Name: Doppia elettroporazione in utero per colpire le popolazioni di cellule temporali e separate spazialmente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Scopri la doppia elettroporazione in utero per studiare la corticogenesi nei mammiferi utilizzando embrioni di topo. Questa tecnica permette di visualizzare le interazioni tra popolazioni neuronali temporali e spaziali separate.

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Gli autori ringraziano Cristina Andrés Carbonell e i membri della struttura Animal Care dell'Universidad de Valencia per assistenza tecnica. Vogliamo anche ringraziare Isabel Farias e Sacramento R. Ferràn per i reagenti e la condivisione delle loro attrezzature con noi. I.M.W è finanziato da un contratto Garant'a Juvenil della Conselleria de Educaciàn de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D è finanziato dal Ministro de Ciencia, Innovaciàn y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz detiene un Ramàn y Cajal Grant (RYC-2015-19058) dal ministro spagnolo Ciencia, Innovaciàn y Universidades (MICINN). Quest'opera è stata finanziata RYC-2015-19058 e SAF2017-82880-R (MICINN).

La procedura qui descritta è stata approvata dal comitato etico incaricato della sperimentazione, il benessere degli animali dell'Università di Valencia e la Conselleria de Agricultura, Desarrollo Rurale, Emergencia Climàtica y Transiciàn Ecolàn Ecolàn Ecolàn Ecolàn Ecolàn Ecolàn Ecolàn Ecolàn Ecolàn Ecolànegica della Comunidad Valenciana, e aderisce alle linee guida del Consiglio internazionale per la scienza animale di laboratorio (ICLAS) riesaminate nel decreto reale 53/2013 della legislazione spagnola e della direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio.
NOTA: Questo protocollo prevede due scopi diversi: 1) il primo studio, denominato "strategia A", consente l'analisi delle interazioni tra le cellule di Cajal-Retzius (cellule CR) e i neuroni di proiezione corticale nati precocemente all'interno dello stesso emisfero cerebrale; 2) il secondo studio, "strategia B", viene effettuato al fine di esaminare l'innervazione dei neuroni di proiezione callosale dello strato superiore sul lato contralaterale della neocorteccia.
1. Preparazione pre-chirurgia
<ol><li>Preparazione del DNA<ol>
<li>Trasformare le cellule E. coli DH5, chimicamente o elettrocompetenti con i plasmidi di interesse, arlatarle su piastre di agar LB con l'antibiotico appropriato e incubarle durante la notte a 37 gradi centigradi. NOTA: Tutti i plasmidi utilizzati qui contengono il promotore generale per il pollo ,a-actin (CAG) che guida l'espressione di una proteina fluorescente-reporter (CAG-mCherry e CAG-EGFP per la strategia A e CAG-BFP e CAG-nEGFP-2A-mtdTomato per la strategia B). Tutti contengono resistenza all'ampicillina (AMP).</li>
		<li>Scegli le singole colonie da ogni trasformazione plasmide e inizia una coltura liquida di avviamento in 2 mL di brodo di Luria, l'ampicillina (LB-AMP) nei tubi di coltura batterica durante 3-4 h a 37 h con agitazione vigorosa (200 rpm). Dopo, impostare una coltura batterica più grande in un pallone Erlenmeyer da 500 mL aggiungendo 200 mL di LB-AMP e 1 mL della coltura di avviamento. Incubare peruna una notte a 37 gradi centigradi nello shaker orbitale a 200 giri/min.</li>
		<li>Utilizzare un kit di maxipreparazione senza endotossina (Tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore per ottenere DNA plasmid puro e concentrato dalle colture liquide. Risospendere il DNA in un buffer Tris-EDTA (TE) privo di endotossine per ottenere concentrazioni di almeno 5 g/l.</li>
		<li>Per ogni intervento chirurgico, preparate una soluzione con un volume finale di 10,L contenente 1 Lega di colorante verde veloce, una soluzione di DNA plasmide interessante per una concentrazione finale di 1 g/l per ogni plasmide e un buffer TE privo di endotossine. Ad esempio, mescolare 1 l l di colorante verde veloce, 2 ll di una soluzione di DNA plasmid di 5 g/l e 7 L di tampone DI TE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pipette tirando<ol>
<li>Tirare i capillari di vetro borosilicati (1/0,58 mm di diametro esterno/interno) in un'espirazione verticale a micropipette fino a quando la punta non raggiunge una lunghezza di 1-1,5 cm e tagliarla utilizzando pinze dissetanti con un angolo di circa 30 gradi sotto un mirino di sedzione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configurazione della sala chirurgica<ol>
<li>Mettere tutte le attrezzature sul tavolo operatorio (ad esempio, pinzette, forbici, pinze, micropipette, ago e portaa aghi). Accendere la piastra di riscaldamento e coprirla con un assorbente chirurgico sterile. Assicurarsi che il serbatoio nella macchina per l'anestesia per inalazione sia riempito con isoflurane, che il serbatoio dell'ossigeno contenga abbastanza ossigeno e che il sistema funzioni correttamente. NOTA: La sala operatoria e il materiale resistente devono essere mantenuti il più sterili possibile (cioè tutto il materiale deve essere autoclaed prima dell'intervento chirurgico e le superfici devono essere sanificati con il 70% di etanolo). Gli elettrodi di platino devono essere accuratamente disinfettati prima con sapone germicida e secondo con 70% di etanolo prima dell'intervento chirurgico.</li>
		<li>Preparare 100 mL di 0,9% (w/v) soluzione salina sterile contenente penicillina-streptomicina 1:100 e riempire un piatto Petri 10 cm. Posizionare la piastra sulla parte superiore del pad riscaldato per riscaldare la soluzione.</li>
		<li>Riempire una siringa da 1 mL con 150 l di una soluzione analgesica (ad esempio, una buprenorfine da 0,1 mg/kg).</li>
		<li>Caricare la pipetta tirata con 5 -L della soluzione finale del DNA plasmid e preparata al punto 1.1.4. Collegare il capillare a un tubo aspirante a clabo- controllato dalla bocca.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Prima operazione di elettroporazione in utero
<ol><li>Posizionare un topo incinta E11.5 (strategia A) o E13.5 (strategia B) C57BL/6 all'interno di una camera a induzione chiusa con 2,5% (v/v) isoflurane a 0,8 L/min e attendere che venga anestesizzato. Trasferire il mouse al pad di riscaldamento e mettere il naso in una maschera per la consegna costante di isoflurane. Controllare l'assenza di un riflesso del pedale come indicatore di un'anestesia adeguata. NOTA: L'etàmbrilionica E viene determinata in base al giorno in cui viene osservato il tappo vaginale (E0.5).</li>
	<li>Iniettare sottocutaneamente la femmina incinta con la soluzione analgesica (0,1 mg/kg di buprenorphine). Per evitare che gli occhi si asciughino durante la procedura, applicare una goccia di unguento per gli occhi in ogni occhio utilizzando un tampone di cotone.</li>
	<li>Rasare l'area addominale del topo con un rasoio elettrico e lavarlo 2x con 70% (v/v) salviette di etanolo, una volta con salviette di iodio, e un'ultima volta con una salvietta di etanolo.</li>
	<li>Utilizzare le forbici per fare un'incisione lunga 30 mm attraverso la pelle nella parte destra dell'animale e separare con cura la pelle adiacente dal muscolo con una spatola smussata. Successivamente, fare una seconda incisione nella parete addominale.</li>
	<li>Coprire l'addome con un pezzo di carta velina piegata precedentemente disinfettata con 70% di etanolo contenente una fessura lunga 40 mm al suo centro. Tirare con cura l'utero dalla cavità addominale con pinze ad anello. NOTA: l'utero deve essere mantenuto umido con la soluzione salina calda preparata al punto 1.3.2 durante l'intera procedura.</li>
	<li>Precaricare le pipette tirate con la soluzione DNA preparata al punto 1.1.4. Iniettare 0,5 DOLLARI della soluzione di DNA per embrione nel ventricolo laterale dell'emisfero selezionato utilizzando il tubo dell'aspiratore controllato dalla bocca fino a quando il colorante verde veloce non si manifesta all'interno del ventricolo.</li>
	<li>Posizionare gli elettrodi di platino di tipo pinps lateralmente intorno alla testa dell'embrione iniettato (come mostrato nella Figura 1A e nella Figura 2A). Orientare gli elettrodi per colpire la regione cerebrale desiderata. Dirigere il polo positivo verso la parete mediale per elettropolare l'orlo corticale (strategia A) o verso la corteccia laterale (strategia B) per etichettare le cellule generate in quell'area. NOTA: In tutti i casi, il cuore e la placenta devono essere evitati per garantire la sopravvivenza embrionale.</li>
	<li>Applicare la sequenza specifica di impulsi elettrici con un elettroporatore a onde quadrate seguendo le indicazioni indicate nella Tabella 1 (strategia A Embrioni E11.5: quattro impulsi di 25 V e 40 ms, separati da intervalli di 950 ms; strategia B E13.5 embrioni: cinque impulsi di 35 V e 60 ms, con intervalli di 950 ms).</li>
	<li>Riposizionare con attenzione l'utero nella cavità addominale con pinze, riempirlo con soluzione salina calda e chiudere la parete addominale con una sutura ago 6-0. Unire i due lati dell'incisione iniziale fatta nella pelle utilizzando una sutura aghi 6-0 o clip di sutura.</li>
	<li>Mantenere l'animale sul pad di riscaldamento e monitorarlo fino al suo recupero dall'anestesia. Fornire una dose extra di analgesia (150 oL)   in una soluzione idrogel collocata nella sua gabbia di casa.</li>
	<li>24 ore dopo l'intervento chirurgico, somministrare una dose extra di analgesia (150 o L). Continuare il monitoraggio quotidiano con l'ispezione visiva per possibili dolori e disagi. Osservare il comportamento dell'animale, testare i riflessi normali dell'arto posteriore e ispezionare la sutura per individuare eventuali segni di danno dovuto all'leccare o graffiare la ferita.</li>
</ol>3. Seconda elettroporazione in utero
<ol><li>Due giorni dopo l'intervento iniziale, ripetere i passaggi 2.1.2.3. Anche se il recupero delle femmine incinte dopo l'intervento chirurgico è molto buono, controllare che essi mostrano un comportamento normale e non presentano segni di dolore o angoscia prima di eseguire il secondo intervento chirurgico (E13.5 embrioni per la strategia A ed E15.5 per la strategia B).</li>
	<li>Fare un'incisione lunga 30 mm attraverso la pelle come nel passaggio 2.4 e una seconda incisione alla parete addominale, questa volta nel lato sinistro dell'animale. Esporre con attenzione l'utero sopra un tessuto disinfettato come descritto al punto 2.5. NOTA: Fare attenzione a non interferire con l'incisione precedentemente effettuata nell'altro lato.</li>
	<li>Iniettare circa 0,5 l per embrione della soluzione del DNA nel ventricolo cerebrale laterale dell'emisfero precedentemente elettropostato nel caso della strategia A e nel ventricolo cerebrale laterale dell'emisfero contralaterale per la strategia B. NOTA: Utilizzare solo embrioni che mostrano un normale sviluppo e nessun segno di riassorbimento.</li>
	<li>Posizionare gli elettrodi intorno alla testa dell'embrione come descritto al punto 2.7, dirigendo l'elettrodo positivo verso la corteccia laterale e applicare gli impulsi appropriati seguendo le indicazioni riportate nella tabella 1 (strategia A embrioni E13.5: cinque impulsi di 35 V e 60 ms separati da intervalli di 950 ms; strategia B E15.5 embrioni: cinque impulsi di 50 V e 80 ms separati da intervalli di 950 ms).</li>
	<li>Continuare e terminare l'intervento come descritto nei passaggi 2.8.2.10.</li>
</ol>4. Raccolta e sezionamento dei tessuti
<ol><li>Strategia A<ol>
<li>Quattro giorni dopo la seconda elettroporazione (E17.5), eseguire lussazione cervicale della femmina incinta e posizionarla in una posizione supina.</li>
		<li>Utilizzando le forbici, fare un'incisione ventrale per estrarre le corna uterine e con pinze metterle in un piatto Petri riempito con 1x salina tampone di fosfato (PBS) posta sul ghiaccio. NOTA: La bassa temperatura rende possibile l'anestesizzazione degli embrioni.</li>
		<li>Utilizzando una pinzetta, estrarre gli embrioni dal sacco amniotico e trasferirli con pinze in un nuovo piatto Petri pieno di PBS sotto un mirino di sismiferazione. Tenere con attenzione la testa degli embrioni utilizzando le pinze e condurre la dissezione cerebrale con una pinzetta per rimuovere prima la pelle sopra la testa e poi il cranio. Utilizzare una spatola per tirare fuori il cervello esposto.</li>
		<li>Raccogliere i cervelli con un cucchiaio e depositarli in un 48 piastra ben riempito con la soluzione fissativa (4% [w/v] paraformaldeide [PFA] in 1x PBS). Testare immediatamente per il risultato positivo di entrambi gli elettroporari esaminando il cervello utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertito, per esempio.</li>
		<li>Fissare i cervelli embrionali durante la notte a 4 gradi centigradi in uno shaker orbitale. Lavare con 1x PBS per eliminare le tracce di PFA. Trasferirli quindi in PBS con conservanti antifungini (1x PBS-0.05% (w/v) azide di sodio). SOPFA e azide di sodio sono composti citotossici che richiedono precauzioni speciali durante il loro utilizzo.</li>
		<li>Incorporare i cervelli fissati nel 4% (w/v) punto di fusione basso agarose in 1x PBS e attendere 10 min fino a quando non si solidifica. Attaccarli al supporto del tessuto vibratome utilizzando colla cianoacrita con i bulbi olfattivi rivolti verso l'alto per ottenere sezioni coronali.</li>
		<li>Avviare il vibratome e selezionare i parametri desiderati: larghezza di 100 m, 0,60 m/s di velocità e 0,60 mm di ampiezza.</li>
		<li>Fissare il cervello all'interno del contenitore del vibratome, riempirlo con soluzione 1x PBS, e iniziare a raccogliere sezioni seriali coronali con l'aiuto di un pennello in una piastra 48 bene riempito con 1x PBS-0.05% (w / v) azide di sodio per avere una rappresentazione completa del cervello (ad esempio, circa sette sezioni per pozzo e sei pozzi per embrione).</li>
		<li>Montare le sezioni desiderate in vetrini di vetro al microscopio utilizzando un pennello sottile. Coprirli con copricapi in vetro. Per lo stoccaggio a lungo termine aggiungere il supporto di montaggio, che impedisce la fotosbiancatura e la fotoossidazione. Osservare i vetrini al microscopio a epifluorescenza verticale per valutare l'efficacia dell'elettroporazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Strategia B<ol>
<li>Lasciate che i cuccioli precedentemente elettrostati a E13.5 e E15.5 siano nati e attendere fino a P15 per eseguire la perfusione transcardiale utilizzando la stessa soluzione fissativa utilizzata nel passaggio 4.1.4.</li>
		<li>Poco prima della perfusione, somministrare intraperitonealmente una dose di 75/1 mg/kg di ketamina/medetomidina. Quando il riflesso del pedale viene perso, fissare il mouse in posizione supina e fare un'incisione ventrale seguendo la linea mediana utilizzando le forbici per esporre sia la gabbia toracica che il diaframma.</li>
		<li>Tagliare il diaframma e aprire la gabbia toracica per ottenere l'accesso al cuore. Tenere la gabbia toracica con un emotostato e fare un'incisione nell'atrio destro con le forbici fini.</li>
		<li>Penetrare il ventricolo sinistro con un ago collegato con un tubo flessibile a una pompa perfusione peristale. Iniziare la perfusione transcardiale, consegnando almeno 25 mL del 4% di PFA a un flusso costante di 5,5 mL/min (tempo totale di 5 min).</li>
		<li>Dissezionare il cervello degli animali perfusi. In primo luogo, rimuovere la pelle sopra la testa con forbici e pinze. Inizia a tagliare il cranio con le forbici e tira con attenzione le sezioni delle ossa del cranio fino a quando non vengono completamente rimosse. Infine, estrarre il cervello con l'aiuto di una spatola.</li>
		<li>Trasferire i cervelli su una piastra di 24 pozze e fissarli con 4% PFA durante la notte a 4 gradi centigradi su uno shaker orbitale. Interrompere la fissazione sostituendo PFA con 0.05% (w/v) azide di sodio in PBS. NOTA: come indicato al punto 4.1.5, si consiglia di effettuare un lavaggio intermedio con 1x PBS.</li>
		<li>Ripetere i passaggi di 4.1.6-4.1.9, modificando i parametri vibratomi per i cervelli postnatali (40 larghezza m, 1,20 velocità m/s e 0,5 mm di ampiezza). NOTA: L'immunohistochimica o l'immunofluorescenza possono essere effettuate per rilevare specifici marcatori cellulari o migliorare il segnale delle proteine fluorescenti utilizzate nell'elettroporazione.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Imaging e analisi della fluorescenza confocale
<ol><li>Accendere il microscopio confocale, posizionare i vetrini del microscopio contenenti le sezioni cerebrali montate sul supporto delle diapositive del microscopio e selezionare i canali in cui verranno scattate le immagini a fluorescenza (ad esempio, 420-460 nm per BFP, 490-540 nm per GFP e 570-620 nm per mCherry e tdTomato).</li>
	<li>Eseguire la scansione dei campioni per ottenere immagini mappa di ogni sezione del cervello a due lunghezze d'onda diverse per una visione generale dell'uscita a doppia elettroposizione. Una volta terminato, selezionare l'obiettivo 10x e la modalità di osservazione multi-area-z-stack-timelapse. Ciò consentirà di programmare l'acquisizione automatica di immagini a fluorescenza in diverse localizzazioni XY z all'interno delle sezioni cerebrali.</li>
	<li>In ciascuna delle regioni scelte (XY), impostare i parametri di imaging appropriati (ad esempio, l'intensità del laser, la sensibilità al fotomoltiplicatore e una risoluzione minima di 1.024 x 1.024), nonché la profondità della scansione (a) in base ai piani del campione in cui è visibile la fluorescenza.</li>
	<li>Ottenere immagini a basso ingrandimento (10x) di tutte le regioni scelte ed esportarle dal formato OIF al formato TIFF utilizzando il software del visualizzatore al microscopio.</li>
	<li>Passare all'obiettivo 60x, ripetere il passaggio 5.3 e acquisire immagini ad alto ingrandimento per osservare le interazioni cella-cellula in modo più dettagliato. Esportarli come indicato nel passaggio 5.4.</li>
	<li>Aprire le immagini acquisite con qualsiasi software di imaging (ad esempio, Fiji) per ulteriori analisi.</li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lo studio delle interazioni cellula-cellula in vivo in regioni ad alta densità cellulare come la corteccia cerebrale è un compito complesso. Gli approcci tradizionali, compreso l'uso di anticorpi per etichettare i neuriti non sono adatti a causa della mancanza di marcatori specifici per diverse popolazioni di cellule. L'uso di modelli murini transgenici, in cui un particolare tipo di cellula esprime una proteina fluorescente, è utile per visualizzare i processi neuronali, ma questo dipende dalla disponibilità di tali mod...

La corteccia cerebrale è una struttura molto complessa e finemente organizzata. Per raggiungere un tale grado di organizzazione, i neuroni di proiezione corticale passano attraverso processi di sviluppo complessi che richiedono la loro generazione temporale, la migrazione alla loro destinazione finale nella piastra corticale e la creazione di connessioni a breve e lungo raggio1,2. Per molto tempo, il modo classico per studiare la corticogenesi si basava sull'uso di modelli murini knockout o knock-in di geni di interesse. Tuttavia, questa strategia, e in particolare l'uso di topi knockout condizionali, richiede tempo e denaro, e talvolta presenta ulteriori problemi per quanto riguarda l'esistenza di ridondanza genetica o la mancanza di driver CRE specifici, tra le altre questioni. Uno degli approcci che è sorto per cercare di affrontare questi problemi e che è oggi ampiamente utilizzato per studiare lo sviluppo corticale è in elettroporazione utero3,4. In utero l'elettroporazione è una tecnica utilizzata per la transgenesi somatica, che consente il targeting in vivo delle cellule staminali neurali e della loro progenie. Questo metodo può essere utilizzato per etichettare le cellule con l'espressione di proteine fluorescenti5,6, per la manipolazione genica in vivo (cioè, guadagno o perdita di test funzione)7,8,9, per isolare cortice elettropotizzate in vitro e colture8,10. Inoltre, l'elettroporazione in utero consente il controllo temporale e regionale dell'area mirata. Questa tecnica ha numerose applicazioni ed è stata ampiamente utilizzata per studiare la migrazione neuronale, divisione delle cellule staminali, connettività neuronale, e altri soggetti8,9,11,12.
Il manoscritto attuale descrive l'uso di una variante di elettroporazione in utero, definita doppia elettroporazione in utero, per analizzare le interazioni delle cellule nella corteccia cerebrale con diverse origini temporali e spaziali. Questi studi sono estremamente complessi da completare quando si impiegano modelli murini perché richiedono l'uso combinato di diverse linee transgeniche. Alcune delle applicazioni del protocollo descritto in questo documento includono lo studio delle interazioni ravvicinate tra le cellule vicine, così come le interazioni tra cellule distanti attraverso proiezioni a lungo raggio. Il metodo richiede l'esecuzione di due interventi chirurgici di elettroporazione indipendenti, separati temporaneamente e spazialmente, sugli stessi embrioni per indirizzare diverse popolazioni cellulari di interesse. Il vantaggio di questo approccio è la possibilità di manipolare la funzione genica in uno o entrambi i tipi di neuroni utilizzando animali di tipo selvaggio. Inoltre, questi esperimenti funzionali possono essere combinati con l'espressione di proteine citoplasmiche o fluorescenti marcate a membrana per visualizzare la morfologia fine delle cellule mirate, compresi dendriti e assoni, e analizzare le possibili differenze nelle interazioni cellulari rispetto a un controllo (cioè cellule etichettate solo con la proteina fluorescente).
Il protocollo qui delineato è focalizzato sullo studio delle interazioni cellulari all'interno della neocorteccia, ma questa strategia potrebbe essere utilizzata anche per esaminare le interazioni con aree extracorticali che possono essere prese di mira utilizzando in uteropozione, come il subpio o il talamo13,14, o interazioni cellula-cellula in altre strutture, come il cervelletto15. Il targeting di aree diverse si basa sull'orientamento degli elettrodi e sul ventricolo in cui viene iniettato il DNA (laterale, terzo o quarto). Con la strategia qui descritta, possiamo etichettare un numero considerevole di cellule, che è utile per valutare i cambiamenti generali nella connettività / innervazione in esperimenti funzionali. Tuttavia, per studiare i cambiamenti fini nella connettività, si possono utilizzare versioni modificate dell'elettroporazione in utero per ottenere l'etichettatura più scarsa e identificare le singole cellule16. In sintesi, la doppia elettroporazione in utero è un metodo versatile che consente di indirizzare le popolazioni cellulari separate temporalmente e spazialmente e di studiarne le interazioni in dettaglio, sia in condizioni di controllo che combinate con esperimenti funzionali, riducendo considerevolmente i costi temporali ed economici.

<table><tbody><tr><td>Ampicillina sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tubo aspiratore</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Emostatico Baby-mixter (perfusione)</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Capillare in vetro borosilicato</td><td>WPI</td><td>1B100-6</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (BUPREX 0,3 mg/ml)</td><td>Rb Pharmaceuticals Limited</td><td></td><td></td>921425</tr><tr><td>Plasmide CAG-BFP</td><td>Gentilmente fornito da U.M&uuml; Plasmide CAG-EGFP di ller</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Lab gentilmente fornito da U.M&uuml; ller Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CAG-mPlasmide Cherry</td><td>gentilmente fornito da U.M&uuml; ller Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmide</td><td>gentilmente fornito da U.M&uuml; ller Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Olympus</td><td>FV10i</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swabs</td><td>BFHCVDF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colla cianoacrilica</td><td>B. Braun Surgical</td><td>1050044</td><td></td></tr><tr><td>Ambito di dissezione</td><td>Zeiss</td><td>stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps #5 Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>ECM830 Square Wave Electroporator</td><td>BTX</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Rasoio elettrico</td><td>Oster</td><td>76998</td><td></td></tr><tr><td>Tampone TE senza endotossine</td><td>QIAGEN</td><td>1018499</td><td></td></tr><tr><td>Salviette all'etanolo</td><td>BFHCVDF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>Unguento per gli occhi</td><td>Alcon</td><td>682542.6</td><td></td></tr><tr><td>Colorante verde veloce</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini</td><td>Strumenti per la scienza fine (FST)</td><td>14069-09</td><td></td></tr><tr><td>LED a fluorescenza</td><td>CoolLED</td><td>pE-300-W</td><td></td></tr><tr><td>Maxi kit plasmidico genopuro</td><td>Roche</td><td>3143422001</td><td></td></tr><tr><td>Emostatici per zanzare Halsted (sutura)</td><td>Strumenti per scienze fini (FST)</td><td>91308-12</td><td></td></tr><tr><td>Pad riscaldante</td><td>UFESA</td><td>AL5514</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a epifluorescenza invertito</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000-S</td><td></td></tr><tr><td>Salviette allo iodio</td><td>Lorsoul</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaporizzatore di isofluorane</td><td>Flussometro</td><td>A15B5001</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Karizoo</td><td>586259</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (Anastemina)</td><td>Fatro Ib&eacute; rica SL</td><td>583889-2</td><td></td></tr><tr><td>Salviette di precisione Kimtech</td><td>Kimberly-Clark</td><td>7252</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) Agar GEN</td><td>Labkem</td><td>AGLB-00P-500</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) brodo GEN</td><td>Labkem</td><td>LBBR-00P-500</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidina (Sedator)</td><td>Dechra</td><td>573749.2</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti per microscopio</td><td>Menel-Gl&auml; ser</td><td>15747592</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Labbox</td><td>SLIB-F10-050</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Piastre Mutiwell (24)</td><td>SPL Life Sciences</td><td>32024</td><td></td></tr><tr><td>Piastre Mutiwell (48)</td><td>SPL Life Sciences</td><td>32048</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (per soluzione salina)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10112640</td><td></td></tr><tr><td>Ago 25 G (BD Microlance 3)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice orbitale S150</td><td>Stuart Scientific</td><td>5133</td><td></td></tr><tr><td>P Incubatrice Selecta</td><td>J. P. Selecta, s.a.</td><td></td><td></td>0485472</tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>PanReac AppliedChem</td><td>A3813</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Pompa di perfusione peristaltica</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta in platino, diametro 5 mm</td><td>Btx</td><td>45-0489</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di chiusura cutanea reflex - Clip da 7 mm, scatola da 100</td><td>AgnThos</td><td>203-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di chiusura cutanea reflex - Applicatore di clip, 7 mm</td><td>AgnThos</td><td>204-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pinze ad anello</td><td>Strumenti per la scienza fine (FST)</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Azoturo di sodio</td><td>PanReac AppliedChem</td><td>122712-1608</td><td></td></tr><tr><td>Tampone assorbente chirurgico (sterile)</td><td>Sutura chirurgica HK</td><td>PD-M</td><td></td></tr><tr><td>(Surgicryl PGA 6-0)</td><td>Materiali per sutura SMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa BYD11071512 1ml (BD plastipak)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture tissutali 100 x 20 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore verticale per micropipette</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio verticale</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ni</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

doppia elettroporazione in utero per colpire le popolazioni di cellule temporali e separate spazialmente

Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations

In utero l'elettroporazione è una tecnica di trasferimento del DNA in vivo ampiamente utilizzata per studiare i meccanismi molecolari e cellulari alla base della corticogenesi dei mammiferi. Questa procedura sfrutta i ventricoli cerebrali per consentire l'introduzione del DNA di interesse e utilizza una coppia di elettrodi per dirigere l'ingresso del materiale genetico nelle cellule che rivestono il ventricolo, le cellule staminali neurali. Questo metodo consente ai ricercatori di etichettare le cellule desiderate e/o di manipolare l'espressione dei geni di interesse in tali cellule. Ha più applicazioni, tra cui saggi mirati migrazione neuronale, tracciamento del lignaggio, e pathfinding assonale. Una caratteristica importante di questo metodo è il suo controllo temporale e regionale, che consente l'elusione di potenziali problemi legati alla letalità embrionale o alla mancanza di topi driver CRE specifici. Un altro aspetto rilevante di questa tecnica è che aiuta a ridurre considerevolmente i limiti economici e temporali che coinvolgono la generazione di nuove linee del mouse, che diventano particolarmente importanti nello studio delle interazioni tra i tipi di cellule che hanno origine in aree lontane del cervello in diverse età dello sviluppo. Qui descriviamo una doppia strategia di elettroporrazione che consente il targeting di popolazioni cellulari separate spazialmente e temporalmente. Con questo approccio possiamo etichettare diversi sottotipi di cellule in luoghi diversi con proteine fluorescenti selezionate per visualizzarle e/o possiamo manipolare i geni di interesse espressi da queste cellule diverse nei momenti appropriati. Questa strategia aumenta il potenziale dell'elettroporazione in utero e fornisce un potente strumento per studiare il comportamento delle popolazioni cellulari separate temporalmente e spazialmente che migrano per stabilire contatti stretti, così come le interazioni a lungo raggio attraverso proiezioni assonali, riducendo i costi temporali ed economici.

Le interazioni tra le cellule vicine hanno avuto origine in luoghi diversi e in tempi diversi: cellule Dijal-Retzius (cellule CR) e neuroni di proiezione corticale della migrazione precoce (strategia A)
L'interazione delle cellule CR e dei neuroni di proiezione corticale precoce è stata descritta in precedenza come necessaria per regolare la traslocazione somice tramite molecole di nectina e aderenza alla cadherina utilizzando una doppia strategia di elettroporazione<sup class...

La doppia elettropozione in utero consente di colpire le popolazioni cellulari separate spazialmente e temporaneamente. Questa tecnica è utile per visualizzare le interazioni tra quelle popolazioni cellulari utilizzando proteine fluorescenti in condizioni normali, ma anche dopo esperimenti funzionali per perturbare i geni di interesse.

Doppia elettroporazione in utero per colpire le popolazioni di cellule temporali e separate spazialmente

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian ...

Double in utero electroporation è un metodo potente per studiare gli aspetti importanti della corticogenesi dei mammiferi come l'interazione tra le cellule neuronali, generata in luoghi diversi ed età dello sviluppo. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di esaminare le interazioni imperturbate tra queste diverse popolazioni cellulari in modo rapido, dettagliato ed economico. Un'implicazione sorprendente del nostro metodo è che facilita una migliore comprensione di quanto simile sia il nostro cablaggio alterato in disturbi neuronali come autismo e schizofrenia.Questo studio non è limitato alla neocorteccia ma può anche essere impiegato per analizzare le interazioni cellula-cellula, in aree esocortico come il sepalium o il cervelletto. Uno dei passaggi più impegnativi è l'iniezione di DNA nei ventricoli laterale dei primi embrioni. L'uso di una sorgente luminosa è essenziale per iniezioni di successo.Per ogni intervento preparare prima una soluzione di 10 microliter contenente un microlitro di colorante verde veloce, un microgrammo per microliter soluzione di DNA plasmide di interesse per ogni plasmide e il volume appropriato sul tampone TE privo di endotossina. E precaricare una pipetta microcapillare di vetro con l'appropriata soluzione di DNA preparata. Per il primo in utero chirurgia di elettroporazione, applicare un unguento agli occhi di un topo incinta anestetizzato opportunamente temporizzato e utilizzare un rasoio per radere l'addome.Disinfettare la pelle esposta due volte con salviette sequenziali al 70% di etanolo e iodio prima di procedere con l'incisione sul lato destro dell'addome. Una volta che l'utero è accessibile, utilizzare le forcep ad anello per estrarre attentamente l'organo. Utilizzando un tubo aspiratore controllato dalla bocca, iniettare circa 0,5 microlitri di soluzione nel ventricolo laterale dell'emisfero sinistro degli embrioni E11.5 per la strategia A.Oppure nel ventricolo laterale dell'emisfero destro degli embrioni E13.5 per la strategia B, fino a quando il colorante verde veloce non è visibile all'interno del ventricolo.Quando tutta la soluzione è stata iniettata, posizionare gli elettrodi di platino di tipo forceps lateralmente intorno alla testa degli embrioni iniettati, con il polo positivo orientato alla parete mediale per colpire l'orlo corticale per la strategia A, o orientato alla corteccia laterale per la strategia B, facendo attenzione ad evitare il cuore e la placenta. Utilizzare un elettroporater ad onde quadrate per applicare la sequenza appropriata di impulsi elettrici per ogni età embrionale, come indicato nella tabella. Quando tutti gli embrioni sono stati iniettati ed elettroporati, utilizzare le flessione per restituire attentamente l'utero alla cavità addominale e riempire l'addome con soluzione salina calda.Usando una sutura ago 6-0, chiudere la parete addominale e chiudere attentamente l'incisione cutanea. Quindi riportare l'animale nella sua gabbia di casa con monitoraggio fino al pieno recupero. Due giorni dopo l'intervento chirurgico iniziale, conferma che il topo sta mostrando un comportamento normale e non presenta segni di dolore o angoscia.Prima di preparare l'animale per il secondo in utero elettroporazione come appena dimostrato. Iniettare 0,5 microlitri della soluzione di DNA desiderata nel ventricolo cerebrale laterale sinistro degli embrioni E13.5 per la strategia A, e nel ventricolo cerebrale laterale sinistro degli embrioni E15.5 per la strategia B.Dopo ogni iniezione, posizionare gli elettrodi con il polo positivo orientato alla corteccia laterale dell'emisfero iniettato per la strategia A e la strategia B.E gli embrioni elettroporati come indicato nella tabella. Al termine dell'elettroporazione, riportare l'utero nella cavità addominale e completare l'intervento chirurgico e le cure post-chirurgiche come dimostrato.Quando si implementa la strategia A, quattro giorni dopo la seconda elettroporazione, raccogliere l'utero del giorno embrionale 17,5 topo femmina incinta in una piastra di Petri di PBS sul ghiaccio. E usa le pinzette per trasferire gli embrioni in un nuovo piatto di PBS al microscopio sezionato. Usando le forcep, afferrare attentamente la testa di ogni embrione per facilitare la rimozione della pelle sopra la testa e il cranio.Usa le forcep o una spatola per sollevare il cervello esposto. Quindi utilizzare il cucchiaio per trasferire ogni cervello in singoli pozzi di una piastra di 48 porri contenente circa 600 microlitri di soluzione fissativa per pozzo. Quando tutti i cervelli sono stati raccolti, fissare il cervello a quattro gradi Celsius durante la notte su uno shaker orbitale, seguito da tre lavaggi di dieci minuti in PBS.Dopo l'ultimo lavaggio, incorporare il cervello in agarosio del 4% a basso punto di fusione in PBS per circa dieci minuti. Dopo che l'agarosio si è solidificato, utilizzare la colla cianoacrilato per fissare ogni cervello a un lato bulbo olfattivo porta tessuto vibratomo verso l'alto. Posizionare il supporto all'interno del contenitore del vibratomo e riempire il contenitore con PBS.Quindi utilizzare il vibratomo e una spazzola per ottenere sezioni seriali coronali spesse 100 micrometri. Trasferimento fino a sette sezioni per pozzo e sei pozzetti per embrione, in una nuova piastra di 48 pozzetti contenente 600 microlitri per pozzo di PBS fresco, integrata con conservanti antifungini man mano che vengono raccolti. Una volta acquisite tutte le sezioni, utilizzare una spazzola fine per montare ogni sezione su uno scivolo del microscopio in vetro e coprirle con una coverlip in vetro per valutare l'efficacia dell'elettroporazione su un microscopio a epifluorescenza verticale.Quando si implementa la strategia B, il giorno 15 postnatale, dopo aver confermato una mancanza di risposta al topinch, fissare il mouse in posizione supina e utilizzare le forbici per fare un'incisione della pelle della linea mediana per esporre la gabbia toracica e il diaframma e tagliare il diaframma per ottenere l'accesso al cuore. Usando forbici fini, fare un'incisione nell'atrio destro e utilizzare un ago da 25 gage collegato a un tubo flessibile a una pompa perfusione peristaltica per penetrare nel ventricolo sinistro. Quando l'ago è in posizione, consegnare almeno 25 millilitri di paraformaldeide al 4% per perfusione trascardica, a flusso costante a 5,5 millilitri al minuto.Dopo circa cinque minuti, interrompere la perfusione e utilizzare le forbici per rimuovere la pelle sopra la testa. Rimuovere il cranio e usare una spatola per rimuovere il tessuto cerebrale. Posizionare il cervello in un pozzo di una piastra di 24 porcile contenente 1,5 millilitri di paraformaldeide fresca al 4%, per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius su uno shaker orbitale.Quindi acquisire sezioni di 40 micrometri del cervello postnatale come appena dimostrato. Per l'imaging affetta cerebrale embrionale e postnatale, posizionare le diapositive contenenti le sezioni cerebrali montate di interesse su un supporto per vetrine al microscopio. Introdurre il porta cursore nel microscopio confocale e selezionare il canale appropriato per i fluorofori utilizzati nell'esperimento.Eseguire la scansione del campione per ottenere immagini cartografiche di ogni sezione cerebrale a due diverse lunghezze d'onda per una visione generale della doppia uscita di elettroporazione. Una volta terminato, selezionare l'obiettivo 10x, nella modalità di osservazione time lapse Z-stack multi-area. In ciascuna delle regioni XY selezionate, impostare i perimetri di imaging appropriati e la profondità della scansione lungo l'asse Z in base ai piani del campione, in cui la fluorescenza è visibile.Ottenere immagini a basso ingrandimento di tutte le aree scelte ed esportare le immagini dal formato OIF al formato TIFF nel software di visualizzazione del microscopio. Quindi seleziona l'obiettivo 60x e cattura immagini ad alto ingrandimento come appena dimostrato, per osservare le interazioni da cella a cella a un livello più dettagliato. Il divario temporale tra il doppio negli interventi di elettroporazione utero consente alle cellule toresiali CAG mirate nel giorno embrionale 11.5 in uno dei suoi luoghi di origine di raggiungere la zona marginale della neocorteccia laterale compresa l'area somatosensoriale, in tempo per stabilire contatti con i neuroni di proiezione corticale, etichettati nel giorno embrionale 13.5.I principali processi dei neuroni di proiezione che esprimono una GFP potenziata si rialzano abbondantemente nella zona marginale della corteccia e si mescolano con i processi di M-cherry che esprimono cellule cataretziali. In utero l'elettroporazione al giorno embrionale 13.5, l'uso di un BFP che esprime plasmide facilita l'etichettatura dei neuroni di proiezione attraverso diversi strati corticali. Una seconda elettroporazione nel lato contralaterale del giorno embrionale 15.5 prende di mira la sottopopolazione dei neuroni di proiezione callosale dello strato superiore, ma non i neuroni di proiezione dello strato inferiore che si sviluppano nelle fasi precedenti.I neuroni mirati a strato superiore estendono i loro assoni all'emisfero contralaterale, con il caratteristico modello di arborizzazione. L'alto ingrandimento consente una visualizzazione più dettagliata dell'innervazione dell'assone callosalo dei neuroni di proiezione mirati all'interno dell'emisfero contralaterale. Quando si tenta questo protocollo, è importante pianificare i tempi di elettroporazione, l'emisfero da iniettare e la posizione degli elettrodi in base alle popolazioni cellulari da prendere di mira.Seguendo questa procedura tutti i metodi, come l'elettroporazione è quello interessante. Per entrambi i tipi di cellule può essere eseguito per studiare possibili alterazioni del circuito in vivo. Utilizzando questa tecnica, è possibile studiare le interazioni fini tra due diverse cellule mirate.Includendo nuove informazioni scientifiche in vivo, mediante l'elettroporazione di proteine sinaptiche fluorescenti.

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In Utero iniezione intraventricolare e Elettroporazione di E15 embrioni di topo

Elettroporazione in utero è un metodo prezioso per trasfezione delle cellule progenitrici neuronali in vivo. A seconda del posizionamento degli elettrodi e la timepoint sviluppo di elettroporazione, alcuni sottoinsiemi di cellule corticali può essere mirati. Cellule bersaglio può quindi essere analizzato in vivo o in vitro per gli effetti di alterazione genetica.

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

Elettroporazione in utero permette per la consegna rapida in un gene-spazialmente e temporalmente modo controllato nello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC). Qui descriviamo altamente adattabile a protocollo di elettroporazione utero che possono essere usati per fornire costruisce espressione in più domini embrionale del SNC, tra cui il diencefalo telencefalo, e della retina.

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

Un metodo di trasferimento genico nel cervello del mouse di sviluppo è descritta utilizzando un metodo unico chirurgico e la forma speciale di elettrodi. Questa tecnica unica consente la trasfezione di DNA plasmidico temporalmente e spazialmente, che aiuterà molti neuroscienziati a studiare lo sviluppo del cervello.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

Questo video dimostra la consegna di DNA plasmidico nelle cellule neuronali cerebellari di embrioni murini utilizzando l'elettroporazione in utero. Questo metodo è utile per comprendere la funzione in vivo dei geni nel normale sviluppo cerebrale e i cambiamenti nell'espressione genica delle cellule neuronali durante la progressione tumorale.

Consegna genica basata sull'elettroporazione in utero: una tecnica per iniettare DNA plasmidico nelle cellule cerebellari embrionali di embrioni murini

Questa procedura mostra come indirizzare gli interneuroni nel prosencefalo del topo in via di sviluppo per mezzo dell'elettroporazione in utero. Questa tecnica è stata particolarmente efficace per ottenere l'espressione genica selettiva nei sottotipi di interneuroni destinati agli strati superficiali della corteccia.

Sottotipo-selettivo elettroporazione della corticale interneuroni

Dimostriamo un metodo per innestare cellule coltivate in siti definiti di embrioni di topo precoci per determinare il loro potenziale in vivo. Introduciamo anche un metodo di elettroporazione ottimizzato che utilizza capillari di vetro di diametro noto, consentendo la consegna precisa di DNA esogeno in alcune cellule degli embrioni.

Metodi di trasferimento Proprio localizzata di cellule o DNA in precoce post-impianto di embrioni di topo

Questo protocollo descrive in dettaglio come trasfettare in modo specifico diverse regioni del sistema nervoso centrale C57BL/6 tramite elettroporazione in utero. Incluso in questo protocollo ci sono istruzioni dettagliate per le trasfezioni delle regioni che si sviluppano nella corteccia, nell'ippocampo, nel talamo, nell'ipotalamo, nel nucleo del setto laterale e nello striato.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, laterale del setto Nucleus- e Striatum specifici<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione in C57BL / 6 del mouse

Questo manoscritto fornisce protocolli che utilizzano in utero elettroporazione (IUE) per descrivere la connettività strutturale dei neuroni a livello di singola cellula e l'eccitabilità dei neuroni fluorescente. Istologia è utilizzato per caratterizzare dendritiche e le proiezioni assonali. registrazione a cellula intera a fette acuta viene utilizzato per studiare l'eccitabilità.

Elettroporazione in utero approcci per studiare l&#39;eccitabilità neuronale sottopopolazioni e connettività single-cell

Presentato qui è un protocollo per eseguire la manipolazione genetica nel cervello furetto embrionale utilizzando in utero elettroporazione. Questo metodo consente di indirizzare le cellule progenitrici neurali nella neocorteccia in vivo.

In Vivo Targeting di cellule progenitrici neurali in Ferret Neocortex di In Utero Electroporation

Scopri la doppia elettroporazione in utero per studiare la corticogenesi nei mammiferi utilizzando embrioni di topo. Questa tecnica permette di visualizzare le interazioni tra popolazioni neuronali temporali e spaziali separate.

Doppia elettroporazione in utero per colpire le popolazioni di cellule temporali e separate spazialmente

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