Name: Generazione rapida e senza soluzione di continuità di poxvirus ricombinanti utilizzando la gamma host e la selezione visiva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Scopri come generare poxvirus ricombinanti senza soluzione di continuità utilizzando la selezione host-range e marcatori fluorescenti. Questo metodo combina ricombinazione omologa con selezione transitoria dominante per la produzione di vaccini.

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Questo progetto è stato finanziato dai National Institutes of Health (AI114851) a SR.

1. Generazione del vettore di ricombinazione
<ol><li>Progettare i numeri primi per generare la cassetta di selezione. Progettare ogni singolo amplificatore con sequenze sovrapposte con amplificatori vicini e il vettore per facilitare l'assemblaggio enzimatico isotermico di molecole di DNA, chiamato anche assemblaggio Gibson, utilizzando uno dei diversi strumenti di progettazione primer online. NOTA: questo protocollo può essere completato anche utilizzando i metodi tradizionali di clonazione basati su endonuclease. In tal caso, progettare i numeri di prima livello con i siti di restrizione appropriati anziché con sequenze sovrapposte.</li>
	<li>Utilizzando i primer progettati nel passaggio 1.1, la PCR amplifica i seguenti elementi in ordine da 5' a 3' (Figura 1): 500 nucleotidi della regione genomica VACV 5' di E3L (5' braccio), EGFP o il gene di interesse, 150 nucleotidi dalla regione genomica VACV immediatamente 3 di E3L (corto 3' braccio), un promotore di poxvirus precoce/tardire sintetico25, il gene di fusione mCherry-E3L e i nucleotidi 500 dalla regione genomica VACV 3' di E3L compreso il braccio corto 3' (lungo 3' braccio).<ol>
<li>In un tubo PCR, aggiungere i reagenti nel seguente ordine per ogni amplificatore: 17 luna di acqua libera DNase, 1,2 l di ogni primer (concentrazione iniziale concentrazione finale: 0,5 m), 5 luna di buffer di reazione PCR 5x, DNA modello (10 ng per gli amplificatori amplificati da plasmidi: EGFP e e/L promoter-mCherry-E3L cassetta; 100 ng per amplificatori amplificati dal DNA genomico virale: 5' e 3') e 0,5 L di polimerasi di DNA. Regolare il volume d'acqua aggiunto per un volume di reazione finale di 50.L. NOTA: La concentrazione del DNA del modello deve essere determinata empiricamente, ma generalmente iniziamo con 10 ng/reazione.</li>
		<li>Mettere i tubi in un termociclista, sciogliere il DNA a 98 gradi centigradi per 30 s, quindi utilizzare 25 giri di un protocollo PCR in tre fasi: 98 gradi centigradi per 5 s, 55 gradi c per 10 s e 72 gradi per 1 min. NOTA: Determinare la temperatura di fusione in base al Tm suggerito dal produttore per ogni set di primer. Determinare il tempo di estensione appropriato in base alla lunghezza di ciascun amplificatore (1 minuto/kb).</li>
	</ol></li>
	<li>Visualizza i prodotti di amplificazione su un gel di agarose dell'1%. Aggiungete 10 l di ciascun prodotto di DNA e 2 l di tampone di carico a ciascun pozzo, e eseguite a 8 V/cm per 1 h.</li>
	<li>Gel purifica ogni amplificatore utilizzando un kit di estrazione gel di DNA e il protocollo del produttore. Eluire gli amplicons dalla colonna aggiungendo 50 -L di acqua libera da DNase e centrifugando immediatamente.</li>
	<li>Linearizzare il vettore di clonazione pUC19 utilizzando la digestione endonucleale EcoRI. Ad un tubo, aggiungere 1 g di pUC19, acqua a un volume di 17 L, 2 L di buffer di reazione e 1 L (20 unità) di EcoRI. Incubare a 37 gradi centigradi per 1 ora.<ol>
<li>Visualizzate i prodotti di amplificazione su un gel di agarose dell'1% eseguito a 8 V/cm per 1 h. Accisie la banda dal gel e purificate il prodotto utilizzando il kit di estrazione del gel di DNA come descritto al punto 1.4.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligate tutti i singoli, gel purificati ampi e il vettore linearizzato utilizzando un kit master mix.<ol>
<li>Ad un tubo PCR, aggiungere 0,2 pmol di pUC19 linearizzato e ogni amplificatore (braccio 5', EGFP, braccio corto 3', e/l promotore-mCherry-E3L cassetta, 3'braccio). Aggiungere l'acqua libera di DNase ad un volume finale di 10 o L, quindi aggiungere 10 L di miscela master di assemblaggio del DNA. Incubare campioni a 50 gradi centigradi per 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasformare l'E. coli chimicamente competente con 2 l del prodotto assemblato dal punto 1.6 come descritto in precedenza26,27. Piastra 100 L delle cellule trasformate su piastre di agarose LB che contengono 100 g/mL di ampicillina. Incubare le piastre durante la notte a 37 .</li>
	<li>Scegli colonie ben isolate e trasferisci singole colonie su tubi contenenti brodo di Luria con 100 ampicillina. Incubare i tubi per una notte a 37 s mentre si agita a 225 giri/min.</li>
	<li>Isolare i plasmidi dalla cultura notturna utilizzando un kit miniprep plasmide. Controllare la concentrazione e la purezza del DNA utilizzando uno spettrofotometro. Un rapporto A260/A280 compreso tra 1,8 e 2,0 è accettabile.</li>
	<li>Inviare i plasmidi per il sequenziamento di Sanger per determinare se il prodotto di clonazione desiderato è corretto. Conservare il DNA a -20 gradi centigradi.</li>
</ol>2. Generazione del virus ricombinante
<ol><li>Infettare un monostrato confluente di cellule adatte con il virus da ricombinedcombined a una molteplicità di infezione di 1,0 (MOI - 1,0) in una piastra a 6 pozze. Incubare le cellule infette a 37 e 5% di CO2 per 1 h. Quindi aspirare il mezzo e sostituirlo con DMEM fresco. Incubare le cellule infette a 37 e 5% di CO2. NOTA: Per la replicazione virus competenti come un virus vaccinia che manca K3L22, una linea cellulare come la linea cellulare renale coniglio europeo RK13 (ATCC #CCL-37) o BSC-40 è appropriata. Tuttavia, per i virus carenti di replicazione, come il virus descritto in questo documento privo sia di PKR antagonisti E3L e K3L, è necessaria una linea cellulare complementare che esprima questi due geni nelle cellule trans o PKR knock-down o knock-out.</li>
	<li>Trasfecare le cellule infette con 500 ng del vettore generato e convalidato nel passaggio 1.10 utilizzando un reagente di trasfezione disponibile in commercio seguendo il protocollo del produttore. Incubare le cellule a 37 e 5% CO2 per 48 h. NOTA: Se si utilizza un virus vaccinia privo di E3L e K3L, la pressione selettiva mediata da PKR guiderà la selezione di virus ricombinati e manterrà l'espressione della proteina di fusione mCherry-E3L in queste cellule. Se lo si desidera, dovrebbe anche essere possibile amplificare PCR solo l'inserto da utilizzare per la trasfezione invece dell'intero plasmide.</li>
	<li>48 ore dopo l'infezione, raccogliere il monostrato infetto. In alcuni casi, le cellule possono essere raccolte tramite pipettaggio, ma se sono ancora strettamente aderenti, raccoglile con un raschietto cellulare. Congelare le cellule tre volte, e poi sonicare i lisati per 15 s al 50% di ampiezza. Conservare questo lisato a -80 gradi centigradi fino a quando non è pronto per l'uso.</li>
	<li>Diluire in modo seriale il lisato raccolto al punto 2,3 da 10-1 a10-6 aggiungendo 120 luna del lisato a 1080 gradi di DMEM (10-1), e quindi aggiungendo 120 l di questa diluizione a 1080 ldi dMEM (10-2) e ripetendo questo processo altre quattro volte. Aggiungere 1 mL di ogni diluizione a un singolo pozzo confluente di una linea cellulare competente PKR, in questo caso cellule RK13.<ol>
<li>Incubare le cellule infette a 37 e 5% di CO2 per 1 h. Quindi aspirare il mezzo e sostituirlo con DMEM fresco Incubare le cellule infette a 37 e 5% CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>24-48 ore dopo l'infezione, identificare i virus ricombinanti mediante microscopia a fluorescenza. Le placche dei virus ricombinanti esprimono fluorescenza rossa a causa dell'integrazione del gene di fusione mCherry-E3L (Figura 2). Se inizialmente è stato utilizzato un virus privo di inibitori del PKR, tutte le placche conterranno virus ricombinante.</li>
	<li>La placca purifica i virus ricombinanti tre volte sulle cellule RK13. Dopo l'ultimo giro di purificazione della placca, tutte le placche devono esprimere fluorescenza rossa.</li>
	<li>Infettare una piastra confluente a 6 pozze di cellule DI RK13 che esprimono gli inibitori vaCV PKR E3L e K3L (RK13-E3L-K3L cellule28) con il virus di fluorescinaggio rosso purificato dalla placca dal passo 2.6. Mirare a circa 50-100 placche per pozzo. NOTA: Queste cellule forniscono gli antagonisti VACV PKR in trans e alleviano la pressione selettiva mediata dal PKR per mantenere il gene di fusione mCherry-E3L, promuovendo così la generazione "senza cicatrici" del virus ricombinante.</li>
	<li>Identificare i virus collassati mediante microscopia a fluorescenza utilizzando un microscopio EVOS2 e un cubo di filtro GFP (Eccitazione: 470/22, Emissione: 525/50) e un cubo di filtro RFP (Eccitazione: 531/40, Emissione: 593/40). NOTA: La frequenza con cui viene perso il gene di fusione mCherry-E3L è di circa il 2,5%(tabella 2). Se EGFP non è incluso come gene marcatore, le placche di virus mutanti che hanno perso il gene di fusione mCherry-E3L saranno incolore.</li>
	<li>La placca purifica le placche solo verdi (VC-R4) o incolore (E3L) per tre volte sulle cellule RK13-E3L-K3L. Assicurarsi che non si fluoriscano in rosso.</li>
	<li>Confermare la perdita di mCherry-E3L e la presenza della mutazione prevista da parte del sequenziamento PCR e Sanger. NOTA: Se il gene o la mutazione di interesse non ha attività inibitoria del PKR, i virus ricombinanti devono essere coltivati su cellule RK13-E3L-K3L o una linea cellulare equivalente inibita al PKR o carente di PKR (Figura 3).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Qui presentiamo una variazione di una strategia di selezione dei marcatori transitoria 32 per generare virus della vaccino ricombinante senza trattenere il DNA estraneo nel virus ricombinante finale. La nostra strategia utilizza una pressione selettiva mediata dalla proteina antivirale ospite PKR piuttosto che da altre forme di pressione selettiva come gli antibiotici. L'uso di geni antivirali ospiti elimina la possibilità di cambiamenti fenotipici indotti chimicamente nelle cellule o un aumento d...

Il virus Vaccinia (VACV) è stato determinante per la prima eradicazione di successo di un patogeno umano, il virus variola (VARV), dalla natura. Fin dallo sterminio del virus della variola, i poxvirus tra cui VACV hanno continuato ad essere utili virus terapeutici sia per la medicina umana che per quella animale. Ad esempio, un vaccino contro il virus della rabbia basato su VACV è stato molto efficace nel prevenire la trasmissione della rabbia silvatica in Europa1 e negli Stati Uniti2. Più recentemente, i poxvirus ricombinanti che esprimono una varietà di molecole antitumorali (ad esempio, anticorpi a catena singola o eritropoietina umana) hanno visto un successo incoraggiante come agenti oncolitici3,4,5. VACV è particolarmente attraente come vettore perché è facilmente suscettibile di manipolazione genetica, possiede una vasta gamma di ospiti, ed è stabile in una varietà di condizioni, consentendo un facile trasporto e la vitalità del vaccino nel campo6,7. Mentre sono state sviluppate diverse tecniche per generare VACV ricombinante per esperimenti di laboratorio e generazione di vaccini, le attuali strategie per generare questi virus hanno notevoli limitazioni.
Grazie all'utilità di VACV, sono state sviluppate più strategie per generare virus ricombinanti. La prima strategia utilizza una ricombinazione omologa per introdurre una cassetta che include il transgene e un gene marcatore selezionabile come un gene di resistenza agli antibiotici. La cassetta è affiancata da due nucleotidi da 500 dollari (nt) o bracci più grandi che indirizzano il gene verso un sito specifico del genoma virale, che viene poi stabilmente integrato da eventi crossover doppi8,9,10. Questa strategia è rapida ed efficiente; tuttavia, si traduce in materiale genetico extra sotto forma di gene marcatore che può produrre effetti imprevisti. Inoltre, esiste un limite massimo pratico al numero di transgeni che possono essere introdotti limitata dal numero di marcatori unici selezionabili disponibili. Le strategie di selezione dominante transitoria (TDS) hanno affrontato questo problema facilitando la generazione di virus ricombinanti "senza cicatrici"11. Utilizzando questa strategia, un plasmide contenente un gene MUTANTe VACV e un gene marcatore selezionabile sono integrati nel genoma virale, ma senza ulteriore fianco DNA VACV affiancato. Questo approccio si traduce nell'integrazione transitoria dell'intero plasmide e nella duplicazione del gene VACV come risultato dell'integrazione da parte di un singolo evento di crossover. Questo intermedio è stabile finché viene mantenuto sotto pressione di selezione, permettendo l'arricchimento di questo costrutto. Quando la selezione viene rimossa, la duplicazione VACV consente un secondo evento di crossover che comporta la rimozione del plasmide e la successiva formazione del virus di tipo selvaggio (wt) o ricombinante in un rapporto approssimativo di 50:50. Mentre tDS genera virus ricombinanti senza richiedere l'introduzione stabile del DNA estraneo, più cloni di virus devono essere sottoposti a screening per la mutazione prevista mediante l'analisi del sequenziamento, un passo potenzialmente dispendioso in termini di tempo e denaro.
Qui, presentiamo un approccio alla generazione di poxvirus ricombinanti che combinano i migliori aspetti di ciascuno di questi approcci, simile a un approccio che è stato descritto per la replica incompetente modificato vaccini Ankara12,13,14. Questa strategia combina la selezione della gamma visiva e dell'ospite per generare rapidamente virus ricombinanti mediante eventi di crossover doppi e successivamente elimina il gene marcatore selezionabile mediante la ricombinazione omologa. Questo approccio consente la rapida generazione di mutanti mediati dalla ricombinazione omologa, con la natura "senza cicatrici" degli approcci TDS, pur non richiedendo una successiva fase di screening per distinguere il tipo selvaggio e i virus mutanti. Il nostro metodo utilizza anche la selezione della gamma host al posto della selezione degli antibiotici, eliminando il rischio di cambiamenti fenotipici chimicamente indotti nella linea cellulare. Per questo approccio, abbiamo scelto di utilizzare la proteina antivirale ospite chinasi R (PKR) come agente selettivo per generare VACV ricombinante. PKR è espresso come un monomero inattivo nella maggior parte dei tipi di cella15. Quando si lega l'RNA a doppio filamento (dsRNA) nei domini di legame dsRNA del terminale N, pKR si dimerde e viene autofosforelofillato16. Questa forma attiva di fosforolato PKR la sottounità alfa del fattore di avvio eucariotico 2 (eIF2), inibendo infine la consegna di frattempo meticonil-tRNA al ribosoma, impedendo così la traduzione intracellulare e inibendo ampiamente la replicazione di molte famiglie virus17,18.
In risposta all'ampia e potente attività antivirale del PKR, molti virus hanno sviluppato almeno una strategia per prevenire l'attivazione del PKR. La maggior parte dei poxvirus esprime due antagonisti del PKR, codificati dai geni E3L e K3L in VACV, che antagonizzano il PKR attraverso due meccanismi distinti19. E3 previene l'omodimerizzazione del PKR legando l'RNA a doppio filamento20,21, mentre K3 agisce come un inibitore pseudosubstrate legandosi direttamente al PKR attivato e quindi inibendo l'interazione con il suo substrato eIF2 .22 È importante sottolineare che questi due antagonisti del PKR non inibiscono necessariamente il PKR a tutte le specie. Ad esempio, l'omolologo K3 del virus del vaiolo delle pecore inibiva fortemente il PKR dalle pecore, mentre il pologio di pecora E3 non mostrava una notevole inibizione del PKR23,24. In questo studio, presentiamo un metodo per utilizzare la pressione selettiva mediata da PKR combinata con la selezione della fluorescenza per generare un ricombinante VACV eliminato per E3L e K3L (VC-R4), che non può replicare in cellule competenti pKR derivate da specie diverse. Questo virus ricombinante fornisce un eccellente background per la generazione rapida di virus ricombinanti che esprimono geni sotto il controllo del promotore nativo E3L.

<table><tbody><tr><td>2X-Q5 Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492L</td><td>Polimerasi ad alta fedeltà utilizzata nella PCR</td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11593027</td><td>Agente selettivo batterico</td></tr><tr><td>Raschietti cellulari monouso</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-100-242</td><td>Raschietto cellulare per raccogliere cellule infette</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto 2 Sistema di imaging cellulare</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMAFD2000</td><td>Microscopio a fluorescenza</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube, GFP</td><td>ThermoFisher</td><td>AMEP4651</td><td>GFP Cube</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube, RFP</td><td>ThermoFisher</td><td>AMEP4652</td><td>RFP Cube</td></tr><tr><td>GenJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100489</td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Brodo</td><td>Gibco</td><td>10855021</td><td>Terreno di crescita batterica</td></tr><tr><td>Kit di estrazione</td> <td>del gel di DNA MonarchNEB</td><td>T1020L</td><td>Kit di purificazione del gel utilizzato per purificare ampliconi e vettori linearizzati Kit</td></tr><tr><td>di minipreparazione del plasmide Monarch</td><td>NEB</td><td>T1010L</td><td>Kit di miniprep utilizzato per purificare i plasmidi</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Spettrofotometro ND-ONE-W</td><td>utilizzato per misurare la concentrazione di RNA e DNA</td></tr><tr><td>NEBuilder Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td>Kit di montaggio enzimatico isotermico utilizzato per generare il vettore di ricombinazione</td></tr><tr><td>Q500</td><td>Sonicatore Qsonica</td><td>Q500-110</td><td>Sonicatore per lisati virali</td></tr><tr><td>Cellule RK13</td><td>ATCC</td><td>CCL-37</td><td>Cellule renali di coniglio</td></tr><tr><td>VWR Piastre per colture cellulari multipozzetto VWR</td><td></td><td>10062-892</td><td>Piastre per colture cellulari</td></tr></tbody></table>

generazione rapida e senza soluzione di continuità di poxvirus ricombinanti utilizzando la gamma host e la selezione visiva

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Il virus Vaccinia (VACV) è stato determinante per eradicare il virus variola (VARV), l'agente causale del vaiolo, dalla natura. Dal suo primo utilizzo come vaccino, VACV è stato sviluppato come vettore per i vaccini terapeutici e come virus oncolitico. Queste applicazioni sfruttano il genoma facilmente manipolabile di VACV e l'ampia gamma di host come una piattaforma eccezionale per generare virus ricombinanti con una varietà di applicazioni terapeutiche. Sono stati sviluppati diversi metodi per generare VACV ricombinante, tra cui metodi di selezione dei marcatori e selezione dominante transitoria. Qui, presentiamo un perfezionamento di un metodo di selezione dell'intervallo host accoppiato con l'identificazione visiva dei virus ricombinanti. Il nostro metodo sfrutta la pressione selettiva generata dalla proteina antivirale ospite chinasi R (PKR) accoppiata con un gene di fusione fluorescente che esprime E3L con tag mCherry, uno dei due antagonisti VACV PKR. La cassetta, compreso il gene di interesse e la fusione mCherry-E3L, è affiancata da sequenze derivate dal genoma VACV. Tra il gene di interesse e mCherry-E3L c'è una regione più piccola che è identica ai primi 150 nucleotidi del braccio da 3', per promuovere la ricombinazione omologa e la perdita del gene mCherry-E3L dopo la selezione. Dimostriamo che questo metodo consente una generazione efficiente e senza soluzione di continuità di rVACV in una varietà di tipi di cellule senza richiedere la selezione di farmaci o uno screening completo per i virus mutanti.

Abbiamo usato la procedura illustrata nella Figura 1 per generare un VACV privo sia di PKR antagonisti E3L che di K3L, sostituendo E3L con EGFP in un virus già eliminato per K3L (vP872). La figura 2 mostra le placche fluorescenti rosse nelle cellule RK13 competenti di PKR che indicano l'espressione virale di mCherry-E3L, nonché EGFP espresse nelle cellule RK13-E3L-K3L che confermano la perdita di E3L e il collasso del marcatore di selezione mCherry-E3L. <strong ...

Questo è un metodo per generare virus vaccinia ricombinanti "senza cicatrici" utilizzando la selezione host-range e l'identificazione visiva dei virus ricombinanti.

Generazione rapida e senza soluzione di continuità di poxvirus ricombinanti utilizzando la gamma host e la selezione visiva

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Il nostro metodo utilizza la selezione della gamma host e marcatori fluorescenti per la generazione efficiente e senza soluzione di continuità del virus vaccina ricombinante in una varietà di tipi di cellule. Questa tecnica combina la velocità di ricombinazione omologa con la natura scarless della selezione dominante transitoria. Inoltre, ospitiamo la selezione dell'intervallo per eliminare la possibilità di cambiamenti prodotti chimicamente.Questo metodo può anche essere utilizzato per modificare il virus vaccinia o altri poxvirus per esprimere geni estranei, ad esempio, per generare vaccini. Se si esegue questo protocollo solo con la selezione della fluorescenza, è necessario assicurarsi di vagliare abbastanza virus da rilevare un ricombinante relativamente raro senza pressione selettiva PKR. Questo metodo si basa sul guadagno e sulla perdita di marcatori fluorescenti per selezionare correttamente i virus che hanno acquisito le cassette di ricombinazione e per rilevare virus che hanno ricombinato senza cicatrici.Per generare un vettore di ricombinazione, aggiungere prima 17 microlitri di acqua libera della DNasi, 1,2 microlitri di ogni primer, cinque microlitri di tampone di reazione PCR 5x, DNA modello e 0,5 microlitri di DNA polimerasi a un tubo PCR per amplicon. Aggiungere ulteriore acqua priva di DNasi per portare il volume finale in ogni tubo a 50 microlitri. E posizionare i tubi in un termociclo.Sciogliere il DNA a 98 gradi Celsius per 30 secondi prima di utilizzare 25 passaggi di un protocollo PCR in tre passaggi come indicato. Per visualizzare i prodotti di amplificazione su un gel di agarosio dell'1%, aggiungere 10 microlitri di ogni prodotto dna e 2 microlitri di buffer di carico ad ogni pozzo. Eseguire il gel per un'ora a otto volt per centimetro.Alla fine della corsa, utilizzare un kit di estrazione del gel di DNA secondo il protocollo del produttore per purificare ogni amplicon. Elute gli ampli dalla colonna con 50 microlitri di acqua libera da DNasi e centrifugazione immediata. Per linearizzare un vettore di clonazione, aggiungere prima un microgrammo del vettore, 17 microlitri di acqua libera della DNasi, 2 microlitri di buffer di reazione e 1 microlitro di EcoRI a un tubo per un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius.Alla fine dell'incubazione, aggiungere 0,2 picomoli del vettore linearizzato 10 microlitri di acqua libera della DNasi e 10 microlitri di mix principale di assemblaggio del DNA ad ogni amplicono isolato. Incubare campioni a 50 gradi Celsius per un'ora. Al termine dell'incubazione, trasformare E.coli chimicamente competente con due microlitri del prodotto assemblato secondo protocolli standard.Piastra 100 microlitri di cellule trasformate su piastre di agarosio LB integrate con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. Dopo l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius, selezionare colonie ben isolate per l'inoculazione nel brodo di Luria integrate con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina durante la notte a 37 gradi Celsius e 225 giri al minuto. La mattina dopo, usa un kit di miniprep plasmide per isolare i plasmidi.E controllare la concentrazione e la purezza del DNA su uno spettrofotometro. Per la generazione di virus ricombinanti, infettare un monostrato confluente di cellule adatte con il virus da ricombinare a una molteplicità di infezione di uno su una piastra a sei pozzi. E incubare le cellule infette a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un'ora.Al termine dell'incubazione, sostituire il supernatante in ogni pozzo con DMEM fresco e utilizzando un reagente di trasfezione disponibile in commercio secondo il protocollo del produttore. Aggiungere a ciascun pozzo tre microgrammi del vettore di ricombinazione di interesse. Posizionare la piastra nell'incubatore per ulteriori 48 ore.Prima di mettere in comune le cellule da ogni condizione di trasfezione in singoli tubi da 1,5 millilitri. Quindi congelare le cellule raggruppate tre volte prima di sonicare i lisciviati risultanti per 15 secondi a un'ampiezza del 50%. Successivamente, diluire serialmente 10 volte il lysato sonicato, raccolto da 10 alla prima a 10 alla sesta concentrazione in DMEM fresco e aggiungere un millilitro di ogni diluizione ai singoli pozzi confluenti di una linea cellulare competente della protein chinasi R.Posizionare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per un'ora prima di sostituire i supernaganti con mezzo fresco e riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare. Dopo 24-48 ore, identificare i virus ricombinanti mediante microscopia a fluorescenza. Le placche provenienti da virus ricombinanti esprimono fluorescenza rossa dovuta all'integrazione del gene di fusione mCherry-E3L.La placca purifica i virus ricombinanti tre volte su cellule selvatiche di tipo RK13. Dopo tre cicli di purificazione della placca, infettare le cellule RK13+E3L+K3L con diluizioni seriali del lisato di placca. Identificare i virus collassati, mediante microscopia a fluorescenza utilizzando un adeguato sistema di imaging dotato di cubi filtranti GFP e RFP.Quindi la placca purifica le placche VC-R4 solo verdi o E3L incolori tre volte sulle cellule RK13+E3L+K3L. Assicurarsi che nessuna placca fluoresce rosso. Infettare le cellule con almeno 100 unità di formatura della placca per aumentare le possibilità di identificare una placca incolore.In rari casi, potrebbero essere necessari più cicli di infezione. Le placche fluorescenti rosse nelle cellule RK13 della protein chinasi R competenti sono indicative dell'espressione virale di mCherry-E3L. E placche o placche incolori che esprimono solo eGFP nelle celle RK13+E3L+K3L confermano il collasso del marcatore di selezione mCherry-E3L.Il virus ricombinante VC-R4, che manca di entrambi gli antagonisti della protein chinasi R, non può replicarsi nelle cellule RK13 della protein chinasi R competente mentre l'apparente virus VP872, che esprime E3L è competente per la replicazione. Per confermare che questa incapacità di replicarsi nelle cellule RK13 era dovuta solo alla perdita di E3L, il GFP potenziato è stato sostituito con E3L nel virus VC-R4. Ha generato un virus rilevante utilizzando lo stesso protocollo di selezione.È interessante notare che, pur rendendo questo virus, sono state identificate placche incolori coerenti con il collasso del marcatore di selezione mCherry-E3L prima della selezione nelle cellule RK13+E3L +K3L che sono generalmente necessarie per selezionare ricombinanti senza cicatrici. Probabilmente a causa dell'identità di sequenza estesa tra la cassetta di ricombinazione mCherry-E3L e il gene E3L inserito in VC-R4. In media il 12,6% dei virioni di progenie è stato sottoposto a ricombinazione con il plasmide trasfetto, simile alle frequenze precedentemente riportate.Qui viene mostrata la frequenza delle placche incolori rispetto alle placche totali RK13+E3L+K3L, dimostrando che la velocità di collasso e la perdita del marcatore di selezione mCherry-E3L si sono verificate ad una frequenza di circa l'1,8%. Nella prima fase l'utilizzo di cellule competenti PKR garantisce che tutte le placche con virus ricombinante contenuto. Nella seconda fase l'utilizzo di cellule carenti di PKR consente il rilevamento di virus ricombinante con un collasso mCherry-E3L locus.Questo approccio ci consente di generare rapidamente virus contenenti geni esogeni, ad esempio, per la produzione di vaccini offrono l'espressione di diversi antagonisti virali della PKR. facilitare l'analisi delle interazioni specifiche delle specie con PKR provenienti da vari host.

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