Aggiungere 1,5 millilitri di metanolo. Mescolare delicatamente ma accuratamente con una delicata inversione del tubo, facendo attenzione a non frammentare il pancake proteico opaco. Centrifugare il campione a 3000 volte G e 25 gradi Celsius per 10 minuti in un rotore a secchio oscillante.
Utilizzando una pipetta sierologica in vetro, rimuovere il più possibile la fase superiore della soluzione senza disturbare il pancake proteico. Risciacquare con cura il pellet con un millilitro di metanolo e lasciare asciugare all'aria per almeno 10 minuti. Con la precipitazione del metanolo cloroformio completa, iniziare la scissione dei collegamenti palmitoil tioestere rimescolando il precipitato proteico in 125 microlitri del tampone A.Trasferimento in un nuovo tubo da 1,5 millilitri.
Sonicare brevemente il tubo e quindi centrifugarlo a 13.000 volte G o superiore e 25 gradi Celsius per 10 minuti per rimuovere il materiale insolubile. Trasferire la proteina solubalizzata in nuovi tubi da 1,5 millilitri e aggiungere 375 microlitri di tampone H o tampone T.Dopo aver incubato i campioni per 60 minuti a temperatura ambiente, ripetere la precipitazione del metanolo cloroformio. Per aggiungere m-PEG alle cisteine non protette, iniziare riutilizzando il pellet in 100 microlitri di tampone A contenenti 10 mil o più TCEP.
Quindi trasferire la sospensione su un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere 25 microlitri di soluzione m-PEG 5K di serie e mescolare mediante pipettazione. Incubare a temperatura ambiente con rotazione end-over-end.
Dopo 60 minuti di incubazione, rimuovere m-PEG 5K non incorporato eseguendo nuovamente la precipitazione del metanolo cloroformio. Centrifuga a più di 13.000 volte G e 25 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere con cura la fase superiore come prima, evitando il pancake denso e flocculento.
Aggiungere un millilitro di metanolo e mescolare delicatamente ma accuratamente. Centrifuga a più di 13.000 volte G e 25 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere con cura il supernatante e risciacquare il pellet con un millilitro di metanolo.
Ancora una volta, centrifuga a più di 13.000 volte G e 25 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver asciugato all'aria il pellet, riprenorlo in 50 microlitri di tampone A senza TCEP o qualsiasi agente riducente. Riservare 5 microlitri della soluzione per la quantificazione delle proteine BCA.
Dopo la quantificazione, aggiungere una quantità appropriata di tampone campione 4x Laemmli. Caricare il campione in un gel di pagina SDS. Utilizzare protocolli standard di trasferimento e rilevamento della separazione per l'blotting occidentale.
Per studiare lo stato di palmitoilazione delle proteine SynDIG, le frazioni di membrana P2 provenienti da cervelli di topo omogeneizzati sono state sottoposte al test APEGS. La separazione e il sondaggio con gli anticorpi hanno dimostrato che SynDIG1, SynDIG4 Prrt1 e Prrt2 sono palmitoilati nel cervello del topo. Lo scopo della precipitazione del metanolo cloroformio è quello di impedire a una sostanza chimica, come il NEM, di interferire con la fase successiva del protocollo.
Una corretta precipitazione del metanolo cloroformio rimuoverà le sostanze chimiche indesiderate riducendo al minimo la perdita di proteine. Questo metodo può essere applicato ai lysati cerebrali di topi di età diverse o provenienti da diverse regioni cerebrali per indagare le normative spazio-temporali della palmitoilazione.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo biochimico per lo studio dello stato di palmitoilazione delle proteine in lisati cerebrali di topo. Il saggio acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) consente l'analisi di proteine di membrana senza la necessità di una purificazione per affinità.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Chimica biochimica
- Modifica delle proteine
Sfondo
- La palmitoilazione è una modifica reversibile che comporta l'aggiunta di palmitato a residui di cisteina.
- Questa modifica svolge un ruolo cruciale nella funzione e nel localizzazione delle proteine di membrana.
- Comprendere la palmitoilazione può fornire informazioni su diversi processi neurologici.
- I metodi attuali per analizzare la palmitoilazione richiedono spesso passaggi complessi di purificazione.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo semplice per valutare lo stato di palmitoilazione delle proteine nei tessuti cerebrali.
- Eliminare la necessità di purificazione per affinità nell'analisi delle proteine di membrana.
- Fornire uno strumento ai ricercatori che studiano le modifiche post-traduzionali delle proteine in neuroscienze.
Metodi Utilizzati
- Omogeneizzazione del tessuto cerebrale di topo in un tampone specifico.
- Centrifugazione per separare il soprannatante contenente le proteine di interesse.
- Applicazione del saggio APEGS per determinare gli stati di palmitoilazione in base agli spostamenti della mobilità in gel.
- Utilizzo di anticorpi appropriati per rilevare le proteine bersaglio.
Risultati principali
- Il saggio APEGS identifica con successo gli stati di palmitoilazione di diverse proteine di membrana.
- Le variazioni nella mobilità su gel corrispondono al grado di palmitoilazione.
- Questo metodo fornisce un mezzo rapido ed efficiente per analizzare le modifiche post-traduzionali delle proteine.
- I risultati dimostrano la versatilità del saggio su diverse proteine.
Conclusioni
- Il saggio APEGS è uno strumento prezioso per lo studio della palmitoilazione nelle neuroscienze.
- Questo metodo semplifica l'analisi delle modifiche post-traduzionali delle proteine nei tessuti cerebrali.
- Applicazioni future potrebbero migliorare la nostra comprensione delle funzioni delle proteine di membrana.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione degli stati di palmitoilazione nelle proteine delle membrane cerebrali supporta la validazione degli bersagli per le vie di segnalazione sinaptica. Il saggio APEGS consente la determinazione quantitativa delle modificazioni lipidiche senza purificazione per affinità, riducendo la complessità del flusso di lavoro. Questo approccio fornisce un de-risking meccanicistico nella scoperta di farmaci per il sistema nervoso centrale, collegando le modificazioni post-traduzionali al traffico dei recettori e alla plasticità sinaptica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche determinando lo stato di palmitoilazione di proteine sinaptiche come SynDIG1 che regolano il traffico dei recettori AMPA.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale del bersaglio mediante spostamenti di mobilità su gel che si correlano agli stati di modificazione in lisati cerebrali nativi.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio identificando variazioni della palmitoilazione dipendenti dall'attività, rilevanti per lo sviluppo delle sinapsi eccitatorie.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive confermando la localizzazione dipendente dalla palmitoilazione di proteine di membrana.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione dei saggi attraverso risultati quantitativi di spostamento elettroforetico che riflettono la stechiometria della modificazione.
- Valore della piattaforma: Evidenzia la prontezza per lo screening mediante un metodo riutilizzabile applicabile a diverse proteine della famiglia SynDIG nel cervello del topo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Discute la rilevanza per le malattie collegando la palmitoilazione di SynDIG1 alla formazione delle sinapsi eccitatorie dipendente dall'attività, un processo alterato nei disturbi neuropsichiatrici.
- Valore operativo: Descrive la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, consentendo un'analisi spazio-temporale della palmitoilazione attraverso diverse regioni cerebrali e fasce d'età.
- Progresso corretto per il rischio: Si concentra sulla riduzione predittiva del rischio fornendo un output allineato ai biomarcatori per la funzione delle proteine sinaptiche.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio APEGS si inserisce nel percorso di scoperta, dalla validazione della proteina bersaglio alla valutazione preclinica, fornendo dati sullo stato di modificazione che informano sulla druggabilità del bersaglio e sull'attivazione del percorso metabolico.
- Biologia della Scoperta: Spiega come il metodo supporti il test delle ipotesi rivelando la regolazione dipendente dalla palmitoilazione delle proteine scaffold sinaptiche.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio attraverso spostamenti quantitativi della mobilità in gel che permettono il confronto degli stati di modificazione in diverse condizioni.
- Analisi: Mette in evidenza misurazioni come gli spostamenti delle bande in SDS-PAGE che aiutano i gruppi di lavoro a confrontare i livelli di palmitoilazione tra diversi gruppi sperimentali.
- Ricerca Translazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica consentendo la valutazione della palmitoilazione in modelli rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo Aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile per analizzare qualsiasi proteina di membrana espressa nel cervello, purché disponibile un anticorpo specifico.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli target attraverso la valutazione diretta degli stati di palmitoilazione in tessuti nativi.
- Valore operativo: Standardizzazione e scalabilità mediante un sistema di lettura basato su gel, compatibile con l'infrastruttura standard per la Western blot.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosecuzione o interruzione progettuale grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica riguardo la localizzazione proteica dipendente dai lipidi.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio, consentendo il rilevamento precoce di stati di modificazione che influenzano la funzione delle proteine sinaptiche e l'idoneità del target farmacologico.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze scientifiche richieste in biochimica delle proteine e tecniche di Western blotting.
- Le esigenze relative a strumentazione e infrastrutture analitiche includono centrifughe, sonicatori e sistemi di elettroforesi su gel.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi di lavoro per garantire passaggi riproducibili di precipitazione con cloroformio-metanolo e PEGilazione.
- Considerazioni sull'adattamento in diversi sistemi modello, come età diverse del topo o regioni cerebrali, per studiare la regolazione spazio-temporale.
- I limiti pratici includono la necessità di anticorpi di alta qualità e l'ottimizzazione del caricamento proteico per ottenere una risoluzione chiara degli spostamenti elettroforetici.
