Name: Ibridazione in situ per Sipunculus nudus Coelomic Fluid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Scopri l'ibridazione in situ per rilevare l'mRNA nel liquido celomico di Sipunculus nudus, una risorsa ittica importante. Questo metodo consente di visualizzare i pattern di espressione genica con precisione.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Young Scientists Fund della National Natural Science Foundation of China (Grant no.

La procedura animale è stata approvata dal Comitato per la cura e il benessere degli animali dell'Università di Huaqiao.
1. Preparazione Riboprobe
<ol><li>Design Primer<ol>
<li>Aprire il programma Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Copiare la sequenza dmrt1 (GenBank: MK182259) nella finestra della sequenza.</li>
		<li>Impostare la lunghezza del primer (23-25 bp), la temperatura di fusione (55-60 gradi centigradi) e il contenuto di G/C (40-60%). Fare clic su Scegli Primer. NOTA: la dimensione minima richiesta per la sonda RNA è di circa 500 bp. Le sonde più lunghe normalmente hanno una specificità maggiore.</li>
		<li>Aggiungere la sequenza di promotore di polimerasi t7 RNA (5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3,) a uno dei primer selezionati. Le sequenze di primer dmrt1 per ISH sono mostrate nella Tabella 1. NOTA: Per le sonde di rilevamento, il promotore di polimerasi t7 RNA si trova all'estremità 5' dei primer in avanti. Per le sonde antisense, il promotore di polimerasi in RNA T7 si trova all'estremità 5'dei primir invertiti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amplificazione PCR<ol>
<li>Posizionare i tubi di microfuge sul ghiaccio e preparare il seguente mix di reazione (per una reazione di 50 gradi): 1x miscela di polmeria di DNA Taq, 1 g di cDNA (che viene preparato da 100 gradi di liquido coelomico), 1 primer in avanti di 1 M, 1 m inverso e acqua priva di nucleani.</li>
		<li>Mescolare brevemente la reazione PCR con pipettaggio e centrifuga.</li>
		<li>Posizionare il tubo di reazione in un ciclore termico, e far funzionare la PCR utilizzando le seguenti condizioni: denaturazione iniziale a 95 s per 2 min seguita da 36 cicli di denaturazione a 95 gradi centigradi per 30 s, annealing a 55-60 gradi centigradi per 30 s, estensione a 72 s per 30 s e un'estensione finale a 72 s per 7 min. NOTA: La temperatura di annessione deve essere ottimizzata in base ai primer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificazione e verifica del prodotto PCR<ol>
<li>Caricare il 50 - L di miscela PCR direttamente su un 1% gel di agarose. Eseguire il gel di agarose a 150-180 V per 10 min in 0.5x TBE. Isolare i frammenti di DNA specifici dal gel di agarose dell'1%. NOTA: il DNA deve apparire come una singola banda e non come uno striscio.</li>
		<li>Purificare i frammenti di DNA utilizzando un kit di estrazione gel secondo il protocollo del produttore. Quantificare i prodotti purificati mediante spettrofotometria a una lunghezza d'onda di 260 nm.</li>
		<li>Verificare l'autenticità dei prodotti PCR mediante sequenziamento. NOTA: (Punto pausa) I prodotti PCR purificati possono essere conservati a -20 gradi centigradi per diversi mesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sintesi di Riboprobe<ol>
<li>Posizionare i tubi di microfuge senza RNase sul ghiaccio e aggiungere quanto segue al tubo di microfuge (per una reazione di 10 -L): 1x Digoxygenin RNA Labeling Mix, 1x buffer di trascrizione, 0,5L di inibitori di RNase, 1 l di polimerasi di RNA T7, 1 g di prodotto PCR e acqua senza RENas. Mescolare brevemente la reazione con pipettaggio e centrifuga. Incubare per 2 h a 37 .</li>
		<li>Aggiungete 2 -L di DNase I. senza RNase Mix. Mescolare brevemente la reazione con il pipettaggio e la centrifuga. Incubare per 15 min a 37 gradi centigradi.</li>
		<li>Aggiungere 2 :2 M EDTA (pH 8.0). Mescolare brevemente la reazione con pipettaggio e centrifuga.</li>
		<li>Aggiungere alla reazione di cui sopra 2,5 luna di 4 M liCl e 75 l di etanolo prefreddo. Mescolare bene. Lasciare agire per 30 min a -70 gradi centigradi.</li>
		<li>Centrifuga a 12.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Decant l'etanolo. Aggiungere 1 mL di etanolo prefreddo 70% (v/v) e lavare la precipitazione mescolando delicatamente.</li>
		<li>Centrifuga a 12.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Decant il 70% di etanolo e asciugare brevemente la precipitazione vicino a una lampada alcolica. Sciogliere la precipitazione aggiungendo 30 l di acqua senza RNase e mescolare delicatamente.</li>
		<li>Carico 2 - L di RNA sintetizzato su un 1% gel di agarose. Eseguire il gel di agarose a 180 V per 5-10 min in 0.5x TBE. Misurare la concentrazione dell'RNA etichettato utilizzando uno spettrofotometro ad una lunghezza d'onda di 260 nm.<ol>
<li>Utilizzare tubi di microfuge senza RNase e punte di filtro per evitare la contaminazione da RNase. NOTA: (Punto di pausa) Le sonde con etichetta digoxygenin possono essere conservate a -70 gradi centigradi per diversi mesi.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Raccolta di fluidi coelomici
<ol><li>Fissare il S. nudus sul tavolo di dissezione con perni. Aprire il corpo del S. nudus con piccole forbici autoclaved. Isolare il fluido coelomico con una pipetta.</li>
	<li>Raccogliere e trasferire 1 mL di liquido coelomico con una pipetta a vetrini al microscopio trattati con polid-lysina. Applicare il fluido coelomico in modo uniforme con una punta di pipetta. Asciugare all'aria i vetrini per 1 h a 37 gradi centigradi.</li>
</ol>3. Ibridazione in situ
<ol><li>Giorno 1<ol>
<li>Reidratare i vetrini in un barattolo di colorazione dei vetrini contenente 100 mL di 1x pirocarbonato dietilo trattato fosfato bufferizzato salina (DEPC-PBS). Reidratati 3 volte con 1x DEPC-PBS, 5 min per lavaggio con agitazione delicata.</li>
		<li>Permeabilizzare lo striscio del liquido coelomicomico per digestione con proteinasi K di 10 g/mL a temperatura ambiente per 5 min. Incubare i vetrini nel 4% di paraformaldeide (PFA) per 20 min per fermare la digestione. Lavare i vetrini in 1x DEPC-PBS con agitazione delicata per 5 min 3 volte.</li>
		<li>Aggiungere 50 -L di mix di ibridazione (HM) contenente il senso/antisense riboprobe sui vetrini e aggiungere uno slip di copertura.</li>
		<li>Aggiungere il buffer della scatola bagnata nella scatola bagnata. Mettere i vetrini nella scatola bagnata e sigillare bene con pellicola di paraffina. Ibridare durante la notte (almeno 16 h) a 60 gradi centigradi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Giorno 2<ol>
<li>Preriscaldare il tampone di lavaggio a 65 gradi centigradi. Immergere il vetrino nel barattolo di colorazione del vetrino contenente il buffer di lavaggio e lasciarlo riposare fino a quando il coperchio scivola automaticamente. Ci vogliono circa 5 min.</li>
		<li>Lavare 2 volte con il cuscinetto di lavaggio a 65 gradi centigradi, 30 min per lavaggio con agitazione delicata. Lavare 2 volte con 0,2x citrato saline-sodio (SSC) a 65 gradi centigradi, 30 min per lavaggio con agitazione delicata. Lavare 2 volte con tampone di acido maleico contenente Tween 20 (MABT) a temperatura ambiente, 30 min per lavaggio con agitazione delicata.</li>
		<li>Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 3-4 h nel buffer di blocco. Incubare i vetrini in una soluzione di frammenti anti-digossigenina-AP Fab da 1 mL diluita a 1/5000 con il buffer di blocco a 4 gradi durante la notte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Giorno 3<ol>
<li>Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare brevemente i vetrini in MABT. Lavare 4 volte con MABT a temperatura ambiente, 25 min per lavaggio con agitazione delicata.</li>
		<li>Incubare i vetrini con cuscinetto di fosfofoso alcalina a temperatura ambiente 3 volte, 5 min per lavaggio. Rimuovere il buffer di fosfofosi alcalina e aggiungere 1 mL di 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfato (BCIP)/nitro blue tetrazolium (NBT) soluzione di colorazione. Tenere le diapositive al buio.</li>
		<li>Osservare periodicamente la reazione del colore al microscopio ottico. Quando il colore è completamente sviluppato (tempo di reazione nell'intervallo di 1-4 h), lavare i vetrini 2 volte con MABT a temperatura ambiente, 5 min per lavaggio con agitazione delicata.</li>
		<li>Lavare 2 volte con soluzione di arresto a temperatura ambiente, 15 min per lavaggio con agitazione delicata. Incubare i vetrini in metanolo per rimuovere la macchia in eccesso, a temperatura ambiente per 30 min. Secondo il colore di sfondo, il lavaggio del metanolo può essere fatto 2 o 3 volte e il tempo di decolorazione può essere esteso.</li>
		<li>Lavare 2 volte con MABT a temperatura ambiente, 5 min per lavaggio con agitazione delicata. Trasferire le diapositive su una carta da filtro fresca. Aggiungere 50 - L di glicerolo. Aggiungere i copricopertine e osservare microscopicamente. NOTA: la composizione della soluzione è riportata nella tabella 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Tsai, C. J., Harding, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization.</a> Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).</li>
<li>Koshiba-Takeuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+and+section+in+situ+hybridization+in+mouse+embryos+for+detecting+mRNA+expression+and+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization.</a> Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).</li>
<li>Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+on+mouse+paraffin+sections+using+DIG-labeled+RNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li>
<li>Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wholemount+in+situ+hybridization+for+Astyanax+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).</li>
<li>Abler, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput+in+situ+hybridization+method+to+characterize+mRNA+expression+patterns+in+the+fetal+mouse+lower+urogenital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).</li>
<li>Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+genetic+diversity+and+population+structure+of+Sipunculus+nudus+as+revealed+by+mitochondrial+COI+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences.</a> Biochemical Genetics. 47, 884(2009).</li>
<li>Lemer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluating+the+phylogeny+of+Sipuncula+through+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Phylogenetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).</li>
<li>Jiang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioprotective+effects+of+Sipunculus+nudus+L.+polysaccharide+combined+with+WR-2721%2C+rhIL-11+and+rhG-CSF+on+radiation-injured+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice.</a> Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).</li>
<li>Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+anti-nociceptive+activities+of+Sipunculus+nudus+L.+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract.</a> Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).</li>
<li>Ying, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+coelomocytes+in+the+sipunculid+Phascolosoma+esculenta%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta.</a> Micron. 41, 71-78 (2010).</li>
<li>Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dmrt1%2C+a+gene+related+to+worm+and+fly+sexual+regulators%2C+is+required+for+mammalian+testis+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation.</a> Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).</li>
<li>Kopp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dmrt+genes+in+the+development+and+evolution+of+sexual+dimorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism.</a> Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).</li>
<li>Wu, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testicular+dmrt1+is+involved+in+the+sexual+fate+of+the+ovotestis+in+the+protandrous+black+porgy%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy.</a> Biology of Reproduction. 86, 41(2012).</li>
<li>Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+analysis+of+peanut+worms+transcription+factor+dmrt1%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Hydrobiologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1.</a> Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+axonally+localized+mRNAs+in+brain+sections+using+high-resolution+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52799(2015).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361(1993).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Studi precedenti hanno dimostrato che ish è adatto per rilevare più RNA bersaglio16,17,18. In questo protocollo, abbiamo descritto un metodo ISH ad alta risoluzione per rilevare l'mRNA nel fluido coelomico e sottolineare le condizioni di ibridazione ottimizzate nel sipunculus nudus. I segnali evidenti di dmrt1 che abbiamo osservato hanno dimostrato la riuscita applicazione di questo protocollo nella rilevazione...

ISH, utilizzando una sonda di acido nucleico etichettata per rilevare il DNA specifico o la sequenza di RNA di interesse, è un metodo utile per descrivere il modello di espressione spaziale dei geni bersaglio nei tessuti morfologicamente conservati1,2,3. Normalmente, la sequenza bersaglio viene generata dalla reazione a catena della polimerasi (PCR), e quindi utilizzata come modello per sintetizzare la sonda RNA antisense/sense etichettata con digossigenina uridina-5'-triplodiato. I campioni vengono fissati e permeabilizzati prima dell'incubazione con riboprobe. Dopo aver lavato via la sonda in eccesso, l'ibridazione viene visualizzata dall'immunosofochimica utilizzando un anticorpo anti-digoxygenina, che è alcalino fosforo coniugato3,4,5,6.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; ordine Sipunculida: Sipunculidae) è un verme marino non segmentato, coelomate e bilateralmente simmetrico7,8. Sipunculus nudus è una specie cosmopolita ampiamente distribuita nelle acque costiere tropicali e temperate. È anche un'importante risorsa di pesca marina nel sud della Cina a causa dei suoi alti valori nutrizionali e medicinali9,10. Tuttavia, Sipunculus nudus in biologia molecolare è ancora agli inizi. Per comprendere appieno il ruolo biologico dei geni, lo studio dei modelli di espressione dei geni a una risoluzione cellulare è di grande interesse. Nell'organismo non modello Sipunculus nudus, il metodo ISH, che è un metodo ideale per rilevare i modelli di espressione dei geni, non è ancora stato stabilito. Il suo fluido coelomico contiene diversi tipi di cellule, tra cui granulociti, cellule dell'urna, cellule vescicolari, cellule germinali, eritrociti, ecc11. Il doppio sesso/mab-3 correlato fattore di trascrizione-1 (dmrt1), utilizzato come gene rappresentativo in questo metodo, è un regolatore trascrizionale altamente conservato di determinazione sessuale e differenziazione nella maggior parte delle specie che vanno dagli invertebrati ai mammiferi12,13. In una serie di specie (ad es. porgy nero, ecc.) 14, dmrt1 è stato espresso nelle cellule di Sertoli, che circondano le cellule germinali, la cui funzione è simile alle cellule trofoblaste di Sipunculus nudus. Pertanto, abbiamo ipotizzato che il dmrt1 di Sipunculus nudus sia espresso in cellule trofoblaste di spermatozeugmata, e il risultato del metodo ISH ha chiaramente confermato l'ipotesi.
Questo protocollo descrive per la prima volta ISH, con sonde antisenso/mRNA antisenso etichettate con digossigenina, per determinare i modelli di espressione dell'mRNA nel suo striscio fluido coelomico. Vengono fornite le condizioni di reazione ottimali, che consentono una visualizzazione molto sensibile dell'espressione dell'mRNA ad alta risoluzione. Il metodo ISH sviluppato potrebbe essere potenzialmente applicato in più specie di Sipunculida diverse da Sipunculus nudus.

<table><tbody><tr><td>Agarosio</td><td>Biowest</td><td>111860</td><td></td></tr><tr><td>Anti-digossigenina-AP Fab frammenti Roche</td><td></td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Kit per lo sviluppo del colore della fosfatasi alcalina BCIP / NBT</td><td>Beyotime</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma</td><td>B2064</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Acido</td> <td>citricoSinopharm Reagente Chimico Co.</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>Reagente chimico Sinopharm</td> <td>trisodico acido citrico</td> Co.<td>4/3/6132</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Beyotime</td><td>FCGF60</td><td></td></tr><tr><td>Formamide deionizzata</td><td>Amresco</td><td>12/7/1975</td><td></td></tr><tr><td>Dietil pirocarbonato, DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>Sostanza nociva</td></tr><tr><td>Digossigenina (DIG) RNA Labeling Mix Roche</td><td></td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I, RNasi priva</td> di <td>18047019</td><td></td><td></td></tr> <tr>Invitrogen<td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Imaging su gel per elettroforesi</td><td>Bio-Rad</td><td>Universal Hood III</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel</td><td>Omega</td><td>D2500</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio per elettroforesi su gel</td><td>Beijing Liuyi Instrument Factory</td><td>DYY-6C</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>G5417</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma</td><td>8/1/9041</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Reagente chimico Co.</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sinopharm Reagente chimico Co.</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma</td><td>203637</td><td></td></tr><tr><td>Acido maleico</td><td>Sinopharm Reagente chimico Co.</td><td>110-16-7</td><td></td></tr><tr><td>Reagente chimico Sinopharm al</td> <td>metanolo</td> Co.<td>67-56-1</td><td>Sostanza nociva</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Biofount</td><td>JT0001</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sinopharm Reagente chimico Co.</td><td>1310-73-2</td><td>Film corrosivo</td></tr><tr><td>di paraffina</td><td>Bemis Company, Inc.</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide, PFA</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Sostanza nociva</td></tr><tr><td>PCR Strumento Life</td><td>Technology</td><td>Proflex</td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td>Deli</td><td>16</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta</td><td>Eppendorf</td><td>plus G</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio trattati con poli-D-lisina</td><td>Liusheng VER_A01</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma</td><td></td><td></td>SRE0005</tr><tr><td>acqua priva di RNasi</td><td>HyClone</td><td>SH30538. 02</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi</td><td>Roche</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>S. nudus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero di pecora</td><td>Beyotime</td><td>C0265</td><td></td></tr><tr><td>Barattolo di colorazione per vetrini</td><td>Beyotime</td><td>FG010</td><td></td></tr><tr><td>Scatola per la conservazione dei vetrini</td><td>Beyotime</td><td>FBX011</td><td></td></tr><tr><td>Piccole forbici autoclavate</td><td>Shuanglu</td><td>sku_8330</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometri</td><td>Thermo Fisher</td><td>NanoDrop 2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polimerasi</td><td>Roche</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polimerasi mix (2X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>RES3098T</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10109517001</tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Zhengzhou Grande Muraglia Scientifica Industriale</td><td>HH-S2</td><td></td></tr></tbody></table>

ibridazione in situ per sipunculus nudus coelomic fluid

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

L'ibridazione in situ (ISH) è una tecnica molto informativa per presentare modelli di distribuzione cellulare di geni specifici (ad esempio, mRNA e ncRNA) nei tessuti. Il verme sipunculid Sipunculus nudus è una risorsa di pesca cruciale in quanto ha alti valori nutrizionali e medicinali. Attualmente, la ricerca sulla biologia molecolare di Sipunculus nudus è ancora agli inizi. Lo scopo di questo articolo è quello di sviluppare un metodo sensibile per localizzare mRNA specifico nel liquido coelomico del nucleo sipunculus. Il protocollo include passaggi dettagliati di ISH, tra cui l'antisensesità con etichette di digossigenina e la preparazione del risonante senso, la raccolta e la preparazione della sezione dei fluidi coelomici, l'ibridazione specifica di riboprobe, l'incubazione degli anticorpi, i trattamenti di post-colorazione. Vengono dimostrati i risultati rappresentativi ottenuti da un esperimento riuscito con questo metodo. Il protocollo dovrebbe essere applicabile anche ad altre specie di Sipuncula.

Una sintesi dei passaggi coinvolti in ISH è illustrata nella Figura 1. Antisense e corrispondenti rionde senso per dmrt1 sono stati sintetizzati da prodotti PCR amplificati dai cDNA fluidico coelomici. L'autenticità dei prodotti PCR è stata verificata mediante sequenziamento diretto. I riboprobe sono stati sintetizzati utilizzando polimerasi T7 RNA secondo i protocolli del produttore e un rapporto precedente4 con alcune modifiche minori. I segnali rappresenta...

Questo protocollo descrive un efficace approccio di ibridazione in situ per rilevare i livelli di espressione dell'mRNA e i modelli spaziali dei geni bersaglio nel fluido coelomico del nudus Sipunculus.

Ibridazione in situ per Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

L'ibridazione in situ è una tecnica molto istruttiva per presentare modelli di espressione di mRNA e IncRNA di geni specifici nei tessuti. Il nostro scopo in questo articolo è quello di sviluppare un metodo sensibile per rilevare la localizzazione specifica dell'mRNA nel fluido coelomico di Sipunculus nudus, che è una risorsa di pesca cruciale. Abbiamo presentato i risultati rappresentativi ottenuti dai nostri esperimenti riusciti utilizzando questo metodo.Si spera che il nostro metodo si applichi ad altre specie di Sipuncula per identificare i modelli di espressione dell'mRNA specifico e dell'IncRNA nel fluido coelomico. Fissare il Sipunculus nudus sulla tabella di dissezione. Apri il corpo del Sipunculus nudus con piccole forbici autoclavate.Quindi raccogliere e trasferire il fluido coelomico con pipetta su vetrini al microscopio trattati con poli-D-lisina, spalmabili leggermente. Asciugare all'aria gli scivoli per un'ora a 37 gradi Celsius. Lavare gli scivoli con DEPC-PBS per tre volte, cinque minuti per lavaggio con delicata agitazione.Scolare il PBS, aggiungere la soluzione proteicaa K sulle diapositive per cinque minuti a temperatura ambiente. Scolare la soluzione di proteinasi K. Aggiungere la soluzione PFA sulle diapositive per 20 minuti a temperatura ambiente.Scolare la soluzione PFA. Lavare gli scivoli con DEPC-PBS per tre volte, cinque minuti per lavaggio con delicata agitazione. Scolate il PBS.Aggiungere 50 microliter riboprobe. Aggiungere un coverslip. Mettere gli scivoli nella scatola bagnata e sigillare bene con pellicola di paraffina.Ibridare durante la notte a 60 gradi Celsius. Immergere le diapositive nel tampone di lavaggio e lasciarle riposare fino a quando il coverslip scivola automaticamente. Lavare gli scivoli con il tampone di lavaggio preriscaldato per due volte a 65 gradi Celsius, 30 minuti per lavaggio con delicata agitazione.Lavare gli scivoli con la soluzione SSC preriscaldata per due volte a 65 gradi Celsius, 30 minuti per lavaggio con delicata agitazione. Lavare gli scivoli con la soluzione MABT per due volte a temperatura ambiente. 30 minuti per lavaggio con delicata agitazione.Scolare il MABT. Aggiungere il buffer di blocco. Incubare i vetrini a temperatura ambiente per tre o quattro ore.Svuotare il buffer di blocco. Aggiungere l'anticorpo, incubare i vetrini a quattro gradi Celsius durante la notte. Scolare la soluzione anticorpale.Lavare gli scivoli con la soluzione MABT per quattro volte, 25 minuti per lavaggio con delicata agitazione. Scolare il MABT. Aggiungere il tampone di fosfatasi alcalina per tre volte, cinque minuti per incubazione.Rimuovere il tampone di fosfatasi alcalina. Aggiungere la soluzione di colorazione BCIP-NBT. Tenere le diapositive al buio.Il tempo di colorazione varia da minuti a ore, anche durante la notte, il che dipende dall'intensità del segnale. Lo stato di colorazione deve essere controllato più frequentemente all'inizio della colorazione. Ad esempio, con un intervallo di diversi minuti e diverse ore al più tardi della colorazione.Il tempo di controllo dovrebbe essere il più breve possibile per evitare l'introduzione di segnalazioni di fondo elevate a causa dell'esposizione alla luce. Vengono mostrati i segnali rappresentativi dell'ibridazione in situ. L'ibridazione in situ del liquido coelomico Sipunculus nudus con riboprobe anti-senso che prende di mira dmrt1 indica che la colorazione viola concentrata nelle cellule trophoblast degli spermatozeugmata, figura 2A e B.Sense riboprobe per dmrt1 non ha rilevato alcun segnale di ibridazione, figura 2C.Dopo aver visto questo video, si avrebbe un'ottima comprensione di come visualizzare i modelli di espressione dell'mRNA target o dell'IncRNA nel fluido coelomico di Sipunculus nudus.

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