Analisi dell'amplificazione isotermica mediata dal ciclo di trascrizione inversa (RT-LAMP) Per il rilevamento specifico e rapido del virus del lago Tilapia
18 maggio 2020
Vi presentiamo un saggio RT-LAMP per la rilevazione di TiLV nel pesce tilapia utilizzando strumenti semplici per un periodo di tempo relativamente breve rispetto alle tecniche RT-PCR convenzionali. Questo protocollo può aiutare a controllare la diffusione epidemica di TiLVD, soprattutto nei paesi in via di sviluppo.
Il virus del lago Tilapia è un virus emergente e patogeni contagiosi, che causano un'elevata mortalità nella tilapia e nelle sue specie ibride. Poiché la tilapia è una delle principali fonti proteiche per molti paesi in via di sviluppo, la nuova infezione da virus ha un grande impatto sull'acquacoltura della tilapia e minaccia anche la sicurezza alimentare mondiale. Lo sviluppo di un metodo rapido, accurato e sensibile per rilevare il virus nel tessuto ittico, aiuterà il controllo della malattia e ridurrà l'impatto del virus.
In questo video, mostreremo l'amplificazione isotermica mediata dal ciclo di trascrizione inversa, o saggio RT-LAMP, per il rilevamento rapido del virus del lago tilapia nei campioni di pesce. Seconda parte, estrazione dell'RNA. In primo luogo, aggiungere 3250 milligrammi di tessuto epatico in un tubo sterile di microcentrifugo da 1,5 millilitri, contenente da 600 a 1000 microlitri acido guanidinium-fenolo base reagente, e tritare fino a omogeneo.
Centrifuga a 10.000 RCF per 30 secondi e trasferisci il supernatante in un nuovo tubo. Aggiungere un volume uguale di 95% di etanolo al tubo e mescolare accuratamente. Trasferire la soluzione in una colonna di spin, posta in un tubo di raccolta, quindi centrifugare a 10.000 RCF per 30 secondi.
Scartare il flusso e trasferirlo in un nuovo tubo di raccolta. Aggiungere 400 microlitri di RNA PreWash nella colonna e centrifugare a 10.000 RCF per 30 secondi. Scartare il flusso e ripetere questo passaggio.
Aggiungere 700 microliter RNA Wash Buffer nella colonna e centrifugare a 10.000 RCF per due minuti. Successivamente, trasferire la colonna in un tubo sterile di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Infine, elute RNA nella matrice di colonna con un 100 microlitro, acqua senza nucleasi e centrifuga a 10.000 RCF per 30 secondi.
Parte terza, design del primer. PrimerExplorer Versione 4 è lo strumento bioinformatico più comune per la progettazione di efficienti primer LAMP, o RT-LAMP, in cui buoni manuali per il software sono disponibili sul loro sito web. Qui, quattro primer specifici, composti da due primer interni e due esterni, sono stati progettati per riconoscere sei regioni distinte nel segmento 3 di TiLV, originarie della Thailandia.
Dopo aver inserito il sito web, dove il link viene mostrato nel video, fare clic su PrimerExplorer V4. Scegliere il file contenente la sequenza del segmento 3 di TiLV, in formato FASTA, recuperato dal numero di accesso a GenBank, KX631923, o dal virus del lago Tilapia TV1 segmento 3, quindi fare clic sul pulsante Primer Design. Una volta cliccato sul pulsante Genera, il software e', e i risultati verranno mostrati. Dopo aver ottimizzato le sequenze per l'amplificazione LAMP, in totale, per questo studio sono state selezionate una coppia di primer esterni e due coppie di primer interni, per rilevare l'infezione da TiLV.
Questo set di primer è mostrato qui. Quarta parte, dimostrazione di RT-LAMP. Il master mix per RT-LAMP specifico per il virus del lago tilapia, comprende le seguenti sostanze chimiche.
Preparare una miscela master utilizzando le sostanze chimiche mostrate nella tabella. Erogare 22 microlitri di master mix in un tubo sterile a microcentrifugo da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungere tre microlitri di modello di RNA nel tubo di reazione.
Per il controllo negativo, utilizzare acqua distillata invece di materiali RNA e mescolare bene. Incubare le reazioni a 65 gradi Celsius per 60 minuti, seguite da 80 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'incubazione per 30 minuti, i cambiamenti calorimetrici sono osservati visivamente da occhi nudi.
Se del caso, possiamo confermare i risultati del saggio RT-LAMP, eseguendo l'elettroforesi gel su gel di agarosio all'1,5%, con una costante di 100 Volt, per 40 minuti, in base alla quale una scala del DNA a misura molecolare di una chilobase viene caricata insieme come marcatore per determinare la dimensione del frammento. Parte cinque, risultati rappresentativi e interpretazione. Dopo l'incubazione per 30 minuti, la reazione di fluorescenza del grano che suggerisce l'amplificazione positiva del TiLV nei tessuti ittici, è stata ovviamente osservata in campioni infetti sotto la luce UV ad una lunghezza d'onda di 365 nanometri, mentre quelli di controllo negativo avevano una soluzione chiara e leggermente incolore.
Di conseguenza, l'amplificazione dei prodotti RT-LAMP è stata confermata sull'elettroforesi del gel di agarosio, mostrando varie dimensioni delle amplificazioni multiple delle ripetizioni del DNA invertito, formando strutture ad anello stelo sotto lampada UV in campioni infetti da TiLV, mentre non sono state visualizzate bande nei pozzi del controllo negativo, dove i risultati erano conformi a quelli del saggio RT-LAMP. Quindi, per ridurre la diffusione del virus del lago tilapia, uno screening immediato di questi pesci infetti, usando un metodo diagnostico efficace, è una delle chiavi importanti. Pertanto, il test RT-LAMP di nuova sviluppo dovrebbe offrire uno strumento diagnostico rapido e sensibile da applicare nel processo di misura della biosicurezza.
Il saggio potrebbe essere utilizzato sia in laboratorio che in loco. Speriamo che venga implementato il metodo per migliorare la popolazione di pesci infetti che potrebbe portare alla riduzione della diffusione del virus del lago tilapia.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo presenta un saggio RT-LAMP rapido per la rilevazione del virus del lago del tilapia (TiLV) nei pesci tilapia, offrendo un'alternativa più veloce ai metodi convenzionali di RT-PCR. Il protocollo ha lo scopo di contribuire al controllo della diffusione del TiLV, in particolare nei paesi in via di sviluppo dove il tilapia rappresenta una fonte proteica fondamentale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Virologia
- Acquacoltura
- Rilevamento di patogeni
Sfondo
- Il virus del lago del tilapia è un agente patogeno contagioso che causa un'elevata mortalità nei tilapia.
- Il virus rappresenta una minaccia significativa per l'acquacoltura del tilapia e per la sicurezza alimentare globale.
- I metodi attuali di rilevamento sono spesso lunghi e complessi.
- Un metodo di rilevamento rapido è essenziale per un efficace controllo della malattia.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo rapido e sensibile per rilevare il TiLV nei tessuti dei pesci.
- Ridurre l'impatto del TiLV sull'acquacoltura del tilapia.
- Fornire una soluzione pratica per la gestione delle malattie nei paesi in via di sviluppo.
Metodi Utilizzati
- Test di amplificazione isotermica mediata da ciclo di trascrizione inversa (RT-LAMP).
- Estrazione di RNA da tessuto epatico di tilapia.
- Utilizzo di strumenti semplici per analisi rapide.
- Confronto con tecniche convenzionali di RT-PCR.
Risultati principali
- Il saggio RT-LAMP consente un rilevamento rapido e accurato del TiLV.
- Questo metodo è più semplice e veloce rispetto alla tradizionale RT-PCR.
- Può essere implementato in contesti con risorse limitate.
- Il protocollo potrebbe contribuire a mitigare la diffusione del TiLV nelle popolazioni di tilapia.
Conclusioni
- Il saggio RT-LAMP è uno strumento promettente per la rilevazione del TiLV.
- Supporta gli sforzi di controllo delle malattie nell'acquacoltura.
- Ulteriori studi potrebbero migliorarne l'applicazione in diversi contesti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale
Il rilevamento rapido e specifico di patogeni virali emergenti come il virus del lago del tilapia (TiLV) è fondamentale per proteggere la produzione ittica e la sicurezza alimentare globale. Il saggio RT-LAMP consente un'identificazione tempestiva dell'infezione da TiLV nei tessuti dei pesci, favorendo interventi precoci e misure di biosicurezza. Questo approccio riduce la dipendenza da metodi molecolari laboriosi e facilita lo screening su larga scala in contesti con risorse limitate.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente il rilevamento specifico dell'RNA di TiLV, supportando la conferma del bersaglio virale nei tessuti dell'ospite infetto.
- Valore operativo: Fornisce un metodo rapido di amplificazione isoterma che non richiede apparecchiature per il termociclaggio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture visive o fluorometriche entro 60 minuti, consentendo una rapida valutazione della presenza virale.
- Valore operativo: Richiede strumentazione minima e può essere utilizzato in ambienti di campo o di laboratorio per lo screening ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra l'applicabilità a tipi di campioni non letali come il muco, consentendo il monitoraggio longitudinale del carico virale.
- Valore operativo: Permette studi longitudinali in modelli animali senza sacrificare gli animali, migliorando la progettazione sperimentale e riducendo la variabilità.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio RT-LAMP si inserisce nel percorso della scoperta fornendo uno strumento di rilevamento utilizzabile dopo la generazione di ipotesi e prima degli studi su interventi terapeutici o profilattici.
- Biologia della scoperta: Facilita la validazione della presenza virale in campioni biologici, supportando studi meccanicistici sulla patogenesi del TiLV.
- Screening: Permette una valutazione rapida dello stato di infezione in coorti di campioni, migliorando la prontezza del saggio per la valutazione di composti antivirali.
- Analisi: Fornisce risultati quantitativi o semi-quantitativi mediante turbidità visiva, fluorescenza o elettroforesi su gel, agevolando l'analisi comparativa.
- Ricerca traslazionale: Supporta la continuità dalla rilevazione iniziale alla valutazione preclinica di strategie terapeutiche in modelli di malattia pertinenti.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una piattaforma modulare per il rilevamento di acidi nucleici adattabile ad altri patogeni emergenti nei sistemi di acquacoltura o allevamento.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione dell'obiettivo grazie al rilevamento specifico e sensibile dell'RNA virale.
- Valore operativo: Offre compatibilità con test effettuati direttamente presso il paziente senza necessità di attrezzature, con risultati leggibili a occhio nudo o mediante semplice transilluminatore.
- Valore strategico: Riduce il tempo necessario per ottenere i risultati nei test di screening delle infezioni, consentendo decisioni più rapide su prosegui/non prosegui nel corso dello studio.
- Impatto sul portafoglio: Migliora la valutazione del rischio nei programmi preclinici fornendo dati affidabili sullo stato di infezione, riducendo le variabili di confondimento.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biologia molecolare e progettazione di primer per saggi basati sulla LAMP.
- Necessita dell'accesso a kit per l'estrazione dell'RNA, bagnomaria o blocco termico e strumenti di visualizzazione (ad esempio, luce UV o elettroforesi su gel).
- Richiede la standardizzazione dei protocolli di preparazione del campione tra diversi tipi di tessuto (ad esempio, fegato, muco) per ottenere risultati riproducibili.
- Comporta la validazione della specificità del saggio nei confronti di patogeni correlati per evitare falsi positivi.
- È limitato dalla necessità di set di primer ottimizzati e dall'inibizione potenziale derivante da matrici biologiche complesse.
