Name: Un saggio basato sullelettrochemiluminescenza per le varianti proteiche MeCP2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Impara a quantificare le varianti proteiche MeCP2 con l'immunoassay a elettrochemiluminescenza ECLIA. Questo metodo offre maggiore sensibilità e riproducibilità rispetto al Western blot per studi di neuroscienza.

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Siamo molto grati alla dott.ssa Brigitte Sturm per il suo sostegno con lo strumento ECLIA.

L'approvazione per l'approvvigionamento di biopsia cutanea a scopo di ricerca è stata ottenuta dal Comitato Etico della Ricerca Umana dell'Ospedale pediatrico di Westmead, Australia. Il consenso per gli esperimenti sugli animali è stato ottenuto dal Ministero federale austriaco della scienza, della ricerca e dell'economia, che sono stati effettuati in conformità con le normative locali sul benessere degli animali (G: 66.009/0218-II/3b/2015).
NOTA: il principio del sistema ECLIA è illustrato nella figura 1.
1. Selezione anticorpale
<ol><li>Valutare il rapporto segnale-rumore per una gamma di vari anticorpi MeCP2 e identificare la migliore potenza del segnale e la massima specificità all'interno della combinazione di un anticorpo MeCP2 monoclonale del topo primario (clone Mec-168) e dell'anticorpo di rilevamento policlonale meCP2 del coniglio (fatto su misura). Per l'anticorpo secondario, utilizzare un anticorpo specifico del sistema (Tabella dei materiali), anch'esso verificato sperimentalmente. NOTA: La tabella 1 fornisce una panoramica di tutti gli anticorpi verificati durante lo sviluppo MeCP2-ECLIA e delle loro gamme di diluizione testate.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Funzione</td>
			<td>Nome</td>
			<td>Clone</td>
			<td>Diluizione</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primario</td>
			<td>Mouse, anti-MeCP2</td>
			<td>Mec-168</td>
			<td>1:500-1:10.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primario</td>
			<td>Mouse, anti-MeCP2</td>
			<td>4B6 (in inglese)</td>
			<td>1:250-1:4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primario</td>
			<td>Mouse, anti-MeCP2</td>
			<td>Uomini-8</td>
			<td>1:500-1:4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primario</td>
			<td>Mouse, anti-MeCP2</td>
			<td>1B11 (in tissuma</td>
			<td>1:500-1:4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primario</td>
			<td>Coniglio anti-MeCP2</td>
			<td>D4F3</td>
			<td>1:500-1:4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Secondario</td>
			<td>Coniglio anti-MeCP2</td>
			<td>Policlonale</td>
			<td>1:2,000-1:20.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Secondario</td>
			<td>Coniglio anti-MeCP2</td>
			<td>Policlonale</td>
			<td>1:2,000-1:20.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rilevamento</td>
			<td>SulFO-TAG etichettato anti-coniglio</td>
			<td>Policlonale</td>
			<td>1:500-1:1.000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Elenco degli anticorpi e diluazioni di lavoro usate.
<ol start="2"><li>In alternativa, utilizzare ogni coppia di anticorpi MeCP2 che funziona bene con ELISA convenzionale.</li>
</ol>2. Trattamento delle MGIF con proteina di fusione TAT-MeCP2
NOTA: TAT-MeCP2 è stato espresso in ricombinante in Escherichia coli e purificato utilizzando tecniche cromatografiche standard come descritto in precedenza8 e conservato a -80 gradi centigradi.
<ol><li>Piastra 1 x 106 cellule del fibroblasto dermico umano (HDF) in piatti da 100 mm e far crescere le cellule durante la notte a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 fino a raggiungere circa il 90% di confluenza.</li>
	<li>Estrarre una fiala di proteina di fusione TAT-MeCP2. Scongelare sul ghiaccio e mescolare delicatamente.</li>
	<li>Diluire TAT-MeCP2 ad una concentrazione finale di 500 nM in 50 mL di supporti di coltura HDF.</li>
	<li>Rimuovere il supporto da piatti da 100 mm e incubare le cellule con 500 nM TAT-MeCP2 a 37 gradi centigradi per vari periodi di incubazione fino a 24 h.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione TAT-MeCP2 dalle celle. Lavare le cellule 2x con la salina preriscaldata di Dulbecco (DPBS).</li>
	<li>Trattare le cellule con 2 mL di 0.05% soluzione trypsin-EDTA per 5 min a 37 c10.</li>
	<li>Aggiungere 6 mL di supporti di coltura HDF per disattivare la trypsin e raccogliere le cellule in tubi da 15 mL.</li>
	<li>Pellet le cellule per centrifugazione a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e lavare le cellule 2x con DPBS ghiacciato. Conservare il pellet sul ghiaccio e procedere con la preparazione del campione.</li>
</ol>3. Preparazione dei campioni
<ol><li>Listi HDF<ol>
<li>Determinare i livelli proteici più alti di MeCP2 utilizzando il metodo REAP per la frazione subcellulare nei compartimenti subcellulari e citoplasmati secondo Suzuki et al.11. Limitare la frazione a non più di sei campioni per esperimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lismi cerebrali di topo<ol>
<li>Preparare 100 mL di ogni reagente ipotonico di lisi e buffer di estrazione.<ol>
<li>Per il reagente di lisi ipotonica, mescolare ben 10 mM HEPES, 1,5 mM di cloruro di magnesio e 10 mM di cloruro di potassio.</li>
			<li>Per il buffer di estrazione, mescolare bene 20 mM di clordino, 1,5 mM di cloruro di magnesio, 0,42 M di cloruro di sodio, 0,2 mM EDTA e 25% (v/v) glicerolo.</li>
			<li>Regolare il pH di entrambi i buffer su 7.9.</li>
			<li>Aggiungere 1 mM dithiothreitol (DTT) e 1x cocktail inibitore proteasi a entrambi i buffer al fresco. Raffreddare sul ghiaccio prima dell'uso.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sospendere 100 mg di cervello topo totale (ceppo: C57BL/6J, wildtype maschio e femmina e B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J, maschio eterozigoo femmina; età: 4-8 settimane) in 1 mL di reagente lisi ipotonico freddo.</li>
		<li>Omogeneizzare il cervello con un omogenizzatore di tessuto di tessuto di vetro pre-freddo da 15 colpi di omogeneizzatore A (sciolto, per grande distanza) e B (stretto, per piccola distanza), rispettivamente.</li>
		<li>Trasferire le cellule omogeneizzate in un tubo pulito e centrifugare a 10.000 x g per 20 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante (o tenerlo come frazione citoplasmatica per un ulteriore uso).</li>
		<li>Risospendere il pellet in 140 : L di buffer di estrazione per 100 mg di materiale di partenza. Mettere il tubo in un termoblocco pre-raffreddato e mescolare delicatamente per 30 min a 4 gradi centigradi.</li>
		<li>Centrifugare il tubo a 16.000 g per 10 min a 4 gradi centigradi. Trasferire il supernatante (cioè la frazione nucleare) in un nuovo tubo pre-raffreddato e conservarlo a -80 gradi centigradi fino all'uso. NOTA: La concentrazione proteica di lismi derivati dal cervello di topo e dall'HDF può essere valutata dall'analisi della proteina BCA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Protocollo MeCP2-ECLIA
<ol><li>Preparazione della soluzione di lavaggio, blocco tampone e soluzione diluente di analisi (giorno 1)<ol>
<li>Aggiungere 500 l of Tween 20 a 1 L di PBS per preparare uno 0,05% Tween 20 in soluzione PBS, mescolare vigorosamente ed etichettare come "soluzione di lavaggio". NOTA: Assicurarsi che venga utilizzato solo il buffer di lavaggio appena preparato.</li>
		<li>Preparare una soluzione di blocco del blocco del 3% A (Tabella dei materiali) in salina con buffer fosfato (PBS). Mescolare mescolando delicatamente, filtrare sterilizzare e tenerli in frigo fino all'uso per un massimo di due settimane.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di soluzione di blocco a 10 mL di PBS per preparare la soluzione diluente di valutazione (1% blocco A in PBS).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rivestimento di piastre ad alto legame<ol>
<li>Estrarre una piastra ad alto legame a punto singolo a 16-pozzetto. NOTA: Le piastre ad alto legame hanno una maggiore capacità di rilegatura e quindi una gamma dinamica più ampia rispetto alle piastre standard con superfici idrofobiche.</li>
		<li>Scongelare l'anticorpo monoclonale anti-MeCP2 sul ghiaccio e mescolare 0,67 l dell'anticorpo con 4 mL di PBS (1:6,000 di luidione anticorpo in PBS). Vorticare la soluzione anticorpale per mescolare bene ed etichettare il tubo come "soluzione di rivestimento".</li>
		<li>erogare con cura 25 - di soluzione di rivestimento nell'angolo inferiore di ogni pozzo utilizzando un pipettor multicanale; questo è chiamato il metodo di rivestimento della soluzione. Toccare delicatamente la piastra del 96 po' su ciascun lato per assicurarsi che la soluzione di rivestimento copra il fondo di ogni pozzo.</li>
		<li>Sigillare la piastra con un foglio adesivo e incubare la piastra in frigorifero a 4 gradi centigradi durante la notte (12-16 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Blocco (giorno 2)<ol>
<li>Estrarre il piatto dal frigorifero e rimuovere la pellicola.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di rivestimento degli anticorpi sfogliandola nel cestino e toccare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere tutta la soluzione di rivestimento dai pozzetti.</li>
		<li>Aggiungere 125 l di soluzione di blocco per bene. Sigillare nuovamente la piastra e posizionarla su uno shaker di microplacca orbitale.</li>
		<li>Incubare la piastra per 90 min a temperatura ambiente con agitazione costante a 800 giri/m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di norme e campioni<ol>
<li>Durante il periodo di incubazione, preparare gli standard proteici MeCP2 e/o TAT-MeCP2 e vari campioni. NOTA: il buffer di lisi utilizzato per la diluizione standard deve essere lo stesso utilizzato nei campioni analizzati.</li>
		<li>Estrarre una fiala della soluzione di stock proteica MePC2 e/o TAT-MeCP2 (250 g/mL), le talità cerebrali di topo e listi HDF da -80 gradi centigradi. Scongelarli sul ghiaccio.</li>
		<li>Diluire la soluzione standard (MeCP2 e/o TAT-MeCP2) in tubi puliti secondo la tabella 2.</li>
		<li>Diluire i campioni nel buffer di lisi come segue: 1,20 g di lisata cerebrale del topo per 25 , l'una del buffer di lisi, e 0,25,1 g di lisate HDF per 25 , luna di buffer di lisi. Preparare un volume sufficiente di ogni campione per eseguire l'analisi in triplice copia.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Standard</td>
			<td>Concentrazione</td>
			<td>Diluizione</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 1</td>
			<td>1.800 ng/mL</td>
			<td>Soluzione di stock standard 148,92 - buffer di lis</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 2</td>
			<td>600 ng/mL</td>
			<td>50 - L Buffer di lisi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 3</td>
			<td>200 ng/mL</td>
			<td>50 - L Buffer di lisi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 4</td>
			<td>66,67 ng/mL</td>
			<td>50 - L Standard 3 - 100 buffer di lisi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 5</td>
			<td>22.22 ng/mL</td>
			<td>50 - L Standard 4 - 100 buffer di lisi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 6</td>
			<td>7.41 ng/mL</td>
			<td>50 - L Standard 5 - 100 buffer di lisi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 7</td>
			<td>2.47 ng/mL</td>
			<td>50 - L Standard 6 - 100 buffer di Lisi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 8</td>
			<td>0,82 ng/mL</td>
			<td>50 - L Standard 7 - 100 buffer di lisi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 9</td>
			<td>0,27 ng/mL</td>
			<td>50 - L Standard 8 - 100 buffer di lisi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 10</td>
			<td>0 ng/mL</td>
			<td>Buffer di lisi da 150 l'l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Serie standard da 0 a 1.800 ng/mL.
<ol start="5"><li>Aggiunta di esempi e soluzioni standard<ol>
<li>Rimuovere la soluzione di blocco facendola scorrere nel cestino e toccare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere tutta la soluzione di blocco dai pozzetti.</li>
		<li>Lavare la piastra 3 volte con 150 l di lavatrice aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendola immediatamente.</li>
		<li>Aggiungere 25 ul di standard e campioni nell'angolo inferiore del pozzo utilizzando una pipetta a canale singolo.</li>
		<li>Sigillare la piastra e incubare la piastra per 4 h a temperatura ambiente con agitazione costante a 800 giri/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anticorpi di rilevamento senza etichetta<ol>
<li>Scongelare l'anticorpo anti-MeCP2 del coniglio policlonale sul ghiaccio. Diluire l'anticorpo 1:6,000 in soluzione diluente saggio.</li>
		<li>Rimuovere gli standard e i campioni sfogliandolo nel cestino e toccare la piastra su un tovagliolo di carta.</li>
		<li>Lavare la piastra 3 volte con 150 l di lavatrice aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendola immediatamente.</li>
		<li>Aggiungete 25 l di anticorpi di rilevamento senza etichetta in ogni pozzo con il pipettor multicanale. Sigillare la piastra e incubarla per 1 h con agitazione costante a 800 giri/min a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anticorpo coniugato specifico<ol>
<li>Estrarre l'anticorpo secondario specifico (Tabella dei materiali) dal frigorifero e posizionarlo sul ghiaccio. Diluire l'anticorpo 1:666.67 nella soluzione diluente di analisi e mescolare delicatamente.</li>
		<li>Rimuovere l'anticorpo secondario gratuito senza etichetta facendolo scorrere nel cestino e toccare la piastra su un tovagliolo di carta.</li>
		<li>Lavare la piastra 3 volte con 150 l di lavatrice aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendola immediatamente.</li>
		<li>Aggiungere 25 l di anticorpo coniugato specifico (Tabella dei materiali) ad ogni pozzo con il pipettor multicanale. Sigillare la piastra e incubare per 1 h con agitazione costante a 800 giri/min a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lettura della piastra<ol>
<li>Rimuovere l'anticorpo coniugato gratuito (Tabella dei materiali) facendolo scorrere nel cestino e toccare la piastra su un tovagliolo di carta.</li>
		<li>Lavare la piastra 3volte con 150 l di soluzione di lavaggio.</li>
		<li>Aggiungete 150 l di 1x buffer di lettura oro a base di Tris (Tabella dei materiali) con un surfactant contenente tripropylamine come co-reattore per la generazione di luce alla piastra. Evitare eventuali bolle d'aria utilizzando tecniche di reverse pipetting.</li>
		<li>Posizionare la piastra sulla piattaforma di rilevamento della micropiastra (Table of Materials) e avviare immediatamente la misurazione. Utilizzare le impostazioni per l'acquisizione di piastre di 96 pozze.</li>
		<li>Catturare i segnali di elettrochemiluminescenza da una telecamera CCD integrata in un sistema di rilevamento dell'elettrochemiluminescenza (Tabella dei materiali) e registrare i conteggi dei segnali, che corrispondono alle unità di luce relativa (RLU) e sono direttamente proporzionali all'intensità della luce. NOTA: Dopo la stimolazione elettrochimica, l'etichetta del rutenio legata all'elettrodo di carbonio emette luce di luminescenza a 620 nm. Analizzare i dati con il software accompagnato dallo strumento (Tabella dei Materiali).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDebad%2C+JD+%22Electrogenerated+Chemiluminescence%22">Electrogenerated Chemiluminescence</a>. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).</li>
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<li>Trazzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDKL5+protein+substitution+therapy+rescues+neurological+phenotypes+of+a+mouse+model+of+CDKL5+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder.</a> Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).</li>
<li>Van Esch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MECP2+Duplication+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Syndromology%22%5BJournal%5D)">MECP2 Duplication Syndrome.</a> Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).</li>
<li>Collins, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+overexpression+of+MeCP2+causes+a+progressive+neurological+disorder+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice.</a> Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).</li>
<li>Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+MeCP2+in+postmitotic+neurons+rescues+Rett+syndrome+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per misurare i livelli endogeni MeCP2, ricombinanti MeCP2 e TAT-MeCP2, è stato sviluppato un ECLIA a 96 pozzetti. È stato dimostrato che la perdita della funzione della proteina MeCP2 porta alla sindrome RTT6, per la quale il trattamento è attualmente limitato alla gestione dei sintomi e alla terapia fisica. Un promettente viale di trattamento è la cosiddetta terapia sostitutiva delle proteine, dove i livelli di MeCP2 possono essere titolati fino alla loro concentrazione necessaria<sup class="xref...

L'elettrochemiluminescenza immunoassay (ECLIA) si basa su un processo che utilizza etichette progettate per emettere luminescenza quando stimolata elettrochimicamente. Si tratta di una tecnica ampiamente applicabile per il rilevamento quantitativo di analiti biologici nell'industria di base e nella ricerca accademica, nell'industria alimentare e nella diagnostica clinica1. Comunemente, viene utilizzata una piastra usa e getta 96 pozze con elettrodi di inchiostro di carbonio. Questi elettrodi agiscono come un vettore solido per l'immunoassay. Un anticorpo secondario viene coniugato a un'etichetta elettrochemiluminescente e quando l'elettricità viene applicata al sistema, viene attivata l'emissione di luce dell'etichetta chimica. Un dispositivo accoppiato a carica di rumore ultra-bassa (CCD) registra l'intensità della luce che è direttamente proporzionale all'antigene legato all'anticorpo di cattura con conseguente quantificazione dell'analita mirata del campione2. Rispetto all'analisi immunosorbente legata agli enzimi (ELISA), l'ECLIA è considerata vantaggiosa in quanto offre una maggiore sensibilità e riproducibilità, nonché una migliore automazione e coerenza3 .
Qui abbiamo analizzato i livelli di proteina legante metil-CpG 2 (MeCP2) in campioni di origine umana e murina, nonché diverse varianti della proteina ricombinante utilizzando il nuovo sistema ECLIA. MecP2 è una proteina legante all'acido nucleico legata all'X nota per interagire con sequenze di DNA metilato. Questa proteina è stata implicata nella regolazione dell'espressione genica4,5. Le mutazioni di perdita di funzione nel gene che codifica questa proteina sono i principali colpevoli della sindrome di Rett (RTT), un grave disturbo neurosviluppo6. Un altro disturbo correlato a MeCP2, la sindrome di duplicazione MECP2, porta anche a sintomi neurologici che possono sovrapporsi a quelli di RTT7. In particolare, le femmine sono per lo più colpite dalla RTT, mentre i maschi sono per lo più afflitti dalla sindrome di duplicazione MECP2 6,7.
Questi disturbi sono associati a livelli insufficiente o in eccesso di MeCP2 rispettivamente nel sistema nervoso centrale (SNC). Di conseguenza, le opzioni di trattamento per RTT che comportano l'aumento dei livelli di MeCP2 nel SNC dovrebbero evitare gli effetti dannosi associati all'eccesso di MeCP27. A causa di questo fatto, una quantificazione altamente sensibile e accurata dei livelli di proteina MeCP2, come previsto dal sistema ECLIA, è cruciale per il progresso della RTT e la ricerca sulla sindrome di duplicazione MECP2. Le misurazioni precise dei livelli endogeni ed esogeni di MeCP2 da linee cellulari umane e campioni di tessuto murino, nonché una proteina ricombinante costituita da isoformo B umano (noto anche come isoforme e1), e un dominio minimo di trasduzione HIV-TAT N-terminal (TAT-MeCP2) che ha il potenziale di attraversare il sangue-barriera cerebrale8,9 sono presentati in questo lavoro.

<table><tbody><tr><td>1,4-Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td>Reagente di lisi ipotonica, Tampone di estrazione</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Reagente colorante concentrato</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>500-0006</td><td>Rilevamento della preparazione del campione</td></tr><tr><td>Diagnostica su scala Meso</td><td>marcata AB SULFO-TAG</td><td>R32AB-1</td> Banco di <td></td></tr> lavoro per la scoperta di anticorpi Software <tr>di <td></td><td>scoperta</td><td></td> su scala Meso<td>4.0</td></tr><tr><td>DMEM (1X)</td><td>gibco di Life Technologies</td><td>41966-029</td><td>Preparazione del campione</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (sterile)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>Preparazione del campione, soluzione di lavaggio, soluzione di rivestimento</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>Tampone di estrazione</td></tr><tr><td>Fetale Siero bovino fetale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>Preparazione del campione</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td>Tampone</td></tr> di <tr><td>estrazione Gold Read Buffer T (1x) con tensioattivo</td><td>Meso Scale Diagnostica</td><td>R92TG</td><td>MeCP2 Protocollo ECLIA</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Reagente per lisi ipotonica, tampone di estrazione</td></tr><tr><td>KIMBLE Dounce set di macinatori di tessuti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8938</td><td>Preparazione del campione</td></tr><tr><td>Agitatore di laboratorio, movimento oscillante (bassa velocità)</td><td>GFL</td><td>3014</td><td>MeCP2 Protocollo ECLIA</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato (MgCl*6H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>Reagente per lisi ipotonica, tampone di estrazione</td></tr><tr><td>MeCP2 (umano) Proteina ricombinante (P01)</td><td>Abnova Corporation</td><td>H00004204-P01</td><td>Trattamento cellulare</td></tr><tr><td>Microseal B seal</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>MSB1001</td><td>per sigillatura su piastra</td></tr><tr><td>Monoclonale Anti-MeCP2, prodotto nel topo, clone Mec-168, immunoglobulina purificata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6818-100UL; RRID:</td><td>AB_262075 Anticorpo, soluzione di rivestimento</td></tr><tr><td>MSD Blocker A</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>R93BA-4</td><td>Blocker</td></tr><tr><td>MSD SECTOR Imager 2400</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>I30AA-0</td><td>MeCP2 ECLIA Protocollo</td></tr><tr><td>Multi-Array a 96 pozzetti Piastra</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>L15XB-3/L11BX-3</td><td>MeCP2 Protocollo ECLIA</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>gibco di Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Preparazione del campione</td></tr><tr><td>Policlonale Anti-MeCP2, prodotto nel coniglio</td><td>Eurogentec S.A.</td><td>anticorpo</td> <td>progettato su misura</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Merck KGaA</td><td>1049361000</td><td>Reagente di lisi ipotonica</td></tr><tr><td>Primario AB Topo, anti-MeCP2 (1B11)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1404063; RRID:AB_10737296</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>AB primario di topo, anti-MeCP2 (4B6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0004204M1; RRID:AB_1842411</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>primario AB Topo, anti-MeCP2 (Mec-168)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6818; RRID:AB_262075</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>primario AB Topo, anti-MeCP2 (Men-8)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7443; RRID:AB_477235</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>AB primario di coniglio, anti-MeCP2 (D4F3)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>3456S; RRID:AB_2143849</td><td>Cocktail</td></tr> di <tr><td>inibitori della proteasi anticorpale (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8340</td><td>Reagente per lisi ipotonica, Tampone di estrazione</td></tr><tr><td>secondario AB, Coniglio, anti-MeCP2</td><td>Eurogentec S.A.</td><td></td><td>personalizzato Anticorpo</td></tr> secondario <tr><td>AB, coniglio, anti-MeCP2</td><td>Merck</td><td>07-013</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>Tampone di estrazione</td></tr><tr><td>SULFO-TAG marcato Anticorpo anti-coniglio (capra)</td><td>Diagnostica su scala meso W0015528S</td><td></td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Produzione</td><td></td> interna della<td>proteina di fusione TAT-MeCP2</td><td>Trattamento cellulare</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 0,25% (1X)</td><td>gibco di Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>Trattamento cellulare</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>Soluzione di lavaggio</td></tr></tbody></table>

un saggio basato sull'elettrochemiluminescenza per le varianti proteiche mecp2

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

L'ECLIA è un metodo versatile che è in grado di quantificare le quantità di proteine endogene e ricombinanti in un formato di 96 pozze. Per dimostrare l'efficienza dell'ECLIA, questo test è stato utilizzato per analizzare i livelli intrinseci di MeCP2 nel tessuto cerebrale del topo e l'assorbimento del TAT-MeCP2 nei fibroblasti dermici umani. Il MeCP2-ECLIA produce misurazioni altamente accurate e riproducibili con basso errore intra-e inter-ssay. In sintesi, abbiamo sviluppato un metodo quantitativo per la valutazione delle varianti proteiche MeCP2 che possono essere utilizzate in schermi ad alta velocità.

Il principio del sistema ECLIA è descritto nella Figura 1. Le curve standard per due varianti MeCP2 sono mostrate nella Figura 2. La quantificazione accurata è stata possibile su un'ampia gamma di concentrazioni (1,800 ng/mL). Nella Figura 3,sono stati analizzati i livelli MeCP2 di lismi derivati dal cervello di topo e dall'HDF. Espressione MeCP2 in lisati nucleari cerebrali da topi eterozici, wildtype e knockout sono stati confront...

L'elettrochemiluminescenza immunoassay (ECLIA) è un nuovo approccio per il rilevamento quantitativo delle varianti della proteina MeCP2 endogene ed esogenamente applicate su un'ampia gamma di lavoro. Qui, viene descritto il protocollo per il MeCP2-ECLIA in un formato 96-well.

Un saggio basato sull'elettrochemiluminescenza per le varianti proteiche MeCP2

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

L'ECLIA è un metodo semplice ma efficiente per quantificare i livelli cellulari di MeCP2. L'ECLIA è veloce, più sensibile e più facile da maneggiare rispetto ad altri metodi di quantificazione come la macchia occidentale e l'ELISA. Per preparare la soluzione di lavaggio, che è dello 0,5% Tween 20 in PBS, aggiungere 500 microlitri di Tween 20 a un litro di PBS e mescolare vigorosamente.Preparare una soluzione di blocco del 3%Blocker A e PBS e mescolare delicatamente. Sterilizzare la soluzione di blocco mediante filtrazione. Per preparare la soluzione diluita del test, 1%Blocker A e PBS, aggiungere cinque millilitri di soluzione di blocco a 10 millilitri di PBS.Successivamente scongelare l'anticorpo monoclonale anti-MeCP2 sul ghiaccio. Mescolare 0,67 microlitri dell'anticorpo con quattro millilitri di PBS, quindi vortice la soluzione. Per rivestire la piastra di legante alta 96 po', erogare con cura 25 microlitri di soluzione di rivestimento nell'angolo inferiore di ogni pozzo, utilizzando un pipetter multicanale.Tamponare delicatamente la piastra da 96 punti su ciascun lato per assicurarsi che la soluzione di rivestimento copra il fondo di ogni pozzo. Sigillare la piastra con un foglio adesivo e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Recuperare la piastra da 96 pozzi dal frigorifero e rimuovere il foglio.Rimuovere la soluzione di rivestimento anticorpale nei pozzi facendola scorrere in un contenitore di rifiuti. Quindi toccare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere qualsiasi soluzione rimanente. Quindi, aggiungere 125 microlitri di soluzione di blocco a ciascun pozzo.Quindi sigillare nuovamente la piastra con un foglio adesivo. Posizionare la piastra su uno shaker orbitale a micropiastra, impostata a 800 giri/min, e incubarla per 90 minuti a temperatura ambiente. Scongelare sul ghiaccio una fiala della soluzione di stock proteico MeCP2 o Tat-MeCP2, i llysati cerebrali del topo e i llysati HDF.Diluire la soluzione di stock proteico in tubi puliti come descritto nella tabella due del manoscritto. Quindi diluire i campioni di lysate. Per i liscivie cerebrali del topo, utilizzare da uno a 20 microgrammi per 25 microlitri di tampone di lisi.Per il litolato HDF, aggiungere da 0,25 a un microgrammo per 25 microlitri di tampone dilisi. Dopo che la piastra da 96 pozzetti ha incubato per 90 minuti, rimuovere la soluzione di blocco dai pozzi facendola scorrere in un contenitore di rifiuti. Quindi toccare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere qualsiasi soluzione rimanente.Quindi lavare la piastra tre volte con 150 microlitri di soluzione di lavaggio, aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendolo immediatamente. Aggiungere 25 microlitri di standard e campioni ai pozzi della piastra da 96 pozza. Sigillare la piastra e incubarla per altre quattro ore a temperatura ambiente con costante scuotimento di 800 giri/min.Scongelare l'anticorpo di rilevamento non etichettato, il coniglio policlonale anti-MeCP2, sul ghiaccio. Utilizzando una soluzione diluita per test, diluire l'anticorpo con un rapporto tra uno e 6.000. Quando la piastra da 96 pozzetto ha finito di incubare sull'agitatore, rimuovere gli standard e i campioni facendo scorrere la piastra in un contenitore di rifiuti.Quindi toccare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere qualsiasi soluzione rimanente. Lavare la piastra tre volte con 150 microlitri di soluzione di lavaggio aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendolo immediatamente. Aggiungere 25 microlitri di soluzione anticorpale di rilevamento senza etichetta a ciascun pozzo con il pipetter multicanale.Sigillare la piastra e incubarla per un'ora a temperatura ambiente con scuotimento costante a 800 giri/min. Ottenere l'anticorpo secondario specifico dal frigorifero e posizionarlo un ghiaccio. Diluire il corpo secondario in soluzione diluita di saggio e mescolare delicatamente.Per rimuovere l'anticorpo di rilevamento libero senza etichetta dalla piastra da 96 pozzetti, scorrere nel contenitore dei rifiuti e quindi toccare la piastra su un tovagliolo di carta. Dopo aver lavato la piastra tre volte come descritto perviosamente, aggiungere 25 microlitri di anticorpo secondario ad ogni pozzo con il pipetter multicanale. Sigillare la piastra e incubarla per un'ora a temperatura ambiente con scuotimento costante a 800 giri/min.Rimuovere l'anticorpo secondario libero facendo scorrere nel contenitore dei rifiuti e toccando la piastra su un tovagliolo di carta e quindi lavare la piastra tre volte, come descritto in precedenza. Ad ogni pozzo della piastra, aggiungere 150 microlitri di 1X Tris base Gold Read Buffer con tensioattiva, contenente tripropilammina come coreactant per la generazione di luce. Per evitare di produrre bolle d'aria, utilizzare tecniche di pipettatura inversa.Posizionare la piastra da 96 punti sulla piattaforma della micropiastra con il sistema di rilevamento dell'elettrochimica. Utilizzando la fotocamera CCD integrata, inizia immediatamente a catturare i dati. Conteggio dei segnali record che corrispondono alle unità di luce relative e sono direttamente proporzionali all'intensità della luce.Le curve standard MeCP2 sono state generate dal MeCP2 umano in più misurazioni. L'ECLIA può quantificare accuratamente il MeCP2 umano ricombinante su un intervallo da un nanogrammo per millilitro a 1800 nanogrammi per millilitro. Utilizzando ECLIA, i livelli di proteine MeCP2 sono stati misurati in lisati nucleari cerebrali da topi eterozigoti e femmine di tipo selvatico e da un topo knockout MeCP2.ECLIA è stato condotto su llysati cellulari da un controllo sano e dalla linea cellulare c. 806delG utilizzata come modello per la sindrome di Rett. Nessuna proteina MeCP2 è stata rilevata nelle linee cellulari mutanti dall'ECLIA o dall'immunofluorescenza.Eclia è stato anche utilizzato per studiare l'assorbimento di Tat-MeCP2 da parte del MeCP2 carente di lavoro straordinario della linea cellulare. La precisione eclia inter e intra assay è stata determinata per tre giorni consecutivi. Per la futura terapia sostitutiva delle proteine, l'erogazione di MeCP2 può essere ripetutamente ottimizzata a seguito della valutazione del livello proteico da parte dell'ECLIA.

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Biochemistry

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Un poco costoso, metodo throughput elevato per il rilevamento simultaneo di fino a 43 bersagli molecolari è descritto. Applicazioni di MPCR / RLB comprendono digitando microbica e la rilevazione di agenti patogeni multipli da campioni clinici.

PCR multiplex e Reverse Blot Assay Linea Hybridization (MPCR / RLB)

In questo video, dimostriamo il test immunologico di elettrochemiluminescenza per la quantificazione dei livelli di proteine bersaglio in diversi campioni. Questo test si basa sulla luminescenza prodotta nella reazione elettrochimica. L'intensità della luce emessa è proporzionale alla quantità della proteina bersaglio nel campione.

Saggio di elettrochemiluminescenza per la quantificazione dei livelli di proteine bersaglio nel lisato cerebrale

Questo video descrive il western blotting basato sulla chemiluminescenza di lisati immunoprecipitati. La tecnica aiuta a determinare l'elaborazione e l'attivazione delle proteine. Il segnale chemiluminescente rilevato è proporzionale al livello di elaborazione delle proteine durante la sua attivazione.

Saggio di Western Blot chemiluminescente per la lavorazione delle proteine

Biomarcatori di misura in campioni biologici complessi è sempre più guidando il processo decisionale clinico. Descriviamo un metodo altamente sensibile per misurare simultaneamente miosina cardiaca legame proteina-C, creatina chinasi MB e troponina I cardiaca in campioni di siero di soggetti con infarto miocardico e di soggetti sani di controllo.

Un metodo di quantificazione sensibile e specifico per la determinazione del siero miosina cardiaca Binding Protein-C da elettrochemiluminescenza immunoenzimatico

Descriviamo un alto rendimento, multiplex, e il dosaggio mirato liquido cerebrospinale proteomica (CSF) sviluppata con un potenziale per la traduzione clinica. Il test può quantificare potenziali marcatori e fattori di rischio per la neurodegenerazione, come le varianti apolipoproteina E (E2, E3 e E4), e misurarne l'espressione allelica.

A High Throughput, Multiplexer e mirata Proteomica CSF test per quantificare neurodegenerative Biomarkers e apolipoproteina E Isoforme Stato

Segnaliamo un short hairpin RNA (shRNA) e sequenziamento basato su protocollo di ultima generazione per l'identificazione dei regolatori di inattivazione del cromosoma x in una linea cellulare murina con luciferasi firefly e geni di resistenza igromicina fuse con il metil CpG binding protein 2 ( MeCP2) gene sul cromosoma di X inattivo.

In pool shRNA schermo per riattivazione di MeCP2 sul cromosoma di X inattivo

Qui, presentiamo un protocollo per una purificazione efficiente unico passaggio dell'essere umano senza tag attivo dieci-undici traslocazione-2 (TET2) 5-metilcitosina diossigenasi usando la cromatografia a scambio ionico e sua analisi utilizzando una massa liquida di cromatografia-tandem spettrometria (LC-MS/MS)-approccio basato.

Purificazione efficiente e sviluppo di analisi LC-MS/MS-based per dieci-undici traslocazione-2 5-metilcitosina diossigenasi

Qui, descriviamo un protocollo per generare un modello murino femminile vitale con inattivazione cromosomico X non casuale, cioè il cromosoma X ereditato dalla materna è inattivo nel 100% delle cellule. Descriviamo anche un protocollo per testare la fattibilità, la tollerabilità e la sicurezza della riattivazione farmacologica del cromosoma X inattivo in vivo.

Un modello di mouse non casuale per la riattivazione farmacologica di MECP2 sul cromosoma X inattivo

L'ubiquilazione CENP-A è un requisito importante per la deposizione ceNP-A al centromero, ereditata attraverso la dimerizzazione tra la divisione cellulare e indispensabile per la vitalità cellulare. Qui descriviamo l'analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione della proteina CENP-A (EYFP-CENP-A) marcata con EYFP.

Analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del CENP-A con tag EYFP (EYFP-CENP-A)

Le DNA metiltransferasi sono potenziali bersagli di farmaci antitumorali. Qui, viene presentato un protocollo per valutare piccole molecole per l'inibizione della DNA metiltransferasi. Questo test utilizza un'endonucleasi per accoppiare la metilazione del DNA alla generazione di fluorescenza e consente di monitorare l'attività enzimatica in tempo reale.

Saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi a fluorescenza continua per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi

Impara a quantificare le varianti proteiche MeCP2 con l'immunoassay a elettrochemiluminescenza ECLIA. Questo metodo offre maggiore sensibilità e riproducibilità rispetto al Western blot per studi di neuroscienza.

Un saggio basato sull'elettrochemiluminescenza per le varianti proteiche MeCP2

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