Name: Applicazione della microscopia a forza atomica per rilevare losteoartrite precoce (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Scopri come rilevare l'osteoartrite precoce con la microscopia a forza atomica (AFM). Questo metodo misura l'elasticità locale della cartilagine articolare senza danneggiare il campione, consentendo una diagnosi precoce.

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Ringraziamo i nostri co-autori della pubblicazione originale per il loro aiuto e supporto.

I campioni di cartilagine umana sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a artroplastica totale del ginocchio nel Dipartimento di Chirurgia Ortopedica dell'Ospedale Universitario di Tuebingen, Germania, e l'ospedale Winghofer, Rottenburg a.N., Germania, per l'OA allo stadio finale del ginocchio. Prima dell'inizio dello studio (progetto numero 674/2016BO2). Il consenso informato scritto è stato ricevuto da tutti i pazienti prima della partecipazione. I metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida approvate.
1. Preparazione del campione
<ol><li>Preparazione della cartilagine per la sezionamento criotoma<ol>
<li>Per valutare i cambiamenti degenerativi nell'articolazione del ginocchio, prendere campioni di cartilagine articolari ottenuti dalla zona portante dei condili femorali dopo la resezione dei tessuti dai pazienti. NOTA: I campioni studiati devono comunque contenere almeno un sottile strato di osso subcondrale per consentire una chiara identificazione dell'orientamento del tessuto rispetto alla superficie interna ed esterna, consentendo così anche un raccolto di tessuto standardizzato dello strato cartilagineo più in alto. La cartilagine può essere utilizzata per le misurazioni AFM fino a 24 ore dopo l'intervento chirurgico. Il tessuto può essere immagazzinato nel mezzo dell'Aquila (DMEM) modificato senza siero con 2% (v/v) penicillina-streptomicina e 1,2% (v/v) amphotericina B prima dell'uso. Conservare i campioni per più di 24 h può causare tuttavia artefatti nelle misurazioni AFM a causa del gonfiore dei tessuti.</li>
		<li>Tagliare la cartilagine articolare nel suo complesso dall'osso subcondrale con l'aiuto di un bisturi e successivamente incorporare il campione di cartilagine in mezzo di incorporamento solubile in acqua sulla manopola criotomi che si congela a bassa temperatura nel dispositivo criotomeo. NOTA: Il mezzo congelato stabilizza il tessuto che avvolge. Si traduce anche nel congelamento del campione cartilagineo insieme al mezzo di incorporamento. Quando si taglia la cartilagine dall'osso, tenere traccia dell'orientamento del tessuto. Il tessuto incorporato per le criosezioni deve essere posizionato in modo tale che lo strato superiore (cioè la superficie articolare) della cartilagine faccia fronte alla lama. Si noti che il tessuto deve essere completamente coperto dal mezzo di incorporamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Sezione criotoma della cartilagine<ol>
<li>Utilizzando un criotoma standard, sezionare il tessuto a uno spessore di 35 m dallo strato più alto (cioè la superficie articolare) della cartilagine articolare che è incorporato nel mezzo di incorporamento solubile in acqua congelato. NOTA: In totale, è possibile sezionare e utilizzare per le analisi fino a 300 m (che corrisponde a circa nove sezioni). Il limite proposto di 300 m corrisponde alla profondità di penetrazione visiva che di solito si può ottenere con la microscopia a fluorescenza nella cartilagine ialina come la cartilagine articolare. Così, è possibile ordinare la cartilagine secondo il modello spaziale locale predominante e quindi misurare questi modelli nelle sezioni corrispondenti.</li>
		<li>Raccogliere le sezioni su uno scivolo di vetro e sciacquare le sezioni 3x con salina tampone fosfato (PBS) per rimuovere il supporto di incorporamento solubile in acqua.</li>
	</ol></li>
	<li>Incollaggio delle sezioni cartilaginee su un piatto Petri compatibile con AFM NOTA: poiché l'AFM raccoglie i dati per rientro meccanico sul campione, le sezioni devono essere fissate in posizione per consentire misurazioni precise.<ol>
<li>Incollare delicatamente le sezioni spesse 35 m con colla campione biocompatibile su piatti di coltura tissutale compatibili con il dispositivo AFM. Per fare questo, prendi 2/3 gocce di colla e mettile sul piatto di coltura dei tessuti nel punto in cui il bordo della sezione finirà. Ora metti la sezione cartilagine sulla colla e lascia che si attacchi saldamente alla superficie del piatto di coltura dei tessuti. NOTA: Le sezioni spesse 35 m della cartilagine articolare ialina non sono molto soggette ad arricciatura. Tuttavia, se il curling si verifica quando si rimuovono i campioni dal supporto buffer, assicurarsi che il minor fluido possibile si attacchi ai campioni. Non appena l'acqua in eccesso si è asciugata, diffondere direttamente il tessuto sui punti dispersi della colla in modo che sia fissato alla superficie del piatto di coltura cellulare. La colla viene applicata in uno strato sottile solo ai bordi del campione e non sull'intera sezione. Misurare solo quella porzione del campione che è lontano dall'area incollata per eliminare la possibilità che la colla interferisca con le misure.</li>
		<li>Incubare le sezioni a temperatura ambiente (RT) per 2 min per consentire alla colla e al tessuto di legarsi correttamente. Quindi coprire le sezioni con il mezzo L-15 di Leibovitz senza L-glutamine e senza bicarbonato di sodio in modo che siano completamente sommerse. NOTA: I movimenti improvvisi del campione durante la fissazione o l'applicazione della colla insufficiente sono errori comuni che causano il distacco del tessuto dal piatto di coltura. Inoltre, l'applicazione del supporto Leibowitz dovrebbe essere fatta in modo delicato, in modo da non staccare il campione dalla superficie a causa di "onde" create dal mezzo.</li>
		<li>Posizionare la parabola Petri con le sezioni incollate nell'incubatrice a coltura cellulare standard a 37 gradi centigradi fino a quando non vengono eseguite le misurazioni. NOTA: Assicurarsi che le sezioni del tessuto siano stabili e non staccarle dalla superficie del piatto di coltura dei tessuti eseguendo lentamente ogni passo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparazione a sbalzo (incollaggio delle microsfere)
<ol><li>Preparazione del dispositivo AFM e diluizione delle microsfere<ol>
<li>Posizionare lo sbalzo sul blocco di vetro specificato per le misurazioni dell'aria, fissarlo con la molla e montare il blocco di vetro sulla testa Dell'AFM.</li>
		<li>Diluire le microsfere in etanolo al 100% (100 particelle/10-L) e ultrasonicare per 10 s, in modo che le microsfere siano separate e non si aggregano insieme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione della configurazione per l'incollaggio<ol>
<li>Pulire uno scivolo di vetro con il 70% di etanolo e montarlo sul supporto del campione sul dispositivo AFM. NOTA: La pulizia del vetrino impedisce l'accumulo di macchie di polvere che potrebbero interferire con il processo di incollaggio sulla superficie del vetrino.</li>
		<li>Posizionare 2 - L della sospensione della microsfera al centro del vetrino e 2 - L di colla vicino alla sospensione della microsfera. NOTA: Si raccomanda di posizionare la sospensione della microsfera e la colla l'una vicino all'altra per consentire una rapida transizione dello sbalzo tra la colla e le microsfere. Se la transizione tra immergere lo sbalzo nella colla e entrare in contatto con una microsfera è troppo lunga, la colla alla fine si indurisce, perdendo così le sue proprietà adesive.</li>
		<li>Lasciare asciugare il liquido etanolo nella microsfera, lasciando le microsfere in posizione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incollare le microsfere sulla punta a sbalzo<ol>
<li>Immergere il cantilever manualmente nella colla con l'aiuto del motore stepper in 10 gradini fino a quando la punta è coperta dalla colla. Eseguire questo passaggio rapidamente, come la colla si asciuga velocemente.</li>
		<li>Ritrarre di nuovo il cantilever di 100 m, spostarlo verso le microsfere e posizionare la punta a sbalzo direttamente sopra una singola microsfera.</li>
		<li>Eseguire una misurazione della spettroscopia di forza per immergere la punta a sbalzo sulla microsfera selezionata con i parametri mostrati nella Tabella 1. NOTA: Eseguendo questo passaggio, viene utilizzata una misurazione della superficie della microsfera per stabilire il contatto tra la punta del cantilever e la microsfera. Il tempo di contatto relativamente lungo mostrato nella Tabella 1 consente un ampio tempo di incollaggio tra la colla e la microsfera. La curva forza-distanza ottenuta durante questa fase viene generata come sottoprodotto dell'incollaggio della microsfera sulla punta a sbalzo e non viene elaborata per ulteriori analisi.</li>
		<li>Una volta che una microsfera è attaccata al cantilever, ritrarre il blocco di vetro con il cantilever montato sulla parte superiore e quindi rimuovere la testa AFM dal microscopio. Infine, smontare il blocco di vetro e sbalzare dalla testa AFM.</li>
		<li>Incubare lo sbalzo a 65 gradi centigradi per 2 ore e lasciarlo asciugare durante la notte al RT prima di iniziare le misurazioni. NOTA: L'incubazione del cantilever migliora le proprietà adesive della colla, rendendo la stabilità a sbalzo-microsfera.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparazione del dispositivo AFM per le misurazioni
<ol><li>Regolare un blocco di vetro specificato per la misurazione in un ambiente liquido sul supporto AFM in modo che la superficie superiore sia dritta e parallela al supporto AFM.</li>
	<li>Con l'aiuto di una pinzetta, montare con attenzione il cantilever selezionato sulla superficie del blocco di vetro, in modo che la punta AFM con la microsfera sporge sul piano ottico lucido. NOTA: La punta del cantilever deve sporgere sul piano lucido per essere in grado di riflettere il laser dell'AFM sul fotodetector. Fare molta attenzione quando si posiziona lo sbalzo sull'AFM in modo da non graffiare la superficie ottica lucidata del blocco di vetro. Graffiare il blocco di vetro può causare difficoltà nella regolazione dell'allineamento laser e può interferire con le misurazioni successive.</li>
	<li>Poiché lo sbalzo sarà soggetto a pressione meccanica, deve essere fissato in posizione. Stabilizzare il cantilever sul blocco di vetro facendo scorrere la molla metallica nella scanalatura del blocco e bloccando la parte superiore del cantilever con la molla con l'aiuto di pinzette.</li>
	<li>Posizionare con attenzione il blocco di vetro con lo sbalzo sulla testa dell'AFM e fissarlo con il meccanismo di bloccaggio integrato. Assicurarsi che la molla sia rivolta verso il lato sinistro in modo che lo sbalzo sia posizionato nell'orientamento corretto. Quindi montare la testa AFM con il cantilever sul dispositivo AFM.</li>
</ol>4. Caricamento del campione e calibrazione del
NOTA: Qui, la calibrazione del dispositivo viene eseguita eseguendo una curva di forza sulla superficie pulita del piatto Petri riempito con il mezzo di Leibovitz senza alcun tessuto campione. La calibrazione può essere eseguita anche utilizzando un piatto AFM di controllo separato riempito solo con il mezzo AFM senza il campione.
<ol><li>Montaggio del campione sul dispositivo AFM<ol>
<li>Posizionare il piatto Petri preparato al punto 1.3.3 sul supporto del campione AFM.</li>
		<li>Accendere il riscaldatore del piatto Petri e impostarlo a 37 gradi centigradi. Lasciare che il piatto di coltura dei tessuti raggiunga la temperatura ottimale (ad es. 20 min).</li>
		<li>Posizionare un foglio di protezione sulla base dell'assieme a sbalzo per evitare la condensazione del mezzo nella testa AFM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calibrazione del dispositivo<ol>
<li>Aprire il software (Tabella dei materiali), seguito dalla finestra di allineamento laser e dalla finestra che rappresenta le impostazioni dei parametri di approccio. Quindi accendere il motore stepper, la luce laser e la ccd-camera.</li>
		<li>Utilizzare la telecamera CCD al microscopio per visualizzare e identificare il cantilever. Utilizzando la funzione motoria stepper, abbassare il cantilever a 100 gradini fino a quando il cantilever è completamente sommerso nel mezzo. NOTA: L'unione del cantilever nel liquido è visivamente identificabile tramite la telecamera CCD. Quando si rompe la superficie dell'acqua, la punta a sbalzo crea riflessi circolari facilmente evidenti nell'acqua.</li>
		<li>Dirigere il laser sulla parte superiore del cantilever utilizzando le viti di regolazione. NOTA: Non sovraavvolgere le viti, in quanto ciò danneggerà il meccanismo di allineamento laser. Il sbalzo è visto dal basso e il raggio laser viene dall'alto.</li>
		<li>Una volta che il laser è posizionato sul cantilever, regolare il fascio laser con l'aiuto di viti nel dispositivo AFM in modo che il fascio riflesso cade sul centro del fotodetector. Continuare a monitorare la posizione del raggio laser utilizzando la funzione di allineamento laser. NOTA: Il rilevatore rileva la deviazione del raggio laser riflesso dal cantilever e lo converte in un segnale elettrico.</li>
		<li>Dopo la regolazione laser-cantilever, il segnale Sum deve essere 1 V o superiore, mentre le deviazioni laterali e verticali devono essere vicine a 0. Se questi valori non vengono ottenuti, regolare il fotodetector.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ottenere la curva di forza di calibrazione<ol>
<li>Per raggiungere la superficie del piatto AFM per avviare le misurazioni, eseguire uno scanner Approach con i parametri di approccio indicati nella tabella 2. Una volta raggiunto il fondo del piatto di coltura dei tessuti, ritrarre lo sbalzo di 100 m. NOTA: A questo punto la sonda si trova esattamente a 100 m sopra dal fondo del piatto di coltura dei tessuti.</li>
		<li>Impostare i parametri RUN e regolare i parametri visualizzati nella tabella 3. Fare clic sul pulsante RUN per avviare una misurazione e ottenere una curva di distanza della forza di calibrazione. NOTA: La curva di forza ottenuta qui è illustrata nella Figura 1.</li>
		<li>Nella curva di distanza della forza di calibrazione, selezionare la regione per un adattamento lineare della curva retratta nel software. NOTA: La vestibilità lineare viene eseguita per misurare la sensibilità del cantilever. Una volta che la misura lineare è in atto, i valori verranno salvati dal software. La misurazione costante della molla o il rumore termico dello sbalzo viene calcolato dal software in seguito.</li>
		<li>Poiché le misurazioni vengono eseguite in media ad una temperatura di 37 gradi centigradi, impostare la variabile di temperatura a 37 gradi centigradi nel software per imitare le condizioni fisiologiche il più fedelmente possibile. NOTA: Alla fine della calibrazione, la deviazione verticale viene salvata e visualizzata nell'unità di forza, il Newton (N), invece di volt (V), che è l'unità della registrazione originale da parte del rilevatore fotodiode.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Caratterizzazione biomeccanica di ECM e PCM eseguendo misurazioni di elasticità tramite AFM
<ol><li>Identificazione dei modelli di condrociti nella sezione cartilagine<ol>
<li>Osservare la sezione cartilagine sotto un microscopio a contrasto di fase integrato nel sistema AFM e identificare i modelli cellulari specifici10 della cartilagine articolare dal ginocchio osteoartritico: corde singole (aree del tessuto sano), stringhe doppie (inizio degenerazione del tessuto), piccoli e grandi ammassi (entrambi avanzati degenerazione dei tessuti). Vedere la figura 2A–D.</li>
		<li>Una volta identificato il modello specifico desiderato, misurare due siti per modello scelto per tipo di matrice (PCM o ECM) ed eseguire nove ripetizioni di misurazione su ciascun sito di misurazione (Figura 2E,F). Garantire una dimensione del campione sufficientemente grande da tenere conto di possibili imprecisioni. NOTA: Per le misurazioni PCM, posizionare il cantilever in prossimità delle celle (come mostrato dai cerchi rossi nella Figura 2E, F). Per eseguire le misurazioni dell'ECM, selezionare una regione senza celle (illustrata dall'area blu nella Figura 2E,F)ed eseguire il rientro come descritto nel passaggio 5.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rientro del sito di destinazione<ol>
<li>Eseguire un approccio seguito da una retrazione in modo che il cantilever sia posizionato 100 m sopra il tessuto, che sarà la posizione di partenza per le misurazioni successive.</li>
		<li>Concentrarsi sul PCM o ECM del modello da misurare e fissare il mouse del computer in quel punto. NOTA: il mouse fungerà da indicatore visivo per il sito di destinazione del rientro. Una volta che la messa a fuoco si sposta sulla punta a sbalzo, le strutture del tessuto diventeranno indistinguibili o sfocate.</li>
		<li>Ora concentrati sulla sonda e sposta la punta della sonda sul punto precedentemente fissato dalla freccia del computer. Successivamente, iniziare le misurazioni con RUN, utilizzando il parametro set point ottenuto per calibrazione del cantilever. NOTA: una curva di forza esemplare ottenuta misurando il PCM di una singola stringa è illustrata nella figura supplementare 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Trattamento dei dati
NOTA: L'analisi dei dati o la determinazione del modulo elastico viene eseguita utilizzando un modello Hertz come descritto in precedenza11,12. La forma dell'indienter era sferica a causa dell'uso di microsfere sulla punta e il rapporto di Poisson era mantenuto a 0,5 sulla base della letteratura precedente13,14,15.
<ol><li>Aprire il softwaredielaborazione dati ( Tabella dei materiali ) compatibile con i dati ottenuti dal dispositivo AFM.</li>
	<li>Selezionare il modello Hertz nel software per l'elaborazione delle curve di distanza di forza. Impostare il rapporto di Poisson su 0,5 e selezionare la forma della punta come sferica e un raggio di punta di 12,5 m.</li>
	<li>Una volta regolati tutti i parametri, i risultati vengono montati e il modulo del Young viene calcolato e visualizzato dal software.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Utilizzando L'AFM come nuova e potente tecnica per misurare le proprietà biomeccaniche dei materiali biologici a livello su nanoscala, abbiamo misurato le proprietà elastiche dell'ECM e del PCM nella cartilagine articolare osteoartritica umana. I campioni della cartilagine sono stati selezionati in base al loro modello spaziale predominante dell'organizzazione dei condrociti come biomarcatore basato su immagini per la degenerazione dei tessuti locali. Come previsto, è stato osservato un forte calo dei valori di elasticit...

La cartilagine articolare è un tessuto avascolare e aneurale. Condrociti scarsamente sparsi producono, organizzano e mantengono una matrice extracellulare espansiva (ECM) in cui sono incorporati. Come parte distinta e specializzata dell'ECM, i condrociti sono circondati da un sottile strato di matrice specializzata noto come matrice pericellulare (PCM). Il PCM agisce come un'interfaccia a matrice cellulare meccanosensitive1 che protegge i condrociti2 e modula la loro risposta biosintetica3. Come descritto in precedenza4, nella cartilagine sana, i condrociti sono disposti in modelli spaziali specifici e distinti specifici per ogni strato di tessuto e giunto4,5 e dipendono da meccanismi di caricamento meccanico specifici per le articolazioni6. Questi modelli cambiano da coppie e stringhe in cartilagine sana a stringhe doppie con l'inizio dell'osteoartrite (OA). Con l'ulteriore progressione della malattia i condrociti formano piccoli cluster, aumentando gradualmente a grandi cluster nell'OA avanzato. Una perdita completa di qualsiasi struttura organizzativa e induzione di apoptosi è osservata nella fase finale OA. Pertanto, la disposizione cellulare del condrocito può essere utilizzata come biomarcatore basato sull'immagine per la progressione OA4.
Le proprietà biomeccaniche di cellule e tessuti non solo ne regolano la forma e la funzione, ma sono anche cruciali per mantenere la loro vitalità. I cambiamenti nell'elasticità possono propagarsi o innescare l'insorgenza di gravi malattie come il cancro o l'OA. La microscopia a forza atomica (AFM) è emersa come un potente strumento per caratterizzare qualitativamente e quantitativamente le proprietà biomeccaniche di specifiche strutture di bersaglio biologico su scala microscopica, misurando un'ampia gamma di forza, dal piconewton al micronewton. L'applicazione principale di AFM è quella di misurare la topografia superficiale e le proprietà meccaniche dei campioni alla risoluzione subnanometrica7. Il dispositivo di misura è costituito da tre componenti principali: 1) Una sonda AFM, che è una punta affilata montata su un sbalzo e viene utilizzata per l'interazione diretta con la superficie del campione. Quando la forza viene applicata al cantilever, la deformazione di quest'ultimo avviene in base alle proprietà del tessuto misurato. 2) Un sistema ottico che proietta un raggio laser sul cantilever, che viene poi riflesso in un'unità di rilevamento. 3) Un rilevatore di fotodiodo che cattura la luce deviata dallo sbalzo. Converte le informazioni ricevute per quanto riguarda la deflessione laser dal cantilever in una curva di forza che può essere analizzata.
Pertanto, il principio principale dell'AFM è il rilevamento della forza che agisce tra la sonda AFM e la struttura bersaglio del campione. Le curve di forza ottenute descrivono le proprietà meccaniche delle strutture bersaglio sulla superficie del campione come elasticità, distribuzione della carica, magnetizzazione, sollecitazione della resa e dinamica di deformazione plastica elastica8. Un importante vantaggio dell'AFM rispetto ad altre tecniche di imaging è che l'AFM può essere utilizzato per misurare le proprietà meccaniche delle cellule vive in media o tessuti in uno stato nativo senza danneggiare il tessuto. AFM può operare sia in condizioni liquide che a secco. Non vi è alcun requisito per la preparazione del campione. AFM offre la possibilità di immaginare un campione e misurarne simultaneamente le proprietà meccaniche in campioni che sono condizioni quasi fisiologiche. Nel presente studio descriviamo un nuovo approccio per valutare la progressione dell'OA misurando l'elasticità del PCM e dell'ECM nella cartilagine articolare nativa. La correlazione dell'organizzazione spaziale dei condrociti con il grado di degenerazione locale dei tessuti fornisce una prospettiva completamente nuova per la diagnosi precoce dell'OA. La rilevanza funzionale di questi modelli non è stata tuttavia valutata finora. Poiché la funzione principale della cartilagine articolare è il carico che porta a basso attrito, il tessuto deve possedere proprietà elastiche. AFM permette di misurare non solo l'elasticità dell'ECM, ma anche dei modelli cellulari spaziali incorporati nel loro PCM. La correlazione osservata dell'elasticità con il cambiamento del modello spaziale dei condrociti è così forte che misurare l'elasticità da sola può consentire la stratificazione della degenerazione del tessuto locale.
La modulina elastica del PCM e dell'ECM è stata valutata in sezioni sottili sfere di 35 m utilizzando un sistema AFM integrato in un microscopio a contrasto di fase invertito che permetteva la visualizzazione simultanea del campione cartilagineo. Questo protocollo si basa su uno studio già pubblicato dal nostro laboratorio9 e descrive specificamente come caratterizzare la disposizione spaziale dei condrociti e come misurare l'elasticità dei loro PCM ed ECM associati. Con ogni cambiamento di modello dei condrociti, si possono osservare cambiamenti significativi nell'elasticità sia per il PCM che per l'ECM, consentendo di utilizzare questa tecnica per misurare direttamente lo stadio di degenerazione della cartilagine.
Questo approccio convalidato apre un nuovo modo per valutare la progressione dell'OA e gli effetti terapeutici nelle prime fasi prima che la degradazione del tessuto macroscopico inizi effettivamente ad apparire. L'esecuzione coerente delle misurazioni AFM è un processo arduo. Nel seguente protocollo viene descritto come preparare il campione da misurare con AFM, come eseguire le misurazioni AFM effettive a partire dalla preparazione del cantilever, come calibrare l'AFM e quindi come eseguire le misurazioni. Le istruzioni passo-passo forniscono un approccio chiaro e conciso per ottenere dati affidabili e fornire strategie di base per elaborarli e interpretarli. La sezione di discussione descrive anche le insidie più comuni di questo metodo rigoroso e fornisce utili suggerimenti per la risoluzione dei problemi.

<table><tbody><tr><td>Amfotericina B</td><td>Merck</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a forza atomica (AFM)</td><td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlino, Germania</td><td>JPK00518</td><td></td></tr><tr><td>Testa AFM</td> <td>(CellHesion 200) JPK</td><td>JPK00518</td><td></td></tr><tr><td>Colla per campioni biocompatibile</td><td>JPK Instruments AG, Berlino, Germania</td><td>H000033</td><td></td></tr><tr><td>Cantilever</td><td>punta C, k &frac14; 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria</td><td>AIO-TL-10</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)</td><td>Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germania</td><td>41966052</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a contrasto di fase invertito (integrato con AFM)</td><td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germania</td><td>L201306_03</td><td></td></tr><tr><td>Terreno L-15 di Leibovitz senza L-glutammina</td><td>(Merck KGaA, Darmstadt, Germania)</td><td>F1315</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere</td><td>Polysciences</td><td>07313-5</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore per piastre di Petri associato a AFM</td><td>JPK Instruments AG, Berlino, Germania</td><td>T-05-0117</td><td></td></tr><tr><td>Piuma di bisturi</td><td></td><td>2023-01</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali</td><td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Svizzera</td><td>TPP93040</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Paesi Bassi</td><td>SA6255012</td><td></td></tr></tbody></table>

applicazione della microscopia a forza atomica per rilevare l'osteoartrite precoce

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Le proprietà biomeccaniche di cellule e tessuti non solo ne regolano la forma e la funzione, ma sono anche cruciali per mantenere la loro vitalità. I cambiamenti nell'elasticità possono propagare o innescare l'insorgenza di gravi malattie come il cancro o l'osteoartrite (OA). La microscopia a forza atomica (AFM) è emersa come un forte strumento per caratterizzare qualitativamente e quantitativamente le proprietà biomeccaniche di specifiche strutture di target biologiche su scala microscopica, misurando le forze in un intervallo da piccolo come il piconewton al micronewton. Le proprietà biomeccaniche sono di particolare importanza nei tessuti muscolo-scheletrici, che sono soggetti ad alti livelli di ceppo. L'OA come malattia degenerativa della cartilagine provoca l'interruzione della matrice pericellulare (PCM) e la riorganizzazione spaziale dei condrociti incorporati nella loro matrice extracellulare (ECM). L'interruzione nel PCM e nell'ECM è stata associata a cambiamenti nelle proprietà biomeccaniche della cartilagine. Nel presente studio abbiamo usato l'AFM per quantificare questi cambiamenti in relazione ai cambiamenti specifici del modello spaziale dei condrociti. Con ogni cambiamento di modello, sono stati osservati cambiamenti significativi nell'elasticità sia per il PCM che per l'ECM. Misurare l'elasticità locale permette quindi di trarre conclusioni dirette sul grado di degenerazione del tessuto locale in OA.

Lungo il modello fisiopatologico dalle stringhe alle stringhe doppie, ai piccoli e infine ai grandi cluster, sia ECM (Figura 3A) che PCM (Figura 3B) elastico diminuito in modo significativo tra ogni modifica del modello. L'unica eccezione è stata la differenza in ECM tra le stringhe e le stringhe doppie (p - 0,072). I risultati mostrano che il rapporto ECM/PCM (Figura 4B) non è cambiato in modo significativo, mentre è stata osservat...

Presentiamo un metodo per studiare i primi cambiamenti osteoartritici a livello cellulare nella cartilagine articolare utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM).

Applicazione della microscopia a forza atomica per rilevare l'osteoartrite precoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Le proprietà biomeccaniche di cellule e tessuti regolano la loro funzione e vitalità. L'AFM consente la quantificazione precoce dell'osteoartrite a livello cellulare sulla base di misurazioni dell'elasticità. AFM consente l'acquisizione di misure a livello cellulare senza danneggiare il campione e con un'alta risoluzione, affidabilità e sensibilità.I cambiamenti di proprietà biomeccanica si verificano all'inizio dell'osteoartrite. La misurazione dell'elasticità locale della cartilagine articolare consente di trarre valide conclusioni sul grado di degenerazione dei tessuti locali. Per valutare i cambiamenti degenerativi all'interno dell'articolazione del ginocchio umano, utilizzare prima un bisturi per tagliare la cartilagine articolare nel suo complesso dall'osso subcondrale e incorporare il campione di cartilagine nel mezzo di incorporamento solubile in acqua sulla manopola Cryotome che si congela a bassa temperatura nel dispositivo Cryotome.Quando il campione si è congelato, utilizzare un criotomo standard per acquisire sezioni di tessuto spesse 35 micrometri dallo strato più alto della cartilagine articolare, raccogliendo ogni sezione su singoli vetrini. Una volta ottenute tutte le sezioni, sciacquare i campioni tre volte in PBS fresco per cinque minuti per lavaggio per rimuovere il mezzo di incorporamento solubile in acqua. Rimuovere la prima diapositiva dal lavaggio.Successivamente, aggiungere da due a tre gocce di colla per campione biocompatibile per sezione in singole piastre di Petri compatibili con AFM. Rimuovere la soluzione in eccesso dal campione e premere delicatamente i bordi della sezione essiccata sulle macchie di colla. Dopo due minuti, coprire attentamente i tessuti incollati con il mezzo L-15 di Leibovitz senza L-glutammina e posizionare i piatti in un incubatore di coltura cellulare fino a quando i campioni devono essere analizzati.Per preparare il dispositivo AFM, regolare un blocco di gas per la misurazione in un ambiente liquido sul supporto AFM in modo che la superficie superiore sia parallela al supporto e utilizzare una pinzetta per montare con cura il sbalzo selezionato sulla superficie del blocco di vetro in modo che la punta AFM con la microsfera sporge sul piano ottico lucido. Per stabilizzare la sbalzo sul blocco di vetro, far scorrere la molla metallica nella scanalatura del blocco e utilizzare una pinzetta per bloccare la parte superiore della sbalzo con la molla. Posizionare con cura il blocco di vetro con il sbalzino sulla testa AFM e fissare il blocco con il meccanismo di bloccaggio integrato.Quindi montare la testa AFM con la sbalziola sul dispositivo AFM con la molla rivolta a sinistra. Per montare il campione sul dispositivo AFM, posizionare la piastra di Petri del campione sul portacampioni AFM e impostare il riscaldatore della piastra di Petri su 37 gradi Celsius. Dopo circa 20 minuti, aprire il software del dispositivo e l'allineamento laser e avvicinarsi alle finestre di impostazione dei parametri.Successivamente, accendere il motore stepper, la luce laser e la fotocamera CCD e utilizzare la funzione motore stepper per abbassare la sbalziera in passi di 100 micrometri fino a quando il cantilever non è completamente immerso nel mezzo. Utilizzare le viti di regolazione per dirigere il laser sopra il cantilever e utilizzare le viti del dispositivo AFM per regolare il raggio laser in modo che il fascio riflesso cada al centro del fotorivelante. Una volta regolato il cantilever laser, regolare il fotodetector in base alle esigenze per impostare il segnale di somma su un volt o superiore e le deformazioni laterali e verticali a quasi zero.Per ottenere la curva di forza di calibrazione, eseguire un approccio dello scanner con i parametri di approccio indicati nella tabella. Una volta raggiunto il fondo del piatto di coltura tissutale, ritrarre il cantilever di 100 micrometri. Impostare i parametri di esecuzione come indicato nella tabella.Quindi fare clic su Esegui per avviare una misurazione e ottenere una curva di distanza della forza di calibrazione. La curva di forza è ottenuta come illustrato nella figura. Sulla curva di distanza della forza di calibrazione, selezionate la regione per una vestibilità lineare della curva retrattile.Una volta che la vestibilità lineare è in atto, i valori verranno salvati dal software. Quindi, poiché le misurazioni vengono eseguite in mezzo a 37 gradi Celsius temperatura, impostare la variabile di temperatura nel software a 37 gradi per imitare le condizioni fisiologiche il più vicino possibile. Per identificare i modelli conversite nelle sezioni del campione di cartilagine, individuare e identificare i modelli cellulari specifici della cartilagine articolare dal ginocchio osteoartritico al microscopio a contrasto di fase, che possono includere singole stringhe indicative di aree tissutali sane, doppie stringhe indicative dell'inizio della degenerazione tissutale, piccoli ammassi, che sono segni di degenerazione avanzata dei tessuti, e grandi cluster, indicativi della distruzione dei tessuti allo stadio finale.Una volta identificato uno specifico modello desiderato, per le misurazioni della matrice pericellulare, posizionare il cantilever in prossimità delle cellule e misurare due siti per modello scelto per tipo di matrice, nove volte per sito di misurazione, compresa una dimensione del campione abbastanza grande da tenere conto di possibili imprecisioni. Concentrati sulla matrice cellulare del modello da misurare e fissa il mouse del computer in quel punto. Quindi, concentrati sulla sonda e sposta la punta della sonda nel punto precedentemente fissato dalla freccia del computer.Per eseguire misurazioni della matrice extracellulare, selezionare una regione senza cellule ed eseguire un approccio seguito da una retrazione in modo che il cantilever sia posizionato a 100 micrometri sopra il tessuto. Quindi fare clic su esegui per avviare le misurazioni, utilizzando il parametro setpoint ottenuto dalla calibrazione del cantilever. Per elaborare i dati ottenuti, aprire un software di elaborazione dati compatibile con i dati ottenuti dal dispositivo AFM e selezionare il modello Hearst nel software per l'elaborazione delle curve di distanza di forza.Impostare il rapporto Poisson su 0,5, la forma della punta come sferica e il raggio della punta a 12,5 micrometri. Una volta che tutti i parametri sono stati regolati, i risultati saranno montati e il modulo di Young sarà calcolato dal software. Lungo il modello fisiopatologico dalle stringhe alle stringhe doppie e dai cluster piccoli a quelli grandi, sia i moduli elastici a matrice extracellulare che pericellulare diminuiscono significativamente tra ogni cambiamento di pattern tranne che tra stringhe e stringhe doppie.Inoltre, il rapporto matrice extracellulare-pericellulare non cambia in modo significativo, mentre si osserva una marcata diminuzione delle differenze assolute di elasticità tra le matrici extracellulari e pericellulari. I valori di elasticità dipendono da varie condizioni come la profondità di indentazione o le proprietà della punta a sbalzino. AFM è quindi più adatto a confrontare condizioni diverse all'interno della stessa configurazione sperimentale.Poiché l'AFM misura l'elasticità locale del campione, le sezioni devono essere fissate in posizione per consentire misurazioni precise ed evitare danni a sbalzi. Per analizzare ulteriormente i processi responsabili dei cambiamenti di elasticità tissutale, la quantificazione biochimica della struttura delle proteine di interesse può essere eseguita tramite macchie occidentali o ELISA.

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Applicazione della microscopia a forza atomica per rilevare l'osteoartrite precoce

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