Name: In Situ Chemotaxis Assay per esaminare il comportamento microbico negli ecosistemi acquatici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Scopri l'assaggio di chemotassi in situ per studiare il comportamento microbico negli ecosistemi acquatici. Questo metodo microfluidico consente di quantificare la chemotassi e isolare microrganismi per analisi metaboliche.

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Questa ricerca è stata finanziata in parte dalla Gordon and Betty Moore Foundation Marine Microbiology Initiative, attraverso la sovvenzione GBMF3801 a J.R.S. e R.S., e un Investigator Award (GBMF3783) a R.S., così come una borsa di studio dell'Australian Research Council (DE160100636) a J.B.R., un premio della Simons Foundation a B.S.L. (5941111), e una sovvenzione dalla Simons Foundation (542395) a R.S. come parte dei Principi di Ecosistema Microbiale (PriME) PriME.

Si consiglia di eseguire la sezione 1 prima degli esperimenti sul campo per ottimizzare i risultati.
1. Ottimizzazione di laboratorio
NOTA: i volumi descritti nella procedura di ottimizzazione sono sufficienti per un singolo ISCA (composto da 20 pozzetti).
<ol><li>Preparazione della sostanza chimica di interesse NOTA: La concentrazione ottimale per ogni chemioattractant spesso deve essere determinata in condizioni di laboratorio prima delle distribuzioni sul campo. Il campo di concentrazione chimica diminuirà di grandezza con la distanza dalla fonte (pozzo ISCA), il che significa che la concentrazione sperimentata dai microrganismi nell'ambiente sarà inferiore a quella presente all'interno del dispositivo. La concentrazione ottimale da utilizzare nel pozzo ISCA dipende dal tasso di diffusione del chemoattractant. Se la concentrazione nel pozzo è troppo bassa (vicino al limite di rilevamento dei microbi), non si osserverà alcuna chemiotassi positiva. Al contrario, se la concentrazione nel pozzo è troppo alta, la concentrazione sarà alta anche nell'ambiente immediato e l'accumulo microbico si verificherà sopra i pozzi ISCA piuttosto che all'interno. Pertanto, la serie di diluizione deve essere effettuata in condizioni di laboratorio per ogni composto al fine di determinare la concentrazione ottimale per le distribuzioni sul campo. Idealmente, un intervallo di concentrazione dovrebbe anche essere testato sul campo per confermare i risultati di laboratorio.<ol>
<li>Preparare 2,5 L di un mezzo adeguato contenente l'adeguata concentrazione di sale (ad esempio, salina tamponata di fosfati [PBS] o acqua di mare artificiale). Filtrare il supporto con un filtro da 0,2 m utilizzando una pompa peristaltica o a vuoto e un'autoclave.</li>
		<li>Preparare una soluzione da 10 mM di chemoattractant in 1 mL del mezzo sterile. Filtrare la soluzione chemoattractant con un filtro siringa da 0,2 m per rimuovere particelle e potenziali contaminanti. NOTA: Idealmente, nessun composto organico diverso dal chemoattractant deve essere presente nella soluzione finale.</li>
	</ol></li>
	<li>Gamma di concentrazione per serie di diluizione<ol>
<li>Diluire la soluzione di stock chemoattractant filtrata in serie, che va (ad esempio) da 10 mM a 100 M. NOTA: è necessario almeno un volume finale di 0,7 mL per concentrazione testata.</li>
	</ol></li>
	<li>Caricamento dell'ISCA<ol>
<li>Riempire una siringa da 1 mL con il chemoattractant filtrato e collegarla a una siringa da 27 G. Tenendo l'ISCA con il porto rivolto verso l'alto, iniettare lentamente la sostanza fino a quando non appare una piccola goccia sulla parte superiore del porto. NOTA: 1) Ogni diluizione o sostanza deve essere iniettata con una siringa e un ago separati per evitare la contaminazione incrociata. 2) Questa piccola goccia è importante perché assicura che nessuna bolla d'aria sia intrappolata all'interno del porto, il che potrebbe compromettere la capacità dei microbi di migrare attraverso il porto. 3) Si raccomanda di riempire un'intera riga per sostanza o concentrazione (cinque pozzi) per fornire un volume minimo adeguato per ulteriori analisi. 4) Una riga per ISCA deve fungere da controllo negativo e deve essere riempita con il mezzo filtrato in cui i microbi saranno sospesi. Questo trattamento rappresenta l'effetto della motilità casuale da parte dei microbi nei pozzi ISCA e deve essere utilizzato per normalizzare i trattamenti contenenti un chemoattractant.</li>
	</ol></li>
	<li>Distribuzione in laboratorio<ol>
<li>Durante la notte, incubare una coltura di 5 mL arricchita con 1% brodo marino (per i batteri marini) o 1% brodo di glisogenio (LB, per i batteri dell'acqua dolce). NOTA: Gli isolati batterici motile o le comunità batteriche naturali possono essere utilizzati per le distribuzioni di laboratorio.</li>
		<li>Incubare la coltura per 12 h a temperatura ambiente (RT) e 180 rpm. Dopo 12 h, assicurarsi che le comunità microbiche siano motile mediante osservazione diretta al microscopio.</li>
		<li>Abbattere la coltura a 1.500 x g per 10 min e rispendere 1/100 in 150 mL di mezzo appropriato (ad esempio, acqua di mare filtrata, acqua dolce filtrata).</li>
		<li>Posizionare due piccoli pezzi di nastro adesivo a due lati sulla superficie piana di un vassoio di capacità di 200 mL (i coperchi delle scatole di punta da 1 mL hanno le dimensioni ideali per questo scopo e possono essere facilmente autoclaved). Posizionare un ISCA in cima, assicurandosi che si collega in modo sicuro al nastro. Riempire lentamente il vassoio di distribuzione con la soluzione batterica utilizzando una pipetta sierologica da 50 mL. NOTA: Riempire il vassoio fino a quando l'ISCA non è immerso sotto circa 1-2 cm di liquido. Se si utilizzano più vassoi, utilizzare lo stesso volume su tutti.</li>
		<li>Lasciare incubare l'ISCA per 1 h per consentire la chemiotassi batterica. Dopo 1 h, rimuovere il mezzo molto delicatamente con una pipetta sierologica da 50 mL per ridurre al minimo il flusso turbolento.</li>
		<li>Recuperare l'ISCA dal vassoio di distribuzione senza toccare la superficie superiore. Utilizzare una pipetta e tergicristalli usa e getta per rimuovere il liquido rimanente sulla superficie ISCA. NOTA: È importante evitare di toccare le porte durante questo processo, poiché i cambiamenti di pressione risultanti possono rimuovere o aggiungere batteri dall'ambiente esterno nel pozzo e quindi sbilalare la densità batterica e la composizione all'interno del pozzo.</li>
	</ol></li>
	<li>Recupero dei campioni<ol>
<li>Tenendo l'ISCA con la porta rivolta verso il basso, recuperare il volume dei pozzetti utilizzando un ago sterile di siringa da 27 G attaccato a una siringa da 1 mL. NOTA: ogni riga (se contenente la stessa sostanza) può essere in pool per fornire un campione funzionante di circa 550 L. Questo esempio può essere successivamente trasmesso in tubi diversi a seconda delle applicazioni a valle richieste.</li>
		<li>Determinare il numero di batteri attratti da ogni concentrazione chemoattractant analizzando i campioni con citometria di flusso12. Scegliere la concentrazione di chemoattractant che massimizza la chemotaxis per le successive distribuzioni sul campo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparazione per la distribuzione sul campo
NOTA: la preparazione del materiale e la costruzione dell'involucro di smorzamento del flusso (sezione 2) devono essere effettuate prima della distribuzione.
<ol><li>Preparazione dei materiali<ol>
<li>Preparare tutti i materiali elencati nella tabella 1. NOTA: le quantità di materiale vengono fornite per un'ISCA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Costruzione e preparazione del recinto di smorzamento del flusso NOTA: L'involucro di smorzamento del flusso riduce al minimo le turbolenze indesiderate che altrimenti impediscono la creazione di gradienti chimici provenienti dall'ISCA.<ol>
<li>Tagliare i pezzi per l'involucro di distribuzione con una fresa laser da un foglio acrilico da 3 mm. NOTA: il file per i pezzi può essere trovato utilizzando il seguente collegamento: <https://figshare.com/articles/Flow_damping_enclosure_for_ISCA_deployments/10630220>.</li>
		<li>Assemblare i pezzi tagliati al laser come dimostrato nella Figura 2 utilizzando la colla acrilica. NOTA: Assemblare i pezzi con cura. I fori o il disallineamento possono creare perdite durante la distribuzione, con un impatto diretto sulla qualità dei dati.</li>
		<li>Lasciare asciugare il recinto assemblato durante la notte.</li>
		<li>Lavare il recinto con acqua deionizzata.</li>
		<li>Identificare potenziali perdite versando acqua deionizzata nel recinto. Correggere eventuali giunti che perdono aggiungendo altra colla acrilica, quindi ripetere i passaggi 2.2.3–2.2.5.</li>
		<li>Tagliare i fili a vite nel pezzo acrilico che verrà utilizzato per fissare l'ISCA. Questo può essere ottenuto utilizzando un rubinetto con un diametro e passo corrispondente alle viti di montaggio.<ol>
<li>In primo luogo, apposti il rubinetto in una chiave di fissazione, quindi fissa il pezzo acrilico da toccare in un vizio in panchina. Per ottenere i migliori risultati, assicurarsi che il pezzo acrilico sia il più livellato possibile. Assicurarsi che il rubinetto sia perpendicolare al pezzo acrilico e iniziare a girare la chiave del rubinetto (in senso orario), applicando la pressione della luce al rubinetto.</li>
			<li>Dopo diverse rivoluzioni complete nel pezzo acrilico, invertire la rotazione del rubinetto (in senso antiorario) per un quarto di una rotazione per cancellare l'acrilico dal rubinetto. Ripetere il processo fino a quando non viene toccata l'intera profondità del pezzo acrilico.</li>
			<li>Infine, rimuovere il rubinetto (girando in senso antiorario) e testare i fili utilizzando una vite.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Procedura sul campo
<ol><li>Filtrazione dell'acqua<ol>
<li>Raccogliere l'acqua dal sito sul campo quando è pronto per iniziare l'esperimento. Filtrare 5 mL di acqua per ISCA attraverso un filtro di siringa da 0,2 m (con una siringa da 50 mL) in un tubo di centrifuga conica da 50 mL. NOTA: Sono necessari circa 3 mL di acqua filtrata per riempire tutti i pozzi di un ISCA; tuttavia, si raccomanda di filtrare 1) 5 mL per dispositivo per tenere conto delle perdite durante il processo di filtrazione quadrupla, e 2) conservare gli aliquots dei filtrati come controlli negativi sia per la citometria di flusso che per le procedure molecolari.</li>
		<li>Filtrare il filtratore due volte attraverso una cartuccia di filtro GP idrofilo da 0,2 m (utilizzando la stessa, entrambe le volte) con una nuova siringa da 50 mL in un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 mL. Filtrare il filtrato attraverso un filtro siringa da 0,02 m (con una nuova siringa da 50 mL) in un nuovo tubo conico da 50 mL. NOTA: Questa filtrazione quadrupla dovrebbe rimuovere quasi tutti i microrganismi e le particelle dall'acqua. Tenere il filtrante finale lontano da qualsiasi fonte di calore fino all'uso. Quest'acqua sarà utilizzata per riespettere tutte le sostanze chimiche utilizzate nell'ISCA e dovrebbe essere mantenuta alla stessa temperatura dell'acqua nel sito di distribuzione. I flussi convettivi innescati da differenze di temperatura tra i pozzi ISCA e l'ambiente esterno potrebbero altrimenti verificarsi.</li>
		<li>Utilizzare aliquots del filtrato per risundere tutti i chemoattractants di interesse (tipicamente asciutti) alle concentrazioni desiderate in tubi centrifuga conica da 15 mL.</li>
		<li>Filtrare i chemoattractants resuspended attraverso un filtro di siringa da 0,2 m con una siringa da 10 mL in tubi sterili di centrifugazione conica da 15 mL per rimuovere le particelle indesiderate o i composti insolubili in acqua (se si utilizzano estratti). NOTA: Filtrare delicatamente per evitare che le particelle passano attraverso il filtro. È importante risundere i chemoattractants nell'acqua ultrafiltrata dal sito di campo e non solubilizzarli in altre soluzioni. L'utilizzo dell'acqua dal sito di campo è necessario (1) ottenere la stessa concentrazione di sale all'interno dei pozzi come quella nell'acqua ambientale alla rinfusa per evitare il flusso a densità, e (2) garantire che i livelli di nutrienti di fondo siano uguali all'interno e all'esterno del pozzo.</li>
	</ol></li>
	<li>Riempimento ISCA<ol>
<li>Eseguire la sezione 1.3 per riempire l'ISCA. NOTA: Si raccomanda di riempire una riga (cinque pozzi) per sostanza (cioè, tre diverse sostanze per ISCA e un controllo dell'acqua di mare ultrafiltrato).</li>
	</ol></li>
	<li>Distribuzione sul campo<ol>
<li>Screw l'ISCA (Figura 3A) al pezzo 9 dello chassis (Figura 2K e Figura 3B). NOTA: l'involucro di smorzamento del flusso sopra descritto può contenere due ISCA affiancate o una ISCA posizionata al centro.</li>
		<li>Chiudere l'alloggiamento( Figura 3C) e sigillarlo con nastro adesivo (Figura 3D). NOTA: Le rughe devono essere evitate per garantire una guarnizione perfetta. Sigillare prima tutti i lati, quindi (in una seconda fase) sigillare i fori laterali, che verranno utilizzati per drenare l'acqua dal recinto alla fine del campionamento. Non sigillare i fori superiore e inferiore. Non posizionare l'ISCA a testa in giù, poiché il flusso a densità può verificarsi in pozzi contenenti chemoattractants, che distorceranno il numero di cellule nei pozzi.</li>
		<li>Poiché l'involucro deve rimanere stabile durante il dispiegamento, si consiglia di collegarlo a strutture artificiali (ad esempio, pontone, scala) utilizzando cavi bungee. NOTA: L'involucro può essere collegato a un braccio di distribuzione (qui, un morsetto modificato con una piattaforma perpendicolare) utilizzando cavi elastici prima dell'immersione in acqua. In alternativa, il recinto può essere riempito e fissato con un piccolo peso su substrati poco profondi. Se le distribuzioni sono destinate nell'oceano pelagico, il recinto può essere collegato a una rete con una boa da un lato e il peso dell'immersione dall'altro.</li>
		<li>Immergere completamente il recinto per iniziare a riempirsi. Durante il riempimento, tenere saldamente il recinto per evitare un eccessivo movimento dell'acqua all'interno. Una volta che il livello dell'acqua raggiunge la parte superiore del recinto, assicurarsi che nessuna aria è intrappolata all'interno. NOTA: Nel caso in cui alcune bolle d'aria siano intrappolate, inclinare delicatamente il recinto con il foro di sfiato rivolto verso l'alto, che consentirà alle bolle di fuori onda.</li>
		<li>Una volta completamente pieni, sigillare i fori inferiore e superiore con due spine, che possono essere fatte in silicio o gomma o sigillando le estremità di 20 punte di pipetta 20 L (Figura 4). NOTA: questo passaggio impedisce il flusso all'interno dell'alloggiamento durante il campionamento.</li>
		<li>Lasciare l'ISCA in posizione per il campionamento per 1-3 h. NOTA: Il tempo di distribuzione ideale è dettato principalmente dalla temperatura dell'acqua e dal raddoppio del tempo della comunità batterica. Quando la temperatura dell'acqua è superiore a 20 gradi centigradi, non è consigliabile dispiegare l'ISCA per più di 1 h, perché la divisione cellulare può verificarsi nei pozzi contenenti chemoattractants dopo 1,5–2,0 h. Tuttavia, il tempo di distribuzione ottimale può essere testato prima dell'esperimento ISCA modificando le comunità naturali con le sostanze chimiche caricate e quantificando il numero di cellule nel tempo.</li>
		<li>Rimuovere l'involucro dall'acqua. Posizionarlo su un contenitore che consente di drenare l'acqua dal recinto.</li>
		<li>Rimuovere la parte superiore del nastro adesivo dai fori anteriori molto delicatamente. NOTA: Il flusso dell'acqua che lascia il recinto deve essere ad una velocità gocciolante. Procedere un foro alla volta, dalla parte superiore del recinto verso il basso. Dovrebbe richiedere circa 10-15 minuti per drenare completamente l'involucro.</li>
		<li>Una volta che la linea di galleggiamento passa sotto la parte superiore dell'ISCA, rimuovere la spina inferiore e drenare il resto dell'acqua.</li>
		<li>Mentre le ISCA sono ancora attaccate al recinto, rimuovere con attenzione l'acqua intrappolata sulla parte superiore dell'ISCA con una pipetta da 1 mL.</li>
		<li>Rimuovere l'ISCA senza toccare la superficie superiore e utilizzare una salvietta usa e getta per rimuovere il liquido rimanente sulla superficie. NOTA: È importante non toccare le porte durante questo processo, poiché i cambiamenti di pressione risultanti possono rimuovere o aggiungere batteri sfuoca nel pozzo e distorsionare i conteggi batterici.</li>
		<li>Recuperare i campioni dall'ISCA ripetendo il passaggio 1.5.1.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Applicazioni a valle
NOTA: I volumi sono forniti sulla base di un campione di 550 L (una riga di un ISCA).
<ol><li>Fissare 100 L di contenuto di pozzo con glutaraldeide (2% concentrazione finale) per la citometria di flusso per quantificare la chemitassi a ciascun attrattore. NOTA: Conservare sul ghiaccio (o a 4 gradi centigradi) e analizzare i campioni nello stesso giorno. In alternativa, i campioni possono essere congelati in modo flash in azoto liquido dopo la fissazione se l'analisi non è fattibile nello stesso giorno. La citometria di flusso è il metodo consigliato per quantificare il numero di cellule nei pozzi ISCA, in quanto è semplice, veloce epreciso 12.</li>
	<li>Snap congelare 300 L di contenuto di pozzo in azoto liquido per la successiva estrazione del DNA el'analisi 11. NOTA: Conservare i campioni a -80 gradi centigradi fino all'analisi.</li>
	<li>Aggiungere 90 L di contenuto di pozzo a 10 L di buffer TE-glicerolo e bloccare i campioni per la genomica a cella singola13.</li>
	<li>Stendere 10-20 L su piastre di agar contenenti il mezzo desiderato per l'isolamento batterico.</li>
</ol>

<ol><li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+microbes+see+a+sea+of+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Marine microbes see a sea of gradients.</a> Science. 338, 628-633 (2012).</li>
<li>Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microbial+motility+and+chemotaxis+in+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).</li>
<li>Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsion+of+bacteria+from+marine+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Repulsion of bacteria from marine surfaces.</a> Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).</li>
<li>Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+toward+phytoplankton+drives+organic+matter+partitioning+among+marine+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria.</a> PNAS. 113, 1576-1581 (2016).</li>
<li>Matilla, M., Krell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+bacterial+chemotaxis+on+host+infection+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).</li>
<li>Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis in bacteria.</a> Science. 153, 708-716 (1966).</li>
<li>Adler, J., Dahl, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+measuring+the+motility+of+bacteria+and+for+comparing+random+and+non-random+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility.</a> Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).</li>
<li>Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for bacterial chemotaxis.</a> Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).</li>
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<li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+expanding+the+frontiers+of+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).</li>
<li>Lambert, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+in+situ+chemotaxis+assay+to+study+the+behaviour+of+aquatic+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities.</a> Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).</li>
<li>Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+cell+cycle+analysis+of+natural+populations+of+marine+picoplankton+by+flow+cytometry+using+the+nucleic+acid+stain+SYBR+Green+I%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I.</a> Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+genomes+from+uncultivated+environmental+microorganisms+using+FACS-based+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics.</a> Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).</li>
<li>Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGaworzewska%2C+ET+%22Microbiology%22">Microbiology</a>. , (1982).</li>
<li>Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+exudation+and+rhizosphere+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Root exudation and rhizosphere biology.</a> Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Alla scala dei microrganismi acquatici, l'ambiente è tutt'altro che omogeneo ed è spesso caratterizzato da gradienti fisici/chimici che strutturano le comunità microbiche1,15. La capacità dei microrganismi motile di utilizzare il comportamento (cioè la chemiotaxis) facilita il foraggiamento all'interno di questi microambimi eterogenei1. Lo studio della chemitaxis direttamente nell'ambiente ha il potenziale per identificare importanti inter...

Diversi microrganismi utilizzano motilità e chemiotaxis per sfruttare ambienti nutritivi patchy, trovare ospiti, o evitare condizioni deleteri1,2,3. Questi comportamenti microbici possono a loro volta influenzare i tassi di trasformazione chimica4 e promuovere partenariati simbiotici tra gli ecosistemi terrestri, d'acqua dolce e marini2,5.
La chemitaxis è stata ampiamente studiata in condizioni di laboratorio negli ultimi 60 anni6. Il primo metodo quantitativo per studiare la chemitaxis, il saggio capillare, prevede un tubo capillare riempito con un chemoattractant putativo immerso in una sospensione del batterio6. La diffusione della sostanza chimica fuori dal tubo crea un gradiente chimico, e i batteri chemiotatici rispondono a questo gradiente migrando nel tubo7. Dallo sviluppo del saggio capillare, ancora oggi ampiamente utilizzato, molte altre tecniche sono state sviluppate per studiare la chemiotassi in condizioni fisiche/chimiche sempre più controllate, con la più recente che prevede l'uso di microfluidics8,9,10.
La microfluidica, insieme alla microscopia video ad alta velocità, consente di monitorare il comportamento delle singole cellule in risposta a gradienti attentamente controllati. Anche se queste tecniche hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione della chemiotaxis, sono state limitate all'uso di laboratorio e non si traducono facilmente nella distribuzione sul campo nei sistemi ambientali. Di conseguenza, la capacità delle comunità naturali di batteri di utilizzare la chemitaxis all'interno degli ecosistemi naturali non è stata esaminata; pertanto, l'attuale comprensione della potenziale importanza ecologica della chemiotassi è prevenita verso le condizioni di laboratorio artificiali e un numero limitato di isolati batterici in laboratorio. L'ISCA recentemente sviluppato supera queste limitazioni11.
L'ISCA si basa sul principio generale del saggio capillare; tuttavia, si fa uso di moderne tecniche di microfabbricazione per fornire una piattaforma sperimentale altamente replicata e facilmente distribuibile per la quantificazione della chemiotassi verso composti di interesse nell'ambiente naturale. Permette anche l'identificazione e la caratterizzazione dei microrganismi chemiotattici mediante isolamento diretto o tecniche molecolari. Mentre il primo dispositivo di lavoro è stato auto-fabbricato e costruito in vetro e PDMS11, l'ultima versione a iniezione è composta da policarbonato, utilizzando una procedura di fabbricazione altamente standardizzata (per interesse per l'ultima versione del dispositivo, gli autori corrispondenti possono essere contattati).
L'ISCA è di dimensioni di carta di credito ed è costituito da 20 pozzi distribuiti in un array di pozzi 5 x 4, ciascuno collegato all'ambiente acquatico esterno da una piccola porta (800 m di diametro; figura 1). Chemoattractants putativi caricati nei pozzi si diffondono nell'ambiente attraverso il porto, e i microbi chemiotattici rispondono nuotando attraverso il porto nel pozzo. Poiché molti fattori possono influenzare il risultato di un esperimento ISCA nell'ambiente naturale, questo protocollo passo-passo aiuterà i nuovi utenti a superare potenziali ostacoli e a facilitare distribuzioni efficaci.

<table><tbody><tr><td>Colla acrilica</td><td>Evonik</td><td>1133</td><td>Acrifix 1S 0116</td></tr><tr><td>Lastra acrilica</td><td>McMaster-Carr</td><td>8505K725</td><td>O altra azienda</td></tr><tr><td>Nastro adesivo</td><td>Scotch</td><td>3M 810</td><td>Scotch Magic tape</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Systec</td><td>D-200</td><td>O altra azienda</td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>Fisher Scientific</td><td>75002451</td><td>O altra azienda</td></tr><tr><td>Corda elastica</td><td>Paracord Planet</td><td>667569184000</td><td>Or different company</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga - 2 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BR780546-500EA</td><td>Provetta Eppendorf Provetta</td></tr><tr><td>da centrifuga conica - 15 mL</td> Fisher <td>Scientific</td><td>11507411</td><td>Provetta Falcon Provetta</td></tr><tr><td>da centrifuga conica - 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>10788561 Provetta Falcon</td></tr><tr><td>Braccio di distribuzione</td><td>Irwin</td><td>1964719</td><td>O un'altra azienda</td></tr><tr><td>Spina dell'involucro di distribuzione</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-4</td><td>Vedi le alternative nel manoscritto</td></tr><tr><td>Tergicristalli usa e getta</td><td>Kimtech - Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>Citometro</td><td>a flusso Beckman</td><td>C09756</td><td>CYTOFlex</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 25%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td>O altra azienda</td></tr><tr><td>Colorante fluorescente verde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9430</td><td>SYBR Green I - diluizione finale 1:10.000</td></tr><tr><td>Cartuccia filtrante GP idrofila - 0,2 &; m</td><td>Merck</td><td>C3235</td><td>Filtro Sterivex</td></tr><tr><td>Saggio di chemiotassi in situ (ISCA)</td><td>-</td><td>-</td><td>Contatta gli autori corrispondenti</td></tr><tr><td>Taglierina laser</td><td>Epilog Laser</td><td>Fusion pro 32</td><td>O un'altra azienda</td></tr><tr><td>Luria Bertani Brodo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td>O un'altra azienda</td></tr><tr><td>Marine Brodo 2216</td><td>VWR</td><td>90004-006</td><td>Difco</td></tr><tr><td>Nylon viti a testa piatta con intaglio</td><td>McMaster-Carr</td><td>92929A243</td><td>M 2 &volte; 4 &volte; 8 mm</td></tr><tr><td>Set di pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-403-151</td><td>O un'altra azienda</td></tr><tr><td>Puntali per pipette - 1 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-2A</td><td>O un'altra azienda</td></tr><tr><td>Puntali per pipette - 20 &micro; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-4</td><td>O un'altra azienda</td></tr><tr><td>Puntali per pipette - 200 &micro; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-1</td><td>O un'altra azienda</td></tr><tr><td>Sale marino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9883</td><td>Per acqua di mare artificiale</td></tr><tr><td>Pipetta sierologica - 50 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SIAL1490-100EA</td><td>O un'altra azienda</td></tr><tr><td>Filtro per siringa - 0,02 &; m</td><td>Whatman</td><td>WHA68091002</td><td>Filtro Anatop</td></tr><tr><td>Filtro per siringa - 0,2 &micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>10695211</td><td>O altra azienda</td></tr><tr><td>Ago per siringa 27G</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710004020</td><td>0,4 &volte; 12 mm</td></tr><tr><td>Siringhe - 1 mL</td><td>Codau</td><td>329650</td><td>Siringhe per insulina Luer U-100</td></tr><tr><td>- 10 mL</td><td>BD</td><td>303134</td><td>O altra azienda</td></tr><tr><td>Siringhe - 50 mL</td><td>BD</td><td>15899152</td><td>O altra azienda</td></tr><tr><td>Tubo rack - 15 mL</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V80</td><td>O un'altra azienda</td></tr><tr><td>Rack per provette - 50 mL</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V80</td><td>O un'altra azienda</td></tr><tr><td>Rubinetto per uso generale in acciaio ad alta velocità non rivestito</td><td>McMaster-Carr</td><td>8305A77</td><td>O un'altra azienda</td></tr><tr><td>Filtro per vuoto - 0,2 &micro; m</td><td>Merck</td><td>SCGPS05RE</td><td>Filtro Steritop</td></tr></tbody></table>

in situ chemotaxis assay per esaminare il comportamento microbico negli ecosistemi acquatici

In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems

I comportamenti microbici, come la motilità e la chemiotaxis (la capacità di una cellula di alterare il suo movimento in risposta a un gradiente chimico), sono diffusi nei domini batterici e archeali. La chemitaxis può comportare notevoli vantaggi di acquisizione delle risorse in ambienti eterogenei. Svolge anche un ruolo cruciale nelle interazioni simbiotiche, nelle malattie e nei processi globali, come il ciclo biogeochimico. Tuttavia, le tecniche attuali limitano la ricerca sulla chemiotaxis al laboratorio e non sono facilmente applicabili sul campo. Presentato qui è un protocollo passo-passo per la distribuzione del saggio in situ chemiotaxis (ISCA), un dispositivo che consente un robusto interrogatorio di chemiotaxis microbica direttamente nell'ambiente naturale. L'ISCA è un dispositivo microfluidico costituito da un array di 20 possilui, in cui possono essere caricate sostanze chimiche di interesse. Una volta impiegate in ambienti aque, le sostanze chimiche si diffondono fuori dai pozzi, creando gradienti di concentrazione che i microbi percepiscono e rispondono nuotando nei pozzi tramite chemiotaxis. Il contenuto dei beni può quindi essere campionato e utilizzato per (1) quantificare la forza delle risposte chemiotatiche a composti specifici attraverso la citometria del flusso, (2) i microrganismi reattivi isolati e della coltura e (3) caratterizzare l'identità e il potenziale genomico delle popolazioni che rispondono attraverso tecniche molecolari. L'ISCA è una piattaforma flessibile che può essere impiegata in qualsiasi sistema con una fase molto aque, compresi gli ambienti marini, d'acqua dolce e del suolo.

Questa sezione presenta i risultati di laboratorio utilizzando l'ISCA per testare la risposta chemiotattica dei microbi marini a una gamma di concentrazione di glutammina, un aminoacido noto per attirare i batteridel suolo 14. La concentrazione di glutammina che ha suscitato la risposta chemiotatica più forte nei test di laboratorio è stata utilizzata per eseguire un saggio di chemiotaxis nell'ambiente marino.
Per eseguire i test di laboratorio, le comunità di acqua di ...

Presentato qui è il protocollo per un saggio chemiotaxis in situ, un dispositivo microfluidico recentemente sviluppato che consente studi di comportamento microbico direttamente nell'ambiente.

In Situ Chemotaxis Assay per esaminare il comportamento microbico negli ecosistemi acquatici

Microbial behaviors, such as motility and chemotaxis (the ability of a cell to alter its movement in response to a chemical gradient), are widespread ...

Il nostro protocollo ci consente di quantificare in modo robusto le chemiotassi microbiche direttamente nel loro habitat di origine. E così possiamo isolare i microrganismi e possiamo quantificare e comprendere meglio il potenziale metabolico. Il saggio di chemiotassi in situ, o ISCA in breve, è un dispositivo flessibile, intuitivo e semplice che consente nuove informazioni sui comportamenti microbici e quindi sul ruolo e la funzione dei microrganismi in qualsiasi ambiente che abbia una fase liquida.A dimostrare la procedura di implementazione sia in laboratorio che sul campo è Estelle Clerc, attualmente dottoranda nel mio gruppo di ricerca. Prima di preparare il chemioattratrante, filtrare il mezzo con un filtro da 0,2 micrometri e autoclavare la soluzione filtrata. Successivamente, preparare una soluzione da 10 millimolare di chemioattratrante in 1 millilitro del mezzo sterile e filtrare la soluzione chemioattrattrice con un filtro siringa da 0,2 micrometri per rimuovere eventuali particelle e potenziali contaminanti.Quindi, diluire la soluzione di stock chemioattrattante filtrata in serie, secondo il protocollo sperimentale. Per riempire un ISCA, attaccare un ago calibro 27 a una siringa da 1 millilitro e caricare una siringa per ogni concentrazione del chemioattrattore filtrato. Tenendo il dispositivo con la porta rivolta verso l'alto, iniettare lentamente ogni concentrazione della sostanza in ciascuno dei cinque pozzali di una riga del dispositivo fino a quando non appare una piccola goccia sopra ogni porta.Quando tutti i pozzi sono stati riempiti, trasferire 1,5 millilitri della coltura batterica marina o d'acqua dolce di interesse in 150 millilitri del mezzo di coltura batterico appropriato. Quindi, posizionare due piccoli pezzi di nastro adesivo a doppia aspetto sulla superficie piana di un vassoio di capacità di 200 millilitri. E fissare un ISCA su ogni pezzo di nastro.Utilizzando una pipetta sierologica da 50 millilitri, riempire lentamente il vassoio di distribuzione con la soluzione batterica. E permettere ai batteri di rispondere al chemioattrattore di interesse per un'ora. Per terminare l'analisi, utilizzare una nuova pipetta da 50 millilitri per rimuovere delicatamente il mezzo dal vassoio ISCA.Per recuperare i campioni, posizionare prima l'ISCA in modo che la porta sia rivolta verso il basso. Successivamente, utilizzare una siringa sterile da 1 millilitro dotata di un ago calibro 27 per disegnare la soluzione da ogni pozzo. Estrarre i campioni da ogni fila della stessa concentrazione in un singolo tubo.Quindi, analizzare i campioni per citometria a flusso per determinare il numero di batteri attratti da ogni concentrazione chemioattrattante. Per preparare un ISCA per l'implementazione sul campo, in primo luogo, raccogliere 5 millilitri di acqua per ISCA dal lato campo e filtrare l'acqua attraverso un filtro siringa da 0,2 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Passare la siringa acqua filtrata attraverso una cartuccia filtrante GP idrofila due volte, raccogliendo il filtrato in un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 millilitri, dopo ogni risciacquo.Quindi, filtrare l'acqua attraverso un filtro siringa da 0,02 micrometri in un nuovo tubo da 50 millilitri. Utilizzare aliquote del filtrato per rimescolare tutti i chemioattrattivi di interesse alle concentrazioni desiderate in singoli tubi conici da 15 millilitri. Quindi utilizzare siringhe da 10 millilitri per filtrare i chemioattrattivi rimescolati attraverso singoli filtri siringhe da 0,2 micrometri in tubi sterili di centrifuga conica da 15 millilitri per rimuovere eventuali particelle indesiderate o composti insolubili in acqua.Per la distribuzione sul campo ISCA, avvitare ogni ISCA sul pezzo 9 dell'enclosure del dispositivo e chiudere l'enclosure. Sigillare l'involucro con nastro adesivo e utilizzare corde bungee per fissare l'involucro a un braccio di distribuzione e una struttura fatta dall'uomo. In alternativa, l'involucro può essere fissato con un piccolo peso su un substrato poco profondo o attaccato a una rete nell'oceano pelagico.Immergere completamente l'involucro per avviare il riempimento, tenendo saldamente l'involucro per evitare un eccessivo movimento dell'acqua all'interno. Una volta che il livello dell'acqua ha raggiunto la parte superiore dell'involucro, assicurarsi che all'interno non sia intrappolata aria. Quando l'involucro è completamente pieno, sigillare i fori inferiore e superiore con due spine.Quindi, lasciare l'ISCA in posizione per 1 o 3 ore. Al termine del periodo di campionamento, rimuovere l'involucro dall'acqua. Posizionare l'involucro su un contenitore per drenare l'acqua e rimuovere con cura la parte superiore del nastro adesivo dai fori anteriori.Una volta che la linea dell'acqua è passata sotto la parte superiore dell'ISCA, rimuovere il tappo inferiore e drenare il resto dell'acqua. Mentre gli ISCA sono ancora attaccati all'involucro, utilizzare una pipetta da 1 millilitro, o una siringa da 1 millilitro, per rimuovere con cura l'acqua intrappolata sopra ogni ISCA e rimuovere gli ISCA senza toccare la superficie superiore. Quindi utilizzare una salvietta monouso per rimuovere il liquido rimanente sulla superficie e recuperare i campioni come dimostrato per il recupero del campione di laboratorio.In questa analisi rappresentativa in vitro, 1 millimolare è stato determinato come la concentrazione ottimale di impiego della glutammina in quanto ha indotto una risposta chemiotattica significativa che era 18 volte superiore al controllo filtrato dell'acqua di mare. Concentrazioni sempre più elevate di glutammina hanno anche indotto una risposta chemiotattica significativa, ma più debole. In questa analisi di distribuzione sul campo, cinque repliche ISCA riempite con 1 glutammina millimolare sono state dispiegate per 1 ora in un sito costiero vicino a Sydney, in Australia.E l'ISCA riempito di glutammina ha attirato quasi tre volte più batteri dei pozzi di controllo pieni di acqua di mare filtrata. La cosa più importante da ricordare quando si distribuisce l'ISCA, sia in laboratorio che sul campo, è evitare di creare forti flussi di fluido che impediranno la chemiotassi. I campioni derivati dall'ISCA possono essere utilizzati per identificare organismi o geni specifici, per caratterizzare il potenziale genomico degli organismi chemiotattici e per l'isolamento mirato di ceppi specifici su mezzi selettivi.

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