Quantificare le particelle umane simili al virus Norovirus legandosi ai batteri commensali utilizzando la citometria di flusso
29 aprile 2020
L'obiettivo di questo protocollo è quantificare il legame del patogeno eucatotico norovirus umano ai batteri. Dopo aver eseguito un primo saggio di attaccamento virus-batterio, la citometria di flusso viene utilizzata per rilevare batteri viralmente legati all'interno della popolazione.
Le interazioni virus-batteriche possono essere importanti per un'infezione virale di successo e la stimolazione di una risposta immunitaria ospite. Ma attualmente, lo stock altamente concentrato e purificato di norovirus umano non può essere prodotto in laboratorio. Questa tecnica può essere utilizzata con qualsiasi virus che si lega ai batteri, per i quali sono disponibili particelle simili a virus o virus vivi.
Ci permette di quantificare le interazioni tra questi virus e batteri. Inoculare cinque millilitri di mezzo liquido con una singola colonia isolata di Enterobacter cloacae da una piastra di agar direttamente dallo stock di glicerolo congelato. Fai crescere i batteri durante la notte.
Il giorno seguente, trasferire 1,3 aliquote millilitri della coltura in due tubi di centrifuga separati da 1,5 millilitri. Centrifugare i tubi a 10.000 x g per cinque minuti. Rimuovere i supernatanti, quindi lavare i campioni due volte utilizzando un millilitro di 1X PBS sterile per ogni lavaggio.
Centrifugare nuovamente i campioni a 10.000 x g per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in 1,3 millilitri di 1X PBS sterile. A partire da 0,5 millilitri di coltura lavata, diluire serialmente i batteri in 1X PBS da 10 a meno uno a 10 a meno quattro.
Usando uno spettrofotometro, misurare la densità ottica della coltura non diluita lavata e ciascuna delle quattro diluizioni a 600 nanometri. Eseguire diluizioni seriali di 10 volte in PBS 1X per ciascuna delle diluizioni precedenti. Stendere 100 microlitri delle ultime tre diluizioni per ogni serie su piastre di agar per determinare il numero di unità di formazione della colonia per millilitro per ciascun campione.
Lasciare asciugare le piastre a temperatura ambiente per cinque minuti. Invertire i piatti e incubarli nell'incubatrice. Dopo aver preparato i reagenti, gli anticorpi e i batteri come descritto nel manoscritto, assemblare tutti i materiali in un armadietto di biosicurezza BSL-2.
Particelle simili a virus per il norovirus umano sono elencate come agenti patogeni BSL-2 e tutto il lavoro eseguito utilizzando VLP deve essere condotto in un armadio di biosicurezza certificato. Aggiungere 10 microgrammi di VPP del norovirus umano a ciascun tubo di batteri e mescolare accuratamente mediante pipettazione. Incubare i tubi per un'ora a 37 gradi Celsius con rotazione costante.
Dopo l'incubazione, centrifugare i tubi a 10.000 x g per cinque minuti. Aspirare e scartare il supernatante e rimescolare il pellet batterico in un millilitro di PBS. Dopo aver ripetuto i passaggi di lavaggio una volta, centrifugare nuovamente i tubi a 10.000 X g per cinque minuti.
Scartare il supernatante e rimescolare il pellet di batteri VLP in 150 microlitri di tampone di blocco del 5%. Un errore comune che si verifica è che i tubi vengono scambiati e viene aggiunto il trattamento sbagliato. Per evitare ciò, disporre tutti i tubi in linee che corrispondono al trattamento corretto e aggiungere un trattamento tutto in una volta ai tubi.
Per ogni campione batterico, preparare 50 microlitri di anticorpi GII di norovirus umano diluiti. Utilizzando il tampone di blocco del 5%, diluire l'anticorpo da uno a 125 per i campioni di E.cloacae. Preparare 50 microlitri di anticorpo isotipo diluito per ogni campione batterico utilizzando gli stessi rapporti di diluizione.
Dividere ogni campione di saggio di attacco in 350 aliquote di microlitri trasferendole in tubi di centrifuga puliti da 1,5 millilitri. Per creare controlli non macchiati, aggiungere 50 microlitri di tampone di blocco alla prima aliquota di ogni campione batterico. Per i campioni macchiati, aggiungere 50 microlitri della diluizione dell'anticorpo GII al secondo set di aliquote.
Creare i controlli dell'isotipo aggiungendo 50 microlitri dell'anticorpo dell'isotipo diluito al terzo set di aliquote. Incubare tutti i campioni sul ghiaccio e al buio per 30 minuti. Quindi centrifugare tutti i campioni a 10.000 X g per cinque minuti.
Scartare i supernaganti e resopendire ogni campione in 150 microlitri di FCSB. Ancora una volta, centrifuga tutti i campioni a 10.000 X g per cinque minuti. Ancora una volta, scartare i supernaganti e resostillare i campioni in 100 microlitri di FCSB.
Dopo aver centrifugato i campioni un'ultima volta e aver scartato i supernaganti, ha rimospendato i campioni in 150 microlitri di FCSB. Trasferire ogni campione in un tubo contenente 400 microlitri di FCSB per un volume totale di 550 microlitri. Conservare i campioni a 4 gradi Celsius fino a quando non vengono analizzati dalla citometria del flusso.
L'attacco VLP è stato misurato utilizzando la citometria del flusso. In primo luogo, i grafici di densità sono stati utilizzati per eliminare i detriti cellulari, seguiti da successivi grafici a punti per rimuovere doppietti batterici e grumi cellulari. Gli istogrammi rappresentativi dimostrano una mancanza di segnale PE in campioni solo batterici e uno spostamento dell'intensità del segnale PE nei campioni di batteriO VLP rispetto ai controlli non macchiati e isotipi.
Dopo un'ora di incubazione con 10 microgrammi di VLP, la citometria di flusso ha rilevato il legame delle particelle sia a E.colacae che a L.gasseri. Per determinare il limite di quantificazione vincolante per questo saggio, è stata generata una serie di diluizioni dei VPP prima dell'aggiunta ai batteri. La riduzione della quantità di VLP ha comportato riduzioni corrispondenti alla percentuale di batteri legati da VLP.
Conoscere il rapporto virus-batterio e mantenere il rapporto coerente tra gli esperimenti è importante per interpretare i risultati. Mutanti batterici e virali possono essere generati per determinare specificamente le strutture superficiali microbiche che mediano questa interazione. Questa tecnica consente ai ricercatori di rispondere a domande riguardanti circostanze e condizioni che hanno un impatto sulle interazioni norovirus-batteriche, incluso il modo in cui i cambiamenti nel genotipo del virus, le condizioni di crescita batterica e i cambiamenti nelle strutture superficiali batteriche alterano il legame virale.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo basato sulla citometria a flusso per quantificare il legame di particelle simili a virus (VLPs) del norovirus umano sia a batteri gram-negativi che gram-positivi. Il protocollo consente ai ricercatori di valutare le interazioni tra virus e batteri senza la necessità di utilizzare virus vivi, facilitando gli studi sui meccanismi attraverso i quali i batteri commensali influenzano l'infezione virale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Virologia
- Immunologia
Sfondo
- I batteri commensali possono influenzare l'infezione da virus eucariotici, inclusi il norovirus umano.
- Il legame diretto tra virus e batteri è implicato nel modificare gli esiti dell'infezione.
- I metodi tradizionali di quantificazione richiedono virus vivi, il che rappresenta una difficoltà per il norovirus umano a causa delle problematiche nella produzione di stock virali concentrati.
- Le particelle simili a virus (VLPs) offrono un'alternativa sicura e pratica per lo studio delle interazioni tra virus e batteri.
Scopo dello studio
- Sviluppare e descrivere un saggio di citometria a flusso per quantificare il legame tra VLP del norovirus e batteri.
- Ottimizzare il saggio per una misurazione accurata riducendo al minimo il legame non specifico degli anticorpi.
- Fornire un metodo adattabile ad altri virus che si legano ai batteri.
Metodi Utilizzati
- Coltivazione e preparazione di campioni batterici (ad esempio, Enterobacter cloacae).
- Incubazione dei batteri con VLP del norovirus umano in condizioni controllate.
- Utilizzo di anticorpi specifici per il virus e controlli di isotipo per rilevare il legame dei VLP.
- Analisi mediante citometria a flusso con strategie di gating per escludere detriti e doppietti, e quantificazione dell'adesione dei VLP.
Risultati principali
- La citometria a flusso ha rilevato con successo il legame dei VLP sia con E. cloacae che con L. gasseri.
- Alti rapporti VLP:batterio hanno determinato un legame in una grande percentuale della popolazione batterica.
- La riduzione delle quantità di VLP ha portato a un minore legame batterico, dimostrando la sensibilità del saggio.
- I controlli (batteri soltanto, isotipo) hanno confermato la specificità e ridotto al minimo il segnale di fondo.
Conclusioni
- Il metodo di citometria a flusso descritto consente una quantificazione accurata delle interazioni tra VLP del norovirus e batteri.
- Questo approccio può essere utilizzato per studiare come il genotipo virale, le condizioni di crescita batterica e le strutture superficiali influenzino il legame.
- Il metodo è adattabile ad altri studi sull'interazione virus-batteri in cui siano disponibili VLP o virus vivi.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La quantificazione del legame tra particelle simili a virus (VLP) e batteri commensali mediante citometria a flusso affronta un'importante lacuna nella comprensione delle interazioni tra ospite, microbioma e virus durante le fasi iniziali della scoperta. Questo metodo consente una riduzione dei rischi di natura meccanicistica nei percorsi di infezione virale, fornendo dati quantitativi e riproducibili sul legame tra virus e batteri, senza richiedere l'uso di virus vivi. L'approccio supporta una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi e orienta le decisioni di portafoglio nella ricerca sulle malattie infettive.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi delle interazioni tra virus e microbioma rilevanti per i meccanismi di infezione.
- Supporta la validazione funzionale di bersagli quantificando eventi diretti di legame.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistica delle relazioni ospite-patogeno nei percorsi di scoperta.
- Fornisce dati quantitativi per informare la previsione dell'affidabilità nei programmi in fase iniziale.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi batterici validati per saggi successivi di legame virale.
- Standardizza le condizioni del saggio utilizzando controlli di isotipo e controlli con soli batteri per garantire riproducibilità.
- Genera output quantitativi adatti per studi di screening e comparativi.
- Consente una valutazione affidabile di mutanti virali e batterici per la specificità di legame.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea ai sistemi rilevanti per la malattia modellando le interazioni tra batteri commensali e virus.
- Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica dei meccanismi di infezione.
- Fornisce una piattaforma per l'avanzamento di ipotesi meccanicistiche con rischio adeguatamente valutato.
- Facilita l'indagine dei determinanti strutturali che influenzano gli esiti traduttivi.
Integrazione della Pipeline e del Flusso di Lavoro
Questo metodo di quantificazione basato sulla citometria a flusso si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica nella ricerca sulle malattie infettive e sul microbioma.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su come le strutture superficiali dei batteri mediano il legame virale.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili per confrontare genotipi virali e ceppi batterici.
- Analisi: Offre output statistici sull'efficienza del legame e sulla sensibilità del saggio.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro a modelli preclinici di potenziamento dell'infezione.
- Riutilizzo aziendale: Adattabile ad altri sistemi virus-batteri in cui siano disponibili VLP o virus vivi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nei modelli di infezione.
- Valore operativo: Standardizza la quantificazione del legame virus-batteri per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione e riduce i rischi biologici in fase avanzata nei portafogli di malattie infettive.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione corretta per rischio degli obiettivi meccanicistici e delle ipotesi traslazionali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche in citometria a flusso e preparazione di campioni microbiologici.
- Necessita dell'accesso a strutture di livello di biosicurezza 2 (BSL-2) e a strumentazione analitica per la manipolazione delle particelle virali (VLP).
- Richiede una rigorosa standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda controlli e strategie di gating.
- È adattabile a diverse specie batteriche e genotipi virali, purché si utilizzino controlli adeguati.
- La sensibilità del saggio dipende da rapporti costanti tra VLP e batteri e da reagenti validati.
