In Situ Chemotaxis Assay per esaminare il comportamento microbico negli ecosistemi acquatici

Il nostro protocollo ci consente di quantificare in modo robusto le chemiotassi microbiche direttamente nel loro habitat di origine. E così possiamo isolare i microrganismi e possiamo quantificare e comprendere meglio il potenziale metabolico. Il saggio di chemiotassi in situ, o ISCA in breve, è un dispositivo flessibile, intuitivo e semplice che consente nuove informazioni sui comportamenti microbici e quindi sul ruolo e la funzione dei microrganismi in qualsiasi ambiente che abbia una fase liquida.

A dimostrare la procedura di implementazione sia in laboratorio che sul campo è Estelle Clerc, attualmente dottoranda nel mio gruppo di ricerca. Prima di preparare il chemioattratrante, filtrare il mezzo con un filtro da 0,2 micrometri e autoclavare la soluzione filtrata. Successivamente, preparare una soluzione da 10 millimolare di chemioattratrante in 1 millilitro del mezzo sterile e filtrare la soluzione chemioattrattrice con un filtro siringa da 0,2 micrometri per rimuovere eventuali particelle e potenziali contaminanti.

Quindi, diluire la soluzione di stock chemioattrattante filtrata in serie, secondo il protocollo sperimentale. Per riempire un ISCA, attaccare un ago calibro 27 a una siringa da 1 millilitro e caricare una siringa per ogni concentrazione del chemioattrattore filtrato. Tenendo il dispositivo con la porta rivolta verso l'alto, iniettare lentamente ogni concentrazione della sostanza in ciascuno dei cinque pozzali di una riga del dispositivo fino a quando non appare una piccola goccia sopra ogni porta.

Quando tutti i pozzi sono stati riempiti, trasferire 1,5 millilitri della coltura batterica marina o d'acqua dolce di interesse in 150 millilitri del mezzo di coltura batterico appropriato. Quindi, posizionare due piccoli pezzi di nastro adesivo a doppia aspetto sulla superficie piana di un vassoio di capacità di 200 millilitri. E fissare un ISCA su ogni pezzo di nastro.

Utilizzando una pipetta sierologica da 50 millilitri, riempire lentamente il vassoio di distribuzione con la soluzione batterica. E permettere ai batteri di rispondere al chemioattrattore di interesse per un'ora. Per terminare l'analisi, utilizzare una nuova pipetta da 50 millilitri per rimuovere delicatamente il mezzo dal vassoio ISCA.

Per recuperare i campioni, posizionare prima l'ISCA in modo che la porta sia rivolta verso il basso. Successivamente, utilizzare una siringa sterile da 1 millilitro dotata di un ago calibro 27 per disegnare la soluzione da ogni pozzo. Estrarre i campioni da ogni fila della stessa concentrazione in un singolo tubo.

Quindi, analizzare i campioni per citometria a flusso per determinare il numero di batteri attratti da ogni concentrazione chemioattrattante. Per preparare un ISCA per l'implementazione sul campo, in primo luogo, raccogliere 5 millilitri di acqua per ISCA dal lato campo e filtrare l'acqua attraverso un filtro siringa da 0,2 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Passare la siringa acqua filtrata attraverso una cartuccia filtrante GP idrofila due volte, raccogliendo il filtrato in un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 millilitri, dopo ogni risciacquo.

Quindi, filtrare l'acqua attraverso un filtro siringa da 0,02 micrometri in un nuovo tubo da 50 millilitri. Utilizzare aliquote del filtrato per rimescolare tutti i chemioattrattivi di interesse alle concentrazioni desiderate in singoli tubi conici da 15 millilitri. Quindi utilizzare siringhe da 10 millilitri per filtrare i chemioattrattivi rimescolati attraverso singoli filtri siringhe da 0,2 micrometri in tubi sterili di centrifuga conica da 15 millilitri per rimuovere eventuali particelle indesiderate o composti insolubili in acqua.

Per la distribuzione sul campo ISCA, avvitare ogni ISCA sul pezzo 9 dell'enclosure del dispositivo e chiudere l'enclosure. Sigillare l'involucro con nastro adesivo e utilizzare corde bungee per fissare l'involucro a un braccio di distribuzione e una struttura fatta dall'uomo. In alternativa, l'involucro può essere fissato con un piccolo peso su un substrato poco profondo o attaccato a una rete nell'oceano pelagico.

Immergere completamente l'involucro per avviare il riempimento, tenendo saldamente l'involucro per evitare un eccessivo movimento dell'acqua all'interno. Una volta che il livello dell'acqua ha raggiunto la parte superiore dell'involucro, assicurarsi che all'interno non sia intrappolata aria. Quando l'involucro è completamente pieno, sigillare i fori inferiore e superiore con due spine.

Quindi, lasciare l'ISCA in posizione per 1 o 3 ore. Al termine del periodo di campionamento, rimuovere l'involucro dall'acqua. Posizionare l'involucro su un contenitore per drenare l'acqua e rimuovere con cura la parte superiore del nastro adesivo dai fori anteriori.

Una volta che la linea dell'acqua è passata sotto la parte superiore dell'ISCA, rimuovere il tappo inferiore e drenare il resto dell'acqua. Mentre gli ISCA sono ancora attaccati all'involucro, utilizzare una pipetta da 1 millilitro, o una siringa da 1 millilitro, per rimuovere con cura l'acqua intrappolata sopra ogni ISCA e rimuovere gli ISCA senza toccare la superficie superiore. Quindi utilizzare una salvietta monouso per rimuovere il liquido rimanente sulla superficie e recuperare i campioni come dimostrato per il recupero del campione di laboratorio.

In questa analisi rappresentativa in vitro, 1 millimolare è stato determinato come la concentrazione ottimale di impiego della glutammina in quanto ha indotto una risposta chemiotattica significativa che era 18 volte superiore al controllo filtrato dell'acqua di mare. Concentrazioni sempre più elevate di glutammina hanno anche indotto una risposta chemiotattica significativa, ma più debole. In questa analisi di distribuzione sul campo, cinque repliche ISCA riempite con 1 glutammina millimolare sono state dispiegate per 1 ora in un sito costiero vicino a Sydney, in Australia.

E l'ISCA riempito di glutammina ha attirato quasi tre volte più batteri dei pozzi di controllo pieni di acqua di mare filtrata. La cosa più importante da ricordare quando si distribuisce l'ISCA, sia in laboratorio che sul campo, è evitare di creare forti flussi di fluido che impediranno la chemiotassi. I campioni derivati dall'ISCA possono essere utilizzati per identificare organismi o geni specifici, per caratterizzare il potenziale genomico degli organismi chemiotattici e per l'isolamento mirato di ceppi specifici su mezzi selettivi.