Name: Misurazione della risposta dei farmaci in tempo reale nelle fette di tessuto tumorale organotipico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Scopri come misurare la risposta dei farmaci in tempo reale su fette di tessuto tumorale organotipico. Questo metodo consente screening ad alto rendimento su campioni derivati da pazienti per accelerare lo sviluppo preclinico in oncologia.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] e dalla Fondazione Sidney Kimmel [Kimmel Scholar Award], lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). Ringraziamo la dott.ssa Alana Welm (Università dello Utah) per aver fornito il tumore al PDX del cancro al seno. Vorremmo anche ringraziare il personale di Comparative Medicine, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) per la manutenzione del modello PDX e dei membri del laboratorio Gujral per discussioni utili. N.N.A è supportato dalla JSPS Overseas Research Fellowship e dal Interdisciplinary Training Grant della FHCRC. A.J.B. è supportato dal Chmoosome Metabolism and Cancer Training Grant della FHCRC.

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati effettuati in base alle raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dell'Animal Welfare Act e delle linee guida dei National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali nella ricerca biomedica.
1. Preparazione delle fette di tessuto tumorale
<ol><li>Preparare la coltura della fetta di tessuto (TSC) media seguendo la ricetta nella tabella 1. Filtrare il mezzo con un'unità filtro a vuoto da 0,45 m per sterilizzare.</li>
	<li>Aliquota 250 L di TSC medio per pozzo per un 24 pozzetto, o 1 mL di mezzo per pozzo per un 6 pozzetti. Conservare la piastra in un'incubatrice umidificata di 37 gradi, 5% co 2, finoall'uso. NOTA: Il mezzo e gli integratori possono essere ottimizzati a seconda dei tipi di tessuto e degli obiettivi sperimentali. La quantità di mezzo dovrebbe essere appena sufficiente per immergere la membrana porosa di un inserto di coltura. Non superare il livello della membrana. Regolare il volume medio se il livello medio è troppo basso o troppo alto. Se i ricercatori stanno testando agenti immunomodulatori, si consiglia il completamento del mezzo con IL-210.</li>
	<li>Se si utilizza tessuto tumorale derivato dai topi, eutanasia i topi con una procedura raccomandata, sanificare la pelle esposta dei topi spruzzando 70% etanolo e sezionare i tumori con tecniche asettiche. Conservare il tessuto tumorale in un tubo contenente la soluzione di sale bilanciato di Hank (HBSS) ghiacciata.</li>
	<li>Se si utilizzano tessuti tumorali freschi del paziente, conservare in HBSS ghiacciato per breve termine, o ghiacciato Belzer University of Wisconsin (UW) soluzione per lo stoccaggio a lungo termine (fino a 24 h) per preservare la vitalità dei tessuti. NOTA: le fette di un tessuto PDX spedite durante la notte in una soluzione UW ghiacciata sono state preparate con successo.</li>
	<li>Trasferire il tessuto tumorale in una piastra di coltura di 10 cm contenente HBSS ghiacciato. Tagliare il tumore a metà con un bisturi mentre immerso nella HBSS ghiacciata. Forma i tessuti tumorali in cilindri usando un punzone biopsia di 6 mm di diametro e taglia un lato per creare una superficie piana. Conservare i tessuti nell'HBSS ghiacciato fino all'uso. NOTA: Evitare di includere l'area necrotica del tessuto, che è generalmente al centro e ha un aspetto opaco e fragile.</li>
	<li>Impostare il vibratome. Disinfettare tutte le apparecchiature utilizzando il 70% di etanolo. Posizionare il vassoio tampone vibratoma coperto con un coperchio di vetro acrilico al centro del bagno di ghiaccio vibratoma. Aggiungere ghiaccio al bagno di ghiaccio e riempire il vassoio tampone con HBSS raffreddato per mantenere il tessuto fresco durante il taglio. Fissare una lama di rasoio al supporto della lama. NOTA: Anche se mantenere i vibratomi in un ambiente semisterile non ha influenzato esperimenti precedenti, si consiglia di conservare il vibratoma sotto un armadio di biosicurezza, se disponibile.</li>
	<li>Sollevare con attenzione un tessuto tumorale con perforato dalla biopsia dall'HBSS utilizzando la forza dentata e rimuovere il buffer in eccesso tamponando il tessuto con un tovagliolo di carta privo di laminetti.</li>
	<li>Mettere una goccia di colla cianoacrilata di grado medico sulla piastra del campione e posizionare il tessuto su questa goccia. Asciugare all'aria la colla per 2-3 min e mettere la piastra nel vassoio del tampone. Integrare con alcuni HBSS fino a quando il tessuto è completamente immerso nel buffer. NOTA: Il montaggio dei tessuti in posizione eretta e stabile è fondamentale per generare fette tagliate uniformemente. Se i tessuti montati sono instabili, aggiungere più colla al tessuto circostante per mantenere una posizione eretta o scaricare il tessuto, appiattire il fondo e incollarlo di nuovo. I tessuti elastici tendono a essere spinti e piegati più facilmente durante il taglio, nel qual caso possono essere appropriate lunghezze più brevi (&lt;5 mm) e più rampe. Per i tessuti estremamente fragili, gli asciugamani di carta possono distruggere il tessuto. In questo caso, il tessuto può essere posizionato su una superficie di plastica per eliminare alcuni HBSS in eccesso.</li>
	<li>Regolare le impostazioni del vibratoma. Vengono utilizzate le seguenti impostazioni: spessore di taglio: 250 m, ampiezza, 3,00 mm, velocità di taglio : 0,01–0,25 mm/s e angolo della lama di 15-21. NOTA: Ottimizzare le impostazioni di affettatura a seconda della rigidità del tessuto. I tessuti più morbidi sono più facilmente tagliati con un angolo di lama più profondo a bassa velocità. Un angolo di lama di 18 gradi, velocità di taglio compresa tra 0,10-0,18 mm/s e un'ampiezza di 3,00 mm funziona bene per i tumori del topo 4T1 e PDX HCI010. Il tessuto rigido può essere tagliato con una velocità della lama più veloce.</li>
	<li>Impostare le posizioni iniziale e finale della lama e regolare l'altezza dello stage. Eseguire lo strumento con la modalità continua per tagliare le fette per diversi cicli fino a quando i tessuti non vengono tagliati in modo uniforme.</li>
	<li>Continuare a affettare il tessuto. Trasferire le fette insieme a una piccola quantità di buffer HBSS sull'inserto di coltura cellulare con mezzo con una pipetta di trasferimento a punta larga, utilizzando l'aspirazione per sollevare l'intera fetta. Mettere una fetta per inserto su una piastra di 24 pozzetti. Un inserto per 6 piastre di pozzo può ospitare fino a quattro fette per un saggio di replica. NOTA: Se l'ultimo bordo della fetta di tessuto è ancora attaccato al tessuto non tagliato, fermare il vibratome e separare la fetta di tessuto con due padici di punta fine senza toccare o frugare le fette di tessuto. Una lama di rasoio separata può essere utile per rimuovere il tessuto appeso.</li>
	<li>Rimuovere il buffer in eccesso con una pipetta di trasferimento punta fine.</li>
	<li>Quando la lama raggiunge vicino ai tessuti incollati, fermare lo strumento, abbassare lo stadio, rimuovere il tessuto irrigidito con una lama separata e montare un nuovo tessuto. Continuare a affettare fino a quando non sono state raccolte abbastanza fette.</li>
	<li>Colture le piastre in un'incubatrice umidificata fissata a 37 gradi centigradi, 5% DI CO2. Le fette di tessuto sono coltivate nell'interfase aria-liquido sull'inserto di coltura cellulare. Le fette di tessuto sono pronte per gli esperimenti 24-48 h dopo la preparazione iniziale della fetta. Per la coltivazione a lungo termine, scambiare il mezzo ogni 2-3 giorni.</li>
</ol>2. Misurazione della vitalità
<ol><li>Per la misurazione della vitalità della fetta di tessuto, scambiare il mezzo con un reagente di misurazione della vitalità basato sulla luminescenza contenente luciferasi e prosubstrate a 1:1,000 diluizione nel mezzo TSC seguendo le istruzioni del produttore. Il reagente misura l'attività di riduzione delle cellule vive del prosubstrato metabolizzato alla luciferina11. Trasferire 50 -L di miscela enzimatica-substrato sopra ogni fetta di tessuto.</li>
	<li>Incubare con agitazione delicata su uno shaker orbitale situato all'interno di un'incubatrice umidificata posta a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 durante la notte.</li>
	<li>I segnali luminescenti possono essere misurati utilizzando un lettore di microplacino o uno strumento di imaging in vivo per i tessuti coltivati in una piastra di 24 pozzetti. Per misurare la vitalità individuale di più tessuti su una piastra a 6 pozzetti, è necessario utilizzare un sistema di imaging in vivo.<ol>
<li>Quando si utilizza un lettore a micropiastra, impostare la micropiastra senza coperchio. Qualsiasi tipo di lettore di micropla in grado di misurare l'intensità luminescente dovrebbe essere adatto per l'esperimento. Abbiamo usato le seguenti impostazioni: tempo di lettura : 1 s, misura dall'alto, guadagno : 200. NOTA: per una maggiore precisione, utilizzare una microplacca a parete bianca per configurare l'esperimento. Bianco-muro, chiaro-fondo 24 piastre bene sono stati testati, e nella maggior parte dei casi, piastre chiare bene non compromettono i risultati.</li>
		<li>Quando si utilizza un sistema di imaging in vivo per misurare la vitalità, posizionare la piastra al centro dello stage e rimuovere il coperchio. Acquisire immagini fotografiche normali seguite da immagini luminescenti con un campo di impostazione dello stage a C, tempo di esposizione automatica, f-stop n. 1, impostazione obiettivo come microplacca con altezza del soggetto - 0,0 cm.</li>
		<li>Quantificare l'intensità luminescente utilizzando il software di imaging accompagnato dal sistema di imaging in vivo. Disegnare regioni di interesse coerenti (ROI) intorno a ogni fetta di tessuto. Questo protocollo utilizza un cerchio di 1 cm di diametro come ROI (vedere Figura 1). Misurare il flusso totale (p/s) dell'area.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Valutazione dell'effetto farmacologico sulle fette di tessuto
<ol><li>Misurare la vitalità della linea di base prima del trattamento utilizzando il reagente di misurazione della vitalità basato sulla luminescenza, come spiegato nella sezione 2. NOTA: Se diversi tessuti hanno una vitalità significativamente inferiore rispetto ad altri, omettere i tessuti dal saggio.</li>
	<li>Sciogliere i farmaci nel solfuro dimetile (DMSO) per realizzare soluzioni di stock. Preparare una soluzione farmacologica 10x con TSC o altro mezzo di coltura (25 gradi centigradi per una piastra di 24 pozzetti contenente 250 ldi di mezzo) alle concentrazioni desiderate. Per il controllo del veicolo, preparare il supporto contenente un volume equivalente di DMSO.</li>
	<li>Integrare la soluzione farmaco 10x al mezzo di coltura nella parte inferiore del pozzo. Mescolare con il pipettaggio e trasferire 50 - L del mezzo sulla parte superiore dei tessuti. NOTA: se sono disponibili più fette di tessuto, verificare i duplicati o i triplicati per ogni condizione.</li>
	<li>Incubare durante la notte con agitazione delicata su uno shaker orbitale in un 37 gradi centigradi, 5% CO2, incubatore umidificato.</li>
	<li>Togliere la piastra dall'agitatore e incubare staticamente nel 37 gradi centigradi, 5% CO2, incubatrice umidificata.</li>
	<li>Nei momenti desiderati, misurare l'intensità luminescente dai tessuti utilizzando un lettore di microplacino o un sistema di imaging in vivo. Di solito, gli effetti della droga diventano rilevabili dopo 1-6 giorni di trattamento. NOTA: il reagente di vitalità basato sulla luminescenza è stabile per almeno 3 giorni in condizioni di coltura. Tuttavia, il substrato può essere esaurito durante il saggio a seconda dell'attività metabolica del tessuto. Se si osserva una significativa caduta del segnale nei tessuti con segnali precedentemente elevati, integrare il substrato in tutti i pozzi.</li>
	<li>Calcolare la vitalità rimanente dei tessuti tumorali trattati utilizzando la seguente equazione: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61036/61036eq1v2.jpg"> La vitalità del tessuto trattato è normalizzata dal suo spostamento di vitalità e vitalità dei tessuti tumorali di controllo.</li>
</ol>

<ol><li>Klemm, F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+therapeutic+response+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer.</a> Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).</li>
<li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).</li>
<li>Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failures+in+Phase+III%3A+Causes+and+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Failures in Phase III: Causes and Consequences.</a> Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+approaches+to+study+cell-cell+interactions+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment.</a> Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).</li>
<li>van der Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6, 86(2006).</li>
<li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+Analysis+of+Tumor+Slice+Explants+As+a+Prerequisite+for+Diagnostic+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58569(2018).</li>
<li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> BMC Cancer. 16, 78(2016).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210(2017).</li>
<li>Sivakumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+tumor+slice+cultures+provide+a+versatile+platform+for+immuno-oncology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery.</a> Oncoimmunology. 8 (12), 1670019(2019).</li>
<li>Duellman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Viability+Assay+and+Use+in+Inhibitor+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li>
<li>Lazaro, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment%2C+characterization%2C+and+long-term+maintenance+of+cultures+of+human+fetal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes.</a> Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).</li>
<li>Chadwick, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brain+Tumor%2FOrganotypic+Slice+Co-culture+System+for+Studying+Tumor+Microenvironment+and+Targeted+Drug+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2015).</li>
<li>Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Glioblastoma+Organotypic+Slice+Culture+Model+for+Study+of+Tumor+Cell+Migration+and+Patient-specific+Effects+of+Anti-Invasive+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo protocollo, dimostriamo una piattaforma per studi quantitativi e di efficacia dei farmaci in tempo reale sulle fette di tessuto tumorale organotipipico. Il sistema di coltura delle fette di tessuto offre vantaggi distinti rispetto ai tradizionali metodi in vitro basati sulle cellule catturando l'eterogeneità cellulare e le caratteristiche fisiologiche del microambiente tumorale nativo. Questa piattaforma consente inoltre una maggiore produttività per i test di efficacia dei farmaci, contribuendo a colmare il di...

Le interazioni delle cellule tumorali con le proprietà fisiche e biochimiche del tessuto stromale circostante formano il TME. TME può stimolare la crescita del tumore, metastasi, e modulare la risposta del tumore alla terapia1. Nello sviluppo di farmaci preclinici convenzionali, i farmaci farmaci sono in genere sottoposti a screening utilizzando linee cellulari oncologiche coltivate, una piattaforma di analisi che manca criticamente del TME2. Questa mancanza di TME fisiologico nelle fasi di prescreening basate sulle cellule può limitare la scoperta di agenti efficaci nei modelli animali portatori di tumore e può contribuire all'alto tasso di logoramento di molti farmaci oncologici promettenti nelle fasi cliniche successive dello sviluppo3.
Nonostante l'importanza del TME nella modulazione delle risposte ai farmaci tumorali, i vincoli sperimentali limitano l'applicazione di sistemi più fisiologicamente rilevanti durante le prime fasi della scoperta e dello sviluppo dei farmaci. È impraticabile vagliare centinaia di agenti terapeutici su tumori da modelli animali o campioni di tumore del paziente. In effetti, gli esemplari chirurgici sono scarse risorse con diversi background genetici e lo screening di migliaia di molecole candidate nei modelli animali non è fattibile a causa della scala sperimentale, dei costi e del benessere degli animali.
La coltura della falamuna del tessuto tumorale, dove le sezioni tumorali sottili e tagliate con precisione sono coltivate ex vivo, può affrontare la limitazione del TME fisiologico nei saggi di screening farmacologico. Storicamente, il campo delle neuroscienze ha aperto la strada e ha fatto ampie ottimizzazioni della coltura delle fette per il tessuto cerebrale4. Recentemente, molti studi hanno dimostrato la preparazione di fette da vari tipi di tessuto tumorale, tra cui tumori derivati dalla linea cellulare, modelli di tumore spontanei, xenografti derivati dal paziente (PDX) e tumori primari del paziente. La coltura della faldatrice di tessuto ex vivo integra i benefici della cultura in vivo e in vitro5. Le fette di tessuto tumorale mantengono l'architettura del tessuto intatta e la composizione cellulare variegata, consentendo lo studio delle cellule tumorali all'interno del contesto TME.
Questo protocollo introduce un sistema di coltura della coltura delle fette di tessuto tumorale organotico combinato con un saggio di fattibilità in tempo reale e altamente sensibile per valutare le risposte ai farmaci. I test di efficacia farmacologica sulle fette di tessuto tumorale organotipiche in protocolli precedentemente introdotti si basano sulla misurazione dei cambiamenti nella vitalità cellulare mediante incorporazione di coloranti fluorescenti, immunoistochimica (IHC) o MTT ((3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 difenile tetrazoli) come detto96,7,8. Tuttavia, tutti questi metodi sono saggi di punto finale e soffrono di bassa sensibilità, lunghi tempi di elaborazione, analisi dei dati complessi, portata del segnale ristretta e alto errore sperimentale. Il nostro reagente compatibile con le cellule vive basato sulla luminescenza migliora questi saggi fornendo un'ampia gamma di segnali e una misurazione istantanea (5 minuti) senza elaborazione preliminare e post-elaborazione minima. Questo reagente è altamente sensibile e può coesistere nei mezzi di coltura cellulare, consentendo la misurazione continua e del percorso temporale della vitalità cellulare. Questo sistema di analisi è applicabile allo screening ad alto consumo dei farmaci candidati sulle fette di tessuto nello sviluppo di farmaci preclinici.

<table><tbody><tr><td>Piatto da 10 cm</td><td>Corning</td><td>430293</td><td></td></tr><tr><td>Piatto a 24 pozzetti</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7524</td><td></td></tr><tr><td>4T1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>Punzone per biopsia da 6 mm di diametro</td><td>Integra Miltex</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5g</td><td>Per TSC medium</td></tr><tr><td>Belzer UW soluzione per celle frigorifere (soluzione UW)</td> <td>Bridge to Life</td><td>500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Membrane Mix</td><td>Fisher scientific</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Corning</td><td>MT-25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>Lame da taglio in acciaio inossidabile a doppio bordo</td><td>TED PELLA</td><td>121-6</td><td>Per affettare</td></tr><tr><td>Doxorubicina (cloridrato)</td> <td>Cayman Chemical</td><td>15007</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Pinze a punta fine</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4974</td><td></td></tr><tr><td>Pinze a punta fine</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767-500g</td><td>Per TSC medio</td></tr><tr><td>HBSS senza calcio, magnesio o fenolo rosso</td><td>Gibco</td><td>14-175-103</td><td></td></tr><tr><td>HCI010</td><td>Dr. Alana Welm, Università dello Utah</td><td>Cancro al seno PDX</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Soluzione tampone</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Per mezzo TSC</td></tr><tr><td>ITS + Premix</td><td>Fisher Scientific 354352</td><td></td><td>Per mezzo TSC</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1200S Vibratomo</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>Per inserto per coltura cellulare Millicell medium TSC</td></tr><tr><td>, 12 mm, PTFE idrofilo, 0,4 &micro; m</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Millicell Inserto per Colture Cellulari, 30 mm, PTFE idrofilo, 0.4 &micro; m</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-500g</td><td>Per TSC medio</td></tr><tr><td>PELCO Pro CA44 Adesivo tissutale</td><td>TED PELLA</td><td>10033</td><td>Colla</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Fisher</td><td>Scientific 15140163</td><td>Per TSC medium</td></tr><tr><td>RealTime-Glo MT Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G9711</td><td></td></tr><tr><td>Topo ricombinante EGF</td><td>BioLegend</td><td>585608</td><td>per TSC medio</td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875135</td><td></td></tr><tr><td>lame di rasoio industriali a taglio singolo</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Per la rimozione di tessuti incollati</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Corning</td><td>25-035-CI</td><td>per TSC medio</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW13115E</td><td>Per TSC medio</td></tr><tr><td>Staurosporina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3510A</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tooothed pinze</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5155</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento</td><td>Fisher scientific</td><td>13-711-7M</td><td>Punta larga</td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento</td><td>Samco Scientific</td><td>235</td><td>Punta fine</td></tr><tr><td>Terreno di William E, senza glutammina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12551032</td><td>Per terreno TSC</td></tr></tbody></table>

misurazione della risposta dei farmaci in tempo reale nelle fette di tessuto tumorale organotipico

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

I tessuti tumorali sono composti da cellule cancerose, cellule immunitarie infiltrate, cellule endoteliali, fibroblasti e matrice extracellulare. Questo complesso ambiente costituisce il microambiente tumorale (TME) e può modulare la risposta alla terapia in vivo o alla risposta ai farmaci ex vivo. Gli schermi convenzionali di scoperta dei farmaci oncologici vengono effettuati su cellule coltivate in un monostrato, un sistema che manca criticamente l'influenza della TME. Pertanto, i sistemi sperimentali che integrano saggi sensibili e ad alto consumo con TME fisiologico rafforzeranno il processo preclinico di scoperta dei farmaci. Qui, introduciamo la coltura della fetta del tessuto tumorale ex vivo come piattaforma per lo screening farmacologico medio-alto.di velocità. La coltura delle fette di tessuto organitipotico costituisce sezioni tumorali sottili e tagliate con precisione che vengono mantenute con il supporto di una membrana porosa in un'interfaccia ad aria liquida. In questo protocollo, descriviamo la preparazione e la manutenzione di fette di tessuto preparate da tumori di topo e tumori da modelli di xenotrapianto (PDX) derivati dal paziente. Per valutare i cambiamenti nella vitalità dei tessuti in risposta al trattamento farmacologico, abbiamo sfruttato un test di vitalità biocompatibile basato sulla luminescenza che consente la misurazione in tempo reale, rapida e sensibile delle cellule vitali nel tessuto. Utilizzando questa piattaforma, abbiamo valutato le risposte dipendenti dalla dose di fette di tessuto all'inibitore multi-chinasi, alla staurosporina e all'agente citotossico, doxorubicina. Inoltre, dimostriamo l'applicazione di fette di tessuto per la farmacologia ex vivo esaminando 17 farmaci clinici e preclinici su fette di tessuto preparati da un singolo tumore PDX. La nostra piattaforma di screening ex vivo fisiologicamente rilevante, altamente sensibile e robusta rafforzerà notevolmente la scoperta di farmaci oncologici preclinici e il processo decisionale per il trattamento.

Qui, dimostriamo un corso temporale, protocollo di valutazione dell'efficacia del farmaco multiplo per le fette di tessuto tumorale preparate da tessuti tumorali al seno 4T1 del topo e un modello PDX del cancro al seno, HCI01012. Abbiamo preparato con successo fette di tessuto da diversi tumori derivati dal topo, PDX e tumori dei pazienti freschi10. Il flusso di lavoro complessivo della preparazione del tessuto tumorale e del test di efficacia del farmaco è descritto nella ...

Introduciamo un protocollo per misurare la risposta del farmaco in tempo reale nelle fette di tessuto tumorale organotipico. La strategia sperimentale qui descritta fornisce una piattaforma per effettuare schermi di farmaci a medio-alta produzione su fette di tessuto derivate da tumori clinici o murini in condizioni di ex vivo.

Misurazione della risposta dei farmaci in tempo reale nelle fette di tessuto tumorale organotipico

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Il nostro protocollo è compatibile con altri metodi di analisi molecolare e consente la valutazione di come i farmaci influenzano la vitalità delle fette di tessuto in tatto e le prestazioni dello screening della produttività media. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo misurare la vitalità di un'intera fetta di tessuto in tempo reale con pochissima pre-o post-elaborazione. Questa tecnica accelera lo sviluppo precli clinicalo dei farmaci e l'oncologia testando i candidati ai farmaci o le fette di tessuto acquisite direttamente dai campioni di tessuto tumorale del paziente.Il nostro metodo di valutazione della fattibilità tissutale in tempo reale è piuttosto versatile e può essere applicato agli studi di biologia del cancro, neuroscienze e biologia dello sviluppo. Preparare fette di tessuto vitali in tatto è la chiave per il successo della procedura. Le impostazioni del Vibratome in composizione media devono essere regolate in base al tipo di tessuto e alla compattezza.Il giorno dell'acquisizione della fetta di tessuto tumorale, aliquote 250 microlitri di mezzo di coltura di fette tissutali per pozzo in una piastra di 24 pozza e posizionare un inserto di coltura t

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Cancer Research

Ricerca sul cancro

Fonte: Ciraku, L., et. al. Un modello di fetta cerebrale ex vivo per studiare e mirare alla crescita del tumore metastatico cerebrale del cancro al seno. J. Vis. Exp. (2021). Questo video mostra l'imaging di cellule tumorali che esprimono luciferasi in una fetta di cervello di topo organotipico. La luciferina viene aggiunta al terreno e la piastra viene posizionata all'interno della camera del sistema di imaging in vivo. I parametri per l'acquisizione delle immagini vengono regolati e vengono...

Imaging a bioluminescenza per valutare la crescita tumorale in una fetta di cervello di topo organotipico

Il organotipico coculture fetta cervello con cellule di carcinoma consente la visualizzazione cambiamenti morfologici mediante fluorescenza e campo chiaro (video) microscopia durante il processo di carcinoma invasione delle cellule del tessuto cerebrale. Questo modello di sistema permette anche approcci di scambio cellulare e di rifornimento e offre una vasta gamma di manipolazioni e analisi.

Co-coltura di sistema con un Organotipica cervello Slice e 3D Spheroid delle cellule di carcinoma

Molti tipi di tumori cerebrali umani sono localizzati in regioni specifiche all'interno del cervello e sono difficili da coltivare in coltura. Questo protocollo affronta il ruolo del microambiente tumorale e studia nuovi trattamenti farmacologici analizzando le cellule tumorali cerebrali primarie fluorescenti che crescono in una fetta di cervello di topo organotipico.

Un tumore cerebrale / organotipica fetta sistema di co-coltura per lo Studio microambiente tumorale e mirata terapie farmacologiche

I modelli attuali ex vivo di glioblastoma (GBM) non sono ottimizzati per studi fisiologicamente rilevanti di invasione tumorale umana. Qui presentiamo un protocollo per la generazione e la manutenzione di culture organiche di fetta da tessuti freschi umani GBM. Viene fornita una descrizione della microscopia a tempo trascorso e tecniche quantitative di analisi delle migrazioni di cellule.

Un modello di cultura organica fetta di Glioblastoma umano per lo studio della migrazione delle cellule tumorali e degli effetti specifici del paziente di farmaci antiinvasivi

Forniamo un metodo per la generazione, la coltivazione e l'analisi sistematica delle fette organotipiche derivate da tumori del polmone murino. Inoltre descriviamo come ottimizzare per spessore della fetta e come selezionare le concentrazioni di farmaco per il trattamento di fette di tumore.

Valutazioni e analisi di tumore fetta espianti come prerequisito per la prova diagnostica

Questo protocollo descrive la preparazione di colture organotipiche di fette (OTSC). Questa tecnica facilita la coltivazione ex vivo di tessuto multicellulare intatto. Gli OTSC possono essere utilizzati immediatamente per testare la rispettiva risposta ai farmaci in un ambiente multicellulare.

Colture organotipiche di fette come modelli preclinici del microambiente tumorale nel carcinoma pancreatico primario e nelle metastasi

Questo protocollo descrive un metodo semi-automatico per screening di farmaci organoidi a medio-alto rendimento e un software di analisi delle immagini automatizzato indipendente dal microscopio per quantificare e visualizzare risposte multiparametriche a singolo organoide per catturare l'eterogeneità intratumorale.

Screening multiparametrico di farmaci organoidi tumorali mediante imaging a cellule vive a campo ampio per analisi di massa e organoidi singoli

Descriviamo un protocollo per la produzione, la coltura e la visualizzazione dei tumori umani, che hanno metastatizzato alle superfici peritoneali. I campioni tumorali resecati vengono tagliati utilizzando un vibratomo e coltivati su inserti permeabili per una maggiore ossigenazione e vitalità, seguiti da imaging e analisi a valle utilizzando microscopia confocale e citometria a flusso.

Coltura e imaging di fette tumorali ex vivo di pseudomixoma peritonei organotipico da campioni tumorali umani resecati

Gli organoidi tumorali derivati da pazienti sono un sofisticato sistema modello per la ricerca di base e traslazionale. Questo articolo sui metodi descrive in dettaglio l'uso dell'imaging fluorescente multiplexato di cellule vive per la valutazione cinetica simultanea di diversi fenotipi organoidi.

Imaging multiplexato di cellule vive per le risposte ai farmaci in modelli di organoidi derivati da pazienti

Presentiamo un protocollo passo-passo per l'imaging tridimensionale e ad alta risoluzione, label-free di organoidi utilizzando l'olotomografia a bassa coerenza. Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione della coltura di organoidi, l'acquisizione di immagini e l'analisi computazionale delle immagini, consentendo la visualizzazione in tempo reale delle dinamiche strutturali e delle risposte ai farmaci negli organoidi viventi.

Imaging 3D ad alta risoluzione e analisi con apprendimento automatico senza marcatura di organoidi intestinali tramite olotomografia a bassa coerenza

Scopri come misurare la risposta dei farmaci in tempo reale su fette di tessuto tumorale organotipico. Questo metodo consente screening ad alto rendimento su campioni derivati da pazienti per accelerare lo sviluppo preclinico in oncologia.

Misurazione della risposta dei farmaci in tempo reale nelle fette di tessuto tumorale organotipico

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