Name: Virus della patata Silenziamento del microRNA basato sullX (VbMS) nella patata. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Scopri il silenziamento dei microRNA basato sul virus della patata X (PVX) per caratterizzare rapidamente i microRNA endogeni in Solanum tuberosum senza trasformazioni stabili.

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Ringraziamo il Dr. Yule Liu della Tsinghua University per aver fornito il vettore PVX-LIC. Questo lavoro è stato supportato da un fondo di start-up del Texas A & M AgriLife Research e dal progetto Hatch TEX0-1-9675 dall'USDA National Institute of Food and Agriculture a JS.

1. Coltiva piante di patate.
<ol><li>Propagare in vitro le piante di patate in tubi di coltura (25 x 150 mm) con mezzi Murashige e Skoog (MS) più la vitamina di Gamborg (miscela di sale basale MS, vitamina di Gamborg, 30 g/L di saccarosio, 3,5 g/L di agar, pH = 5,7). Posizionare i tubi nella stanza di crescita a meno di 20-22 °C, 16 ore di luce/8 ore di fotoperiodo scuro e intensità luminosa 120 μmol/m2∙s1. NOTA: Nuovi germogli e radici normalmente si sviluppano in 1-2 settimane dalle piante. Propagare le piante con i mezzi vitaminici freschi di MS / Gamborg ogni mese.</li>
	<li>Quattro settimane dopo, trapiantare piante in vitro nel terreno e coltivarle in una serra sotto i 20-22 °C, 16 ore di luce/8 ore di fotoperiodo scuro e intensità luminosa 120 μmol/m2∙s1. NOTA: Le piante con radici e foglie di nuova concezione sono adatte al trapianto. Mantenere l'umidità per le piante appena trapiantate per i primi 3-4 giorni.</li>
</ol>2. Costruisci i vettori VbMS.
<ol><li>Progettare e clonare le molecole TM in tandem corto (STTM, Figura 1)22,53 per il miRNA di interesse. NOTA: Acquisire sequenze di miRNA basate su dati sperimentali o dal database miRbase54,55,56,57,58,59. La sequenza miR166 utilizzata in questo studio è stata descritta in precedenza60.<ol>
<li>Progettare il modulo TM inserendo una sequenza di mismatch, normalmente 5'-CTA-3', nella sequenza del complemento inverso di miRNA nel sito corrispondente al 10°-11° nucleotide del miRNA. NOTA: Ad esempio, la sequenza Stu-miR160 è 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61, dove il 10°-11° nucleotide è in grassetto. La sequenza del complemento inverso (nei deossinucleotidi) è 5'-GGCATACAGGGAGGGCCAGGCA-3' e il sito di inserimento del rigonfiamento disallineamento è mostrato in grassetto. La sequenza di molecole TM (deossinucleotide) deve essere 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'.</li>
		<li>Primer di progettazione per la clonazione del frammento STTM (Figura 1). Utilizzare oligonucleotidi del DNA con la sequenza distanziatore 48-nt come modello per la clonazione PCR. Il primer anteriore è costituito da un linker LIC1 (5'-CgACgACAAgACCgT-3'), la sequenza in avanti di quanto sopra progettata per la molecola TM e la sequenza parziale 5' del distanziatore 48-nt (5'-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'). Il primer inverso è costituito da un linker LIC2 (5'-gAggAgAagAgCCgT-3'), la sequenza del complemento inverso della molecola TM e un complemento inverso parziale alla sequenza 3' del distanziatore 48-nt (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3'). NOTA: la sequenza distanziatore 48-nt è 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAT-3'. Ad esempio, per STTM-miR160, il primer anteriore deve essere 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'; il primer inverso dovrebbe essere 5'-gAggAgAagAgCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' (Figura 1).</li>
		<li>Amplificare il frammento STTM in un volume di 50 μL mediante PCR utilizzando il distanziatore universale sintetizzato da 48 nt come modello e una DNA polimerasi ad alta fedeltà.<ol>
<li>Impostare la reazione PCR mescolando 0,5 μL di ciascun primer (40 μM), 0,5 μL di oligo distanziatore 48-nt (40 μM), 5 μL di tampone PCR 10x, 1 μL di miscela dNTP (10 mM ciascuno), 0,1 μL di DNA polimerasi ad alta fedeltà (10 U/μL) e 43 μL di ddH2O per un volume totale di 50 μL. Eseguire l'amplificazione PCR standard come segue: 94 °C per 3 min, 32 cicli di 94 °C per 45 s, 60 °C per 45 s e 72 °C per 60 s.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Purificare il frammento STTM mediante precipitazione di etanolo. Aggiungere 2,5 volumi di etanolo e 1/10 di volume di 3 M di acetato di sodio (pH = 4,0) ai prodotti PCR. Mescolare energicamente e centrifugare a 14.000 x g per 10 min. Rimuovere il surnatante e risciacquare il pellet con 1 mL di etanolo al 70%. Asciugare il pellet e scioglierlo in 20 μL di ddH2O. NOTA: Utilizzare l'elettroforesi del DNA per verificare l'amplificazione dei prodotti STTM PCR.</li>
		<li>Impostare la reazione T4 DNA polimerasi sul ghiaccio mescolando 2,5 μL di prodotto STTM PCR purificato, 0,5 μL di 10x T4 DNA polimerasi tampone, 0,05 μL di 1 M ditiotreitolo (DTT), 0,25 μL di 100 mM dATP, 0,1 μL di T4 DNA polimerasi (3 U/μL) e 1,6 μL di ddH2O per un volume totale di 5 μL. Incubare la miscela a 37 °C per 15 min, e trattare i prodotti a 75 °C per 20 minuti per inattivare la DNA polimerasi T4.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare il costrutto VbMS basato su PVX.<ol>
<li>Digerire 5 μg di plasmide PVX-LIC38 con 2,5 μL di SmaI (20 U/μL) in un volume di 100 μL.</li>
		<li>Aggiungere un volume uguale di fenolo:cloroformio:isopropanolo (25:24:1, pH = 6,7/8,0) ai prodotti PVX-LIC digeriti e mescolare vigorosamente. Centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti e trasferire il surnatante in un nuovo tubo centrifuga. Aggiungere un volume uguale di cloroformio:isopropanolo (24:1) e vorticare vigorosamente. Centrifuga a 14.000 x g per 10 min. NOTA: il vettore PVX-LIC ospita la cassetta LIC per la clonazione. La cassetta LIC del vettore PVX-LIC contiene un gene ccdB e un gene resistente al cloramfenicolo e deve essere mantenuta/propagata nel ceppo DB3.1 di E. coli utilizzando un mezzo LB contenente kanamicina (50 μg/L) e cloramfenicolo (15 μg/L).</li>
		<li>Trasferire il surnatante in un nuovo tubo della centrifuga. Aggiungere 2,5 volumi di etanolo e 1/10 di volume di 3 M di acetato di sodio (pH = 4,0) e mescolare vigorosamente. Centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Risciacquare il pellet con 1 ml di etanolo al 70% e vorticare vigorosamente. Centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti e rimuovere il surnatante. Asciugare il pellet e sciogliere il plasmide PVX-LIC digerito con 100 μL di ddH2O.</li>
		<li>Impostare la reazione T4 DNA polimerasi sul ghiaccio mescolando 2,5 μL di DNA vettore PVX-LIC digerito, 0,5 μL di 10x T4 DNA polimerasi tampone, 0,05 μL di 1 M DTT, 0,25 μL di 100 mM dTTP e 0,1 μL di T4 DNA polimerasi (3 U/μL) in un volume totale di 5 μL. Incubare la miscela a 37 °C per 15 min e trattare i prodotti a 75 °C per 20 min fino a inattivare la DNA polimerasi T4.</li>
	</ol></li>
	<li>Clonare la sequenza STTM nel vettore PVX-LIC usando una reazione LIC. Mescolare i prodotti STTM PCR trattati con DNA polimerasi T4 (5 μL) e i plasmidi PVX-LIC trattati con DNA polimerasi T4 (5 μL). Incubare a 70 °C per 5 minuti, raffreddare a 22 °C su una rampa di 0,1 °C/s e mantenere a 22 °C per 30 minuti utilizzando una macchina PCR. NOTA: Estendere il tempo di incubazione a una notte a 4 °C per ottenere una maggiore efficienza della clonazione LIC.</li>
	<li>Trasformare 5 μL dei prodotti di reazione LIC in E. coli DH5α e crescere su una piastra LB contenente 50 μg/mL kanamicina62,63. Selezionare e verificare le colonie positive mediante PCR con i primer di clonazione e il primer universale per il vettore PVX-LIC seguito dal sequenziamento.<ol>
<li>Eseguire la PCR della colonia con il primer anteriore per PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') in combinazione con il primer inverso per la clonazione STTM per identificare i cloni positivi. La dimensione della banda PCR dovrebbe essere ~ 300 bp. NOTA: Verificare le sequenze dei frammenti STTM mediante sequenziamento del ciclo terminatore64,65.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolare i plasmidi PVX-STTM dai cloni convalidati e trasformarli in ceppi di Agrobacterium GV3101, GV2260 o EHA10562,63. Verificare le colonie di Agrobacterium mediante PCR. NOTA: Confermare le colonie di Agrobacterium mediante PCR utilizzando il primer anteriore per PVX-LIC e il primer inverso per la clonazione STTM.</li>
</ol>3. Eseguire il test VbMS basato su PVX nelle piante di patate.
<ol><li>Trapianto di piante di patate in vitro di 4 settimane nel terreno. Le piante trapiantate saranno sottoposte al test VbMS 3-4 giorni dopo.</li>
	<li>Inoculare le piante di patate con Agrobacterium contenente i plasmidi PVX-STTM. NOTA: Per il test VbMS nella patata, l'infiltrazione mediata da Agrobacterium e l'inoculazione da graffio di stuzzicadenti vengono eseguite contemporaneamente.<ol>
<li>Prelevare e inoculare i trasformatori positivi contenenti vettori PVX-STTM in 50 mL di LB liquido contenente 50 μg/mL kanamicina e 50 μg/mL di rifampicina. Crescere in un incubatore a 28 °C a 220 giri/min per 16 ore fino a OD600 = 1,0.</li>
		<li>Allo stesso tempo, strisciare le colonie positive di Agrobacterium su almeno due nuove piastre LB contenenti 50 μg/mL di kanamicina e 50 μg/mL di rifampicina e crescere a 28 °C per 1 giorno. Includere il vettore PVX-LIC38,66 come controllo e PVX-GFP67,68 per monitorare la diffusione del virus.</li>
		<li>Raccogliere la coltura liquida di Agrobacterium per centrifugazione a 3.400 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Sospendere le cellule agrobatterio con un volume uguale di tampone di infiltrazione (10 mM MgCl2, 10 mM MES e 200 μM acetosiringone, pH = 5,6) e regolare a OD600 = 1,0. Incubare a temperatura ambiente per 6 ore.</li>
		<li>Infiltrare la coltura di Agrobacterium nel lato abassiale delle foglie completamente espanse con una siringa senza ago da 1 mL.<ol>
<li>Capovolgere e tenere una foglia con una mano, quindi utilizzare un dito per sostenere la lamina fogliare dal lato adassiale nel sito di infiltrazione. Tenere la siringa verticale sulla superficie fogliare con l'altra mano e infiltrare la coltura di Agrobacterium nel lato abassiale della lamina.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Raschiare la coltura di Agrobacterium dalle piastre LB e graffiare la superficie del gambo del primo o due internodi delle piante di patate infiltrate con uno stuzzicadenti. Grattare delicatamente l'epidermide del gambo. Evitare di perforare il gambo, che può causare gravi danni alle piante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coltiva le piante infiltrate a 22 °C con un fotoperiodo scuro di 16 ore di luce/8 ore e un'intensità luminosa di 120 μmol/m2∙ s1 in una serra. NOTA: I fenotipi causati dal silenziamento dei miRNA di solito compaiono in 2-4 settimane di post-oculazione (Figura 2, Figura 3). In genere ci vogliono 10-20 giorni perché il fenotipo VbMS appaia dopo l'infiltrazione. Il fenotipo VbMS dipende dalle proprietà dei geni specifici del miRNA e del bersaglio, dalle condizioni di crescita e dalle varietà di patate.</li>
</ol>4. Eseguire l'analisi delle espressioni.
<ol><li>Quando i fenotipi compaiono a 2-4 settimane di post-osservazione, raccogliere tessuti come germogli, foglie, fiori o radici con fenotipi dalle piante VbMS e tessuti dalle piante di controllo con le forbici. Isolare gli RNA totali dai tessuti raccolti.</li>
	<li>Controllare la qualità dell'RNA mediante elettroforesi62,63 e quantificare la concentrazione di RNA misurando l'assorbanza OD260 con uno spettrofotometro.</li>
	<li>Utilizzare la PCR a trascrizione inversa in tempo reale (RT-PCR) per analizzare l'espressione del miRNA.<ol>
<li>Per miRNA specifici, progettare un primer di trascrizione inversa stem-loop. I primer RT stem-loop contengono una spina dorsale universale da 5' e un'estensione di 3' 6-nt di un miRNA specifico. Progettare una spina dorsale universale da 5' (5'- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3') che formi una struttura stem-loop. (Il maiuscolo corrisponde a una sequenza ripetuta inversa e il minuscolo alla regione del loop).</li>
		<li>Parte della sequenza dorsale di 5' che forma un loop funge da primer inverso per la successiva amplificazione PCR (sequenza grassetto-corsivo nella sequenza backbone). Aggiungere una sequenza di estensione 6-nt che sia complementare all'estremità 3' del miRNA di interesse al primer stem-loop per fornire specificità per la trascrizione inversa (Figura supplementare 1A). NOTA: Progettare il primer di trascrizione inversa stem-loop come descritto da Chen et al.69 e Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72. Ad esempio, il primer di trascrizione inversa stem-loop per Stu-miR160 è progettato come 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3'. Il primer a trascrizione inversa stem-loop per la famiglia miR165/166 di patate è progettato come 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGGG(A/G)A-3'. (Le sequenze maiuscole in grassetto forniscono la specificità della trascrizione inversa per specifici miRNA).</li>
		<li>Impostare la reazione di trascrizione inversa mescolando 50-200 ng di RNA totale, 1 μL del primer di trascrizione inversa stem-loop (100 μM), 2 μL di tampone 10x, 0,2 μL di inibitore della RNasi (40 U/μL), 0,25 μL di dNTPs (10 mM ciascuno) e 1 μL di trascrittasi inversa (200 U/μL) sul ghiaccio. Aggiungere ddH2O senza nucleasi a un volume totale di 20 μL.</li>
		<li>Eseguire la trascrizione inversa utilizzando la procedura di trascrizione inversa pulsata. Incubare la miscela di reazione a trascrizione inversa a 16 °C per 30 min, eseguire un ciclo di temperatura di 30 °C per 30 s, 42 °C per 30 s e 50 °C per 1 s, per un totale di 60 cicli, e inattivare la trascrittasi inversa per incubazione a 85 °C per 5 min.</li>
		<li>Per l'analisi PCR in tempo reale dell'espressione dei miRNA, progettare il primer in avanti basato sulla sequenza di miRNA, ma non includere sequenze che si sovrappongono al primer di trascrizione inversa stem-loop progettato sopra. Aggiungere un'estensione di 3-7-nt ai 5' del primer in avanti per ottimizzare la lunghezza, la temperatura di fusione e il contenuto di GC (Figura supplementare 1). NOTA: il primer inverso universale è 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. Ad esempio, il primer di trascrizione inversa stem-loop per Stu-miR160 è progettato come 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'. Il primer di trascrizione inversa stem-loop per la famiglia miR165/166 è 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. Le sequenze in grassetto fungono da estensioni da 5' per l'ottimizzazione del primer. I primer di trascrizione inversa stem-loop e i primer PCR in tempo reale per miRNA possono essere progettati utilizzando il miRNA Primer Design Tool73.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintetizzare cDNA degli mRNA bersaglio mediante PCR a trascrizione inversa standard (RT-PCR). Incubare la miscela di reazione a trascrizione inversa a 37 °C per 60 minuti e inattivare la trascrittasi inversa riscaldando a 85 °C per 5 minuti. NOTA: (1) Prevedere gli mRNA bersaglio utilizzando il programma psRNATarget74 se gli mRNA bersaglio non sono noti. (2) Il primer universale di trascrizione inversa per mRNA è un primer ancorato 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'.</li>
	<li>Impostare la reazione PCR in tempo reale sia per i miRNA di interesse che per gli mRNA target. Mescolare 0,5 μL di cDNA modello, 5 μL di 2x buffer PCR in tempo reale con verde SYBR, 0,05 μL di ciascun primer avanti e indietro (40 μM) e 4,4 μL di ddH2O in un volume totale di 5 μL su ghiaccio.</li>
	<li>Incubare a 95 °C per 3 min, 40 cicli di 95 °C per 3 s e 60 °C per 30 s. Eseguire una successiva analisi della curva di fusione come segue: incubare a 95 °C per 15 s, raffreddare a 60 °C su una rampa di 20 °C/s, mantenere a 60 °C per 60 s, riscaldare a 95 °C a una rampa di 0,2 °C/s e mantenere a 95 °C per 15 s. Analizzare i valori Ct utilizzando i metodi ΔΔCt76,77 e tracciare i mezzi con errori standard. NOTA: (1) I primer PCR in tempo reale per gli mRNA target possono essere progettati come descritto75. (2) Il gene della poliubiquitina 10 della patata può servire come controllo interno per la normalizzazione nella patata. Il primer in avanti per il gene della poliubiquitina 10 della patata è 5'-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGTTG-3' e il primer inverso 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Per l'analisi PCR in tempo reale, la contaminazione e la formazione di primer-dimero possono generare risultati falsi positivi. Per monitorare l'amplificazione non specifica e aumentare la responsabilità dell'analisi PCR in tempo reale, si consiglia di includere controlli senza modello e trascrittasi inversa per i test PCR in tempo reale.</li>
</ol>

Presentiamo un sistema silenziatore di miRNA basato su PVX per caratterizzare la funzione dei miRNA endogeni nella patata integrando il design STTM nel vettore PVX. Il sistema VbMS si è dimostrato efficace nel silenziare il miRNA165/166 nella patata, una famiglia di miRNA altamente conservata in tutte le specie vegetali.
L'approccio TM è stato sviluppato per interferire con l'espressione dei miRNA basati su un miRNA artificiale bersaglio mimico che è progettato per creare un ciclo di mismatch ...

I microRNA vegetali (miRNA) sono caratterizzati da 20-24 RNA regolatori a base di nucleotidi, codificati nucleari1 e svolgono un ruolo fondamentale in quasi tutti gli aspetti dei processi biologici delle piante, tra cui crescita e sviluppo2,3, fotosintesi e metabolismo4,5,6,7, sintesi e segnalazione ormonale8,9, risposte biotiche e abiotiche10, 11,12,13 e regolazione dei nutrienti e dell'energia14,15. I ruoli regolatori dei miRNA vegetali sono ben programmati e soddisfatti tipicamente a livelli post-trascrizionali mediante scissione o repressione traslazionale degli mRNA bersaglio.
Sono stati compiuti enormi progressi verso l'identificazione, la profilazione trascrizionale e la previsione target dei miRNA nella patata16,17,18,19,20,21. Tuttavia, la caratterizzazione funzionale dei miRNA nelle piante, compresa la patata, è rimasta indietro rispetto ad altri organismi a causa della mancanza di approcci genetici efficienti e ad alto rendimento. È difficile eseguire l'analisi funzionale dei singoli miRNA mediante l'analisi standard della perdita di funzione, perché la maggior parte dei miRNA appartiene a famiglie con notevole ridondanza genetica22. Inoltre, un singolo miRNA può controllare più geni bersaglio23 e diversi miRNA possono modulare lo stesso percorso molecolare in modo collaborativo24,25. Queste proprietà rendono difficile caratterizzare la funzione di uno specifico miRNA o di una famiglia di miRNA.
Gran parte dell'analisi funzionale dei miRNA si è basata fortemente su approcci di guadagno di funzione che hanno evidenti limitazioni. Il metodo dei miRNA artificiali (amiRNA) sfrutta i trascritti primari endogeni (pri-miRNA) per produrre miRNA ad alto livello, portando all'inibizione dell'espressione genica bersaglio26,27,28,29. Tuttavia, il tagging di attivazione e la sovraespressione di miRNA utilizzando un forte promotore costitutivo 35S spesso portano ad una maggiore espressione di miRNA che non sono rappresentativi delle condizioni in vivo e quindi potrebbero non riflettere la funzione endogena dei miRNA30. È stato sviluppato un approccio alternativo che coinvolge l'espressione di forme di geni bersaglio resistenti ai miRNA che contengono mutazioni uncleavable nei siti di legame e/o scissione31,32,33. Ma questo approccio può anche potenzialmente causare un'interpretazione errata del fenotipo derivato dal transgene bersaglio resistente ai miRNA a causa di artefatti transgenici. Pertanto, le conclusioni di questi studi sul guadagno di funzione devono essere tratte con cautela34. Un altro importante limite degli approcci sopra descritti è che richiedono una trasformazione, che richiede molta manodopera e tempo. Inoltre, gli approcci transgenici-dipendenti sono difficilmente applicabili per le specie vegetali trasformatrici-recalcitranti. Pertanto, è essenziale sviluppare un approccio rapido ed efficiente alla perdita di funzione per svelare la funzione dei miRNA.
Per aggirare il prerequisito della procedura di trasformazione, è stato stabilito il silenziamento di microRNA basato su virus (VbMS) combinando le strategie mimiche target (TM) con vettori derivati da virus. Nel sistema VbMS, le molecole tm progettate artificialmente sono espresse transitoriamente da una spina dorsale del virus, offrendo uno strumento potente, ad alto rendimento e risparmio di tempo per sezionare la funzione dei miRNA endogeni delle piante35,36. VbMS è stato inizialmente sviluppato in N. benthamiana e pomodoro con il virus del sonaglio del tabacco (TRV)35,36,37 ed è stato esteso a Arabidopsis, cotone, grano e mais utilizzando vari altri sistemi di espressione del virus, tra cui il virus della patata X (PVX)38, il virus dell'accartocciamento delle foglie di cotone (ClCrV)39, il virus del mosaico del cetriolo (CMV)40,41,42, il virus cinese del mosaico del grano (CWMV)43 , e il virus del mosaico a strisce d'orzo (BSMV)44,45.
La patata (Solanum tuberosum) è la quarta coltura alimentare più importante e la coltura non cereale più coltivata al mondo principalmente a causa del suo elevato valore nutrizionale, dell'elevata produzione di energia e del fabbisogno di input relativamente basso46. Diverse caratteristiche della patata ne fanno un'attraente pianta modello dicotiledone. È una coltura poliploide propagata vegetativamente con alto tasso di outcrossing, eterozigosi e diversità genetica. Tuttavia, ad oggi, non esiste alcun rapporto che caratterizzi la funzione dei miRNA nella patata utilizzando VbMS. Qui presentiamo un approccio VbMS basato su PVX di patate adattato alla clonazione indipendente dalla legatura (LIC) per valutare la funzione dei miRNA nelle piante di patate38. Abbiamo selezionato la famiglia miR165/166 per illustrare il test VbMS perché la famiglia miR165/166 e i loro mRNA target e i fattori di trascrizione hd-ZIP III (omeodomain/Leu zipper) di Classe III sono stati ampiamente caratterizzati22,47,48. I geni HD-ZIP III sono regolatori chiave dello sviluppo del meristema e della polarità degli organi, e la soppressione della funzione miR165/166 porta ad una maggiore espressione dei geni HD-ZIP III, con conseguenti difetti dello sviluppo pleotropico come la ridotta dominanza apicale e modelli aberranti di polarità fogliare22,35,38,41 . I fenotipi dello sviluppo facilmente ottenibili correlati con il silenziamento di miRNA165/166 consentono una valutazione accurata dell'efficacia del test VbMS basato su PVX.
In questo studio, dimostriamo che il sistema VbMS basato su PVX può bloccare efficacemente la funzione dei miRNA nella patata. Poiché il sistema di silenziamento genico indotto da virus basato su PVX (VIGS) è stato stabilito in un certo numero di varietà di patate49,50,51,52, questo approccio VbMS basato su PVX può essere probabilmente applicato a una vasta gamma di specie di patate diploidi e tetraploidi.

<table><tbody><tr><td>100 &micro; M dATP e 100 &micro; M dTTP</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td><td>TQAC136</td><td></td></tr><tr><td>3 M Acetato di sodio, pH 4.0.</td><td>Teknova, Hollister, CA 95023, USA</td><td></td><td></td></tr>#S0297 <tr><td>Acetosyringone</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>D2666-25G</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens ceppi: GV3101, GV2260 o EHA105.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0757-950ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido, DMSO</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>D0798-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DB3.1</td><td></td><td></td><td>per il mantenimento di PVX-LIC e pTRV2e contenenti il gene ccdB</td></tr><tr><td>E. coli DH5&alfa;</td><td></td><td></td><td>per i costrutti di destinazione generati dalla clonazione LIC</td></tr><tr><td>Fertilizzante: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed</td><td>ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA</td><td>G99260</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti PCR ad alta fedeltà: KAPA HiFi DNA polimerasi con dNTP</td><td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA</td><td>7958960001</td><td></td></tr><tr><td>Alcool</td> <td>isoamilicoVWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0944-1L</td><td></td></tr><tr><td>Koptec Etanolo puro &ndash; 200 Proof</td><td>Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA</td><td>V1005M</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>M0606-250G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>MFCD00149781</td><td></td></tr><tr><td>Trascrittasi</td> <td>inversa M-MuLVNew England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0253L</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro a nanogoccia: NanoDrop OneC Spettrofotometro UV-Vis a microvolume con Wi-Fi</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA Macchina PCR ND-ONEC-W</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: Bio-Rad MyCycler PCR System</td><td>Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>Macchina PCR: Eppendorf Mastercycler pro</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA</td><td>950030010</td><td></td></tr><tr><td>pHmetro</td><td>Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA</td><td>Misuratore di pH/mV da banco - 860031</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo:cloroformio:alcol isoamilico (25:24:1), pH 6,7/8,0.</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0883-400ML</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel: Gellan Gum</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA</td><td>J63423-A1</td><td></td></tr><tr><td>PVX VIGS vector: PVX-LIC</td><td></td><td></td><td>Zhao et al., 2016</td></tr><tr><td>Macchina per PCR in tempo reale: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>Reagente PCR in tempo reale: KAPA SYBR&reg; Kit FAST qPCR Master Mix (2x)</td><td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA 01887, USA</td><td>7959389001</td><td></td></tr><tr><td>Enzima di restrizione: SmaI</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti per trascrizione inversa: qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA</td><td>95107-100</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione dell'RNA: E.Z.N.A. Plant RNA Kit</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td><td>SKU: D3485-01</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi Murine</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0314L</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol RT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA</td><td>R4533</td><td></td></tr><tr><td>Suolo: Metro-Mix 360</td><td>Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA</td><td>Metro-Mix 360</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimerasi e tampone</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0203S</td><td></td></tr></tbody></table>

virus della patata silenziamento del microrna basato sull'x (vbms) nella patata.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

Il silenziamento di microRNA basato su virus (VbMS) è uno strumento rapido ed efficiente per la caratterizzazione funzionale dei microRNA (miRNA) nelle piante. Il sistema VbMS è stato sviluppato e applicato per varie specie vegetali tra cui Nicotiana benthamiana, pomodoro, Arabidopsis, cotone e piante monocotiledoni come grano e mais. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che utilizza vettori VbMS basati su PVX per silenziare i miRNA endogeni nella patata. Per abbattere l'espressione di uno specifico miRNA, vengono progettate molecole bersaglio mimico (TM) di miRNA di interesse, integrate in vettori di virus vegetali ed espresse in patate dall'infiltrazione di Agrobacterium per legarsi direttamente al miRNA endogeno di interesse e bloccarne la funzione.

La Figura 2 mostra le piante di patata PVX-STTM165/166 (Katahdin) con crescita ectopica dei tessuti fogliari dal lato abassiale della lamina fogliare lungo le vene. Sono stati osservati anche fenotipi più gravi come la formazione di foglie a forma di tromba. Al contrario, non è stata osservata alcuna anomalia fenotipica negli impianti di controllo PVX. Questi risultati mostrano che il sistema VbMS era efficace nel sopprimere la funzione endogena dei miRNA nelle piante di patate tetraploidi e...

Presentiamo un protocollo dettagliato per il sistema di silenziamento dei microRNA (VbMS) basato sul virus della patata X (PVX) per caratterizzare funzionalmente i microRNA endogeni (miRNA) nella patata. Le molecole mimiche bersaglio (TM) di miRNA di interesse sono integrate nel vettore PVX ed espresse transitoriamente in patata per silenziare il miRNA bersaglio o la famiglia di miRNA.

Virus della patata Silenziamento del microRNA basato sull'X (VbMS) nella patata.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

L'approccio tradizionale all'analisi della funzione dei microRNA nelle piante si basa principalmente sulla generazione di piante knockdown stabili. Questo sistema di silenziamento dei microRNA basato su virus non richiede una trasformazione noiosa e dispendiosa in termini di tempo. Il silenziamento dei microRNA basato su virus è uno strumento rapido ed efficiente per la caratterizzazione funzionale dei microRNA nelle piante che può essere applicato a un'ampia gamma di specie di patate diploidi e tetraploidi.A dimostrare la procedura sarà Jinping Zhao, un ricercatore post-dottorato associato del mio laboratorio. Per progettare il modulo mimico target, inserire una sequenza di mismatch nella sequenza del complemento inverso del microRNA di interesse nel sito corrispondente al 10° e 11° nucleotidi del microRNA. Per amplificare il frammento mimico del bersaglio tandem corto, impostare una reazione PCR con ciascun primer di interesse, un oligo spaziale a 48 nucleotidi, un tampone PCR 10 volte, una miscela dNTP, DNA polimerasi PCR ad alta fedeltà e acqua distillata doppia fino a un volume finale di 50 microlitri.Quindi amplificare il microRNA mediante PCR standard utilizzando i parametri indicati. Per purificare i brevi imitatori del bersaglio tandem, aggiungere 2,5 volumi di etanolo e 1/10 del volume di acetato di sodio a tre molari al prodotto PCR. Mescolare energicamente prima di centrifugare la reazione a 14.000 volte G per 10 minuti.Dopo aver rimosso il surnatante, sciacquare il pellet con un millilitro di etanolo al 70% e lasciare asciugare il pellet, quindi sciogliere il pellet in 20 microlitri di acqua distillata doppia. Per impostare una reazione della DNA polimerasi T4, mescolare il prodotto di PCR mimico a bersaglio tandem corto purificato con 10 volte il tampone DNA polimerasi T4, un ditiotreitolo molare, 100 millimolare di dATP, DNA polimerasi T4 e acqua distillata doppia fino a un volume finale di cinque microlitri su ghiaccio. Quindi incubare la miscela per 15 minuti a 37 gradi Celsius, seguita da un'incubazione di 20 minuti a 75 gradi Celsius per inattivare la DNA polimerasi T4.Per preparare il costrutto VBMS basato su PVX, digerire cinque microgrammi di plasmidi di clonaggio indipendenti dalla legatura PVX con 2,5 microlitri di SMA1 in un volume totale di 100 microlitri. Aggiungere un volume uguale di fenolo al cloroformio all'alcol isoamilico, aggiungere un rapporto da 25 a 24 a uno ai prodotti di clonazione indipendenti dalla legatura PVX digeriti con una miscelazione vigorosa e raccogliere il prodotto per centrifugazione. Aggiungere un volume uguale di cloroformio all'alcol isoamilico in un rapporto di 24 a uno rispetto al surnatante con vortice prima di sottoporre il contenuto della provetta a una seconda centrifugazione.Al termine della centrifuga, trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga e aggiungere 2,5 volumi di etanolo e 1/10 del volume di acetato di sodio a tre molari con una miscelazione vigorosa. Centrifugare la provetta e sciacquare il pellet con un millilitro di etanolo al 70% e vorticare vigorosamente. Centrifugare nuovamente la provetta e rimuovere il surnatante per consentire al pellet di asciugarsi all'aria.Quindi sciogliere il pellet di plasmide di clonaggio indipendente dalla legatura PVX digerito in 100 microlitri di acqua distillata doppia. Per impostare la reazione della DNA polimerasi T4, mescolare il DNA vettore di clonaggio indipendente dalla legatura PVX digerito con 10 volte il tampone polimerasi DNA T4, un ditiotreitolo molare, 100 millimolare dTTP e DNA polimerasi T4 fino a un volume finale di cinque microlitri su ghiaccio. Quindi incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 15 minuti, seguita da un'incubazione di 20 minuti a 75 gradi Celsius per inattivare la DNA polimerasi T4.Per clonare la sequenza mimica del bersaglio tandem corto nel vettore di clonaggio indipendente dalla ligazione PVX, mescolare cinque microlitri del prodotto PCR mimico del bersaglio tandem corto trattato con DNA polimerasi T4 con cinque microlitri del plasmide di clonaggio indipendente dalla legatura PVX trattato con DNA polimerasi T4 e incubare la miscela per cinque minuti a 70 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, raffreddare il contenuto della provetta a 22 gradi Celsius in una macchina PCR a una velocità di 0,1 gradi Celsius al secondo, lasciando la provetta nel termociclatore per 30 minuti una volta raggiunta la temperatura target. Al termine dell'incubazione, trasformare cinque microlitri di prodotto della reazione di clonazione indipendente dalla legatura in E.coli DH5 alfa utilizzando protocolli di trasformazione standard e far crescere i batteri trasformati su una piastra LB contenente 50 microgrammi per millilitro di kanamicina.Dopo aver verificato le sequenze dei frammenti mimici del bersaglio tandem corto mediante sequenziamento del ciclo del terminatore, isolare i plasmidi PVX VBMS dai cloni convalidati e trasformarli nei ceppi di Agrobacterium appropriati. Inoculare piante di patate in vitro di quattro settimane con Agrobacterium contenente i plasmidi PVX VBMS, prelevare trasformanti positivi contenenti vettori PVX VBMS e inoculare i trasformanti in 50 millilitri di LB liquido contenente 50 microgrammi per millilitro di kanamicina e 50 microgrammi per millilitro di rifampicina per 16 ore a 28 gradi Celsius e 220 giri al minuto. Durante l'incubazione, strisciare le colonie di Agrobacterium positive su almeno due nuove piastre LB contenenti kanamicina e rifampicina e far crescere le colture a 28 gradi Celsius per un giorno.Quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge 1,0, raccogliere la coltura liquida di Agrobacterium mediante centrifugazione e risospendere il pellet in un volume sufficiente di tampone di infiltrazione per regolare la densità ottica a 600 nanometri a 1,0. Dopo un'incubazione di sei ore a temperatura ambiente, caricare una siringa senza ago da un millilitro con la sospensione di Agrobacterium e usare una mano per capovolgere e tenere una foglia espansa da una pianta di patate. Usando un dito, sostenere la lamina fogliare dal lato adassiale nel sito di infiltrazione desiderato.E tenendo la siringa verticale sulla superficie fogliare con l'altra mano, infiltare da 100 a 200 microlitri di coltura di Agrobacterium nel lato aassiale della lamina. Successivamente, usa uno stuzzicadenti per raccogliere le colonie dalle piastre di coltura dell'Agrobacterium e per graffiare la superficie dello stelo dei primi uno o due internodi delle piante di patate infiltrate e l'epidermide dello stelo, quindi fai crescere le piante infiltrate nella serra per due o quattro settimane. Quando compaiono i fenotipi, utilizzare le forbici per raccogliere campioni con fenotipi dal VBMS e controllare le piante.Isolare l'RNA totale dai tessuti raccolti e utilizzare la PCR con trascrittasi inversa per analizzare il microRNA e l'espressione dell'mRNA target in ciascun campione. In queste immagini, si possono osservare piante di patata PVX short tandem che imitano 165/166 piante di patate con crescita ectopica dei tessuti fogliari dal lato abassiale della lamina fogliare lungo le nervature. Sono stati osservati anche fenotipi più gravi, come la formazione di foglie a forma di tromba.Al contrario, non sono state osservate anomalie fenotipiche nelle piante di controllo PVX, dimostrando che il sistema VBSM è efficace nel sopprimere la funzione endogena dei microRNA nelle piante di patate tetraploidi. Le piante di patate 165/166 che imitano il bersaglio tandem corto PVX mostrano una crescita ectopica da foglia a tessuto dal lato aassiale della lamina fogliare lungo le vene della lamina, dimostrando che il sistema VBMS PVX può essere applicato ad altre varietà di patate, comprese le principali cultivar di patate. È fondamentale infiltrare contemporaneamente le foglie e inoculare il fusto della stessa pianta con la stessa coltura di Agrobacterium.Gli approcci transgenici per l'introduzione stabile di molecole mimiche bersaglio nelle piante di patata sono raccomandati quando lo stato di silenziamento dei microRNA bersaglio deve essere mantenuto nelle generazioni di prole.

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Agroinfiltrazione e Agroinfezione PVX in Benthamiana di Patate e Nicotiana

Indotta da virus silenziamento genico è uno strumento utile per identificare geni coinvolti nella resistenza nonhost delle piante. Dimostriamo l'uso di agenti patogeni batterici che esprimono GFPuv nell'identificazione di geni silenziati piante suscettibili ai patogeni nonhost. Questo approccio è semplice, veloce e facilita lo screening su larga scala e di protocollo simili possono essere applicati a studiare varie altre interazioni pianta-microbo.

VIGS-Mediated Forward Genetica screening per la identificazione di geni coinvolti nella resistenza Nonhost

Descriviamo qui un metodo per regolare il tropismo del picornavirus incorporando sequenze complementari a specifici microRNA nel genoma virale.  Questo protocollo può essere adattato a tutte le diverse classi di virus con modifiche in base alla lunghezza e alla natura del loro ciclo di vita.

Regolamento MicroRNA basata su Picornavirus Tropismo

Qui, presentiamo due protocolli per trasformare piante di patate. La trasformazione di Agrobacterium tumefaciens conduce ad una pianta transgenica completa mentre l' Agrobacterium rhizogenes produce radici transgeniche pelosi in un tiro di tipo selvatico che può essere auto-propagato. Individuiamo quindi l'attività del promotore di GUS colorazione nelle radici trasformate.

Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes-mediata trasformazione di patate e l'attività del promotore di un Gene di suberina da GUS Staining

Qui, presentiamo un metodo di screening modificato che può essere ampiamente utilizzato per vagliare rapidamente i soppressori del silenziamento dell'RNA negli agenti patogeni delle piante.

Screening e identificazione dei soppressori del silenziamento dell'RNA da parte degli effetti segreti dei patogeni vegetali

Questo metodo dimostra l'uso della tecnica di ibridazione settentrionale per rilevare i miRNA dall'estratto totale di RNA.

RNA Blot Analisi per il rilevamento e la quantificazione dei microRNA vegetali

Viene presentato un protocollo di iniezione (agroiniezione) a base di Agrobacterium per l'inoculazione del virus del mosaico a coda di volpe e dei virus del mosaico della canna da zucchero in piantine di mais. L'inoculazione in questo modo porta a infezioni virali, silenziamento genico indotto da virus di geni marcatori e sovraespressione virale di GFP.

Agroinoculazione diretta di piantine di mais per iniezione con cloni infettivi del virus del mosaico della coda di volpe ricombinante e virus del mosaico della canna da zucchero

Qui presentiamo un protocollo per studiare il tasso di inizio della morte cellulare programmata mediante imaging continuo delle foglie inoculate dopo l'induzione della morte cellulare.

Studiare l'inizio della morte cellulare utilizzando un microscopio digitale

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