Metodi standardizzati per misurare l'induzione della risposta agli urti di calore in Caenorhabditis elegans

Qui, vengono presentati protocolli standardizzati per valutare l'induzione della risposta agli shock termici (HSR) in Caenorhabditis elegans utilizzando RT-qPCR a livello molecolare, reporter fluorescenti a livello cellulare e termorecupero a livello di organismo.

La risposta allo shock termico è una via essenziale di risposta allo stress cellulare che mantiene la proteostasi citoplasmatica e può essere caratterizzata a livello molecolare, cellulare e organismico negli elegani marini. Presentiamo una serie di protocolli standardizzati e best practice che generano una robusta induzione della risposta agli shock termici negli elegans marini al fine di contribuire a migliorare la riproducibilità nel campo della risposta agli urti termici. Mostriamo che la termo tolleranza, un saggio organismico comunemente usato non dipende dalla risposta allo shock termico.

Invece, si consiglia di utilizzare il recupero termico, un saggio organismo che dipende dalla risposta agli shock termici. La risposta allo shock termico si attenua con l'inizio della deposizione delle uova. Pertanto, la tempistica dello sviluppo è una variabile critica che deve essere contabilita negli esperimenti di risposta agli shock termici.

Iniziare creando una popolazione di worm sincronizzata. Utilizzare un piccone di filo di platino per trasferire circa 10 vermi adulti gravidi su un piatto fresco. Assicurati di rimuovere eventuali uova o larve che potrebbero essere state trasferite con gli adulti.

Lasciare che i vermi depongono le uova per un'ora, quindi rimuovere gli adulti dal piatto. Mantenere i vermi sincronizzati a 20 gradi Celsius fino allo stadio di sviluppo desiderato, tenendo conto del fatto che i tempi di sviluppo variano a seconda dello sforzo e della temperatura alla quale i vermi vengono sollevati. Quando i vermi sono pronti per lo shock termico, avvolgere le piastre con pellicola di paraffina e utilizzare un rack per provette con un peso di piombo per immergerli in un bagno d'acqua circolante a 33 gradi Celsius per un'ora.

Recuperare i piatti dal bagno d'acqua e asciugarli con un tovagliolo di carta. Rimuovere il film di paraffina e consentire ai vermi di recuperare a 20 gradi Celsius per sei-24 ore, che sarà un tempo sufficiente per la sintesi della GFP. Per preparare le diapositive per l'imaging, posizionare uno scivolo al microscopio tra altre due diapositive che hanno una striscia di nastro da laboratorio su di esse.

Fare una soluzione di agarosio al 3% in acqua e scaldarla nel microonde fino a quando gli agarosi si dissolvono. Quindi utilizzare una pipetta da un millilitro per posizionare circa 150 microlitri dell'agarosio al centro dello scivolo. Coprire immediatamente la diapositiva con una diapositiva vuota, posizionandolo perpendicolarmente in modo che poggia sul nastro di laboratorio, quindi rimuoverlo con cura.

Per immobilizzare i vermi, aggiungere una piccola goccia di levamisolo millimolare, un tampone M9, al centro del tampone di agarosio e trasferire 10 vermi nella goccia usando un piccone di filo di platino. Facoltativamente, stendere la levamisolo verso l'esterno del tampone di agarosio e allineare i vermi con il piccone quando diventano paralizzati. Coprire i vermi con uno slittamento di copertura e immaginirli il prima possibile utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Per eseguire un test di termorecovery, sincronizzare i vermi e mantenerli a 20 gradi Celsius fino allo stadio di sviluppo desiderato. Quindi scaldarli per sei ore. Rimuovere le piastre dal bagno d'acqua e consentire loro di recuperare a 20 gradi Celsius per 48 ore.

Dopo il recupero, contare il numero di vermi che possono immediatamente aragosta dopo la stimolazione meccanica senza movimento a scatti o paralisi. Per visualizzare l'induzione della risposta agli shock termici a livello cellulare, sono stati analizzati due ceppi di elegans marini reporter fluorescenti. Nei campioni di controllo negativi senza shock termico, il reporter hsp-16.2 ha mostrato una normale fluorescenza automatica, ma il reporter hsp-70 aveva una fluorescenza costitutiva nel muscolo depressore anale.

Dopo un'ora di shock termico, è stata osservata una robusta fluorescenza in entrambi i giornalisti quando la RNAi è stata utilizzata per abbattere l'hsf-1 prima di misurare l'induzione del reporter. La fluorescenza di entrambi i ceppi è stata gravemente ridotta, indicando che questi giornalisti dipendono dall'HSF-1. Per quantificare l'induzione della risposta agli shock termici a livello molecolare, sono state misurate due proteine indigene di shock termico con RT CHIAVE PCR.

È stato scoperto che uno shock termico di un'ora e 33 gradi Celsius provoca un aumento di oltre 2.000 volte l'espressione relativa dei due geni dello shock termico. Un saggio di termorecupero ha dimostrato che l'esposizione a uno shock termico di sei ore ha portato a una diminuzione del 20% dei vermi con movimento normale dopo un recupero di 48 ore. Il knockdown di hsf-1 causò una drastica diminuzione del movimento normale, con oltre il 95% dei vermi che mostravano movimento a scatti o paralisi dopo essere stati spronato.

Al contrario, il knockdown di hsf-1 non ha avuto un effetto significativo sui risultati di un saggio di termo tolleranza, in cui i vermi sono esposti a una temperatura continua di 35 gradi Celsius e la percentuale di vermi vivi viene misurata in vari punti di tempo. Quando si esegue questa tecnica per la prima volta, assicurarsi di avvolgere le piastre con pellicola di paraffina due volte per evitare che l'acqua entri nelle piastre e rovini l'esperimento. I test molecolari possono essere estesi in analisi genomiche usando RNA-seq.

Possono essere inclusi altri saggi organismici colpiti dalla risposta allo shock termico, come la durata della vita. La capacità unica di correlare i test di risposta agli shock termici molecolari, cellulari e organismici negli elegani marini si è dimostrata inestimabile per la comprensione del ruolo di questo percorso nello sviluppo e nelle malattie.