Name: Modello di malattia microfluidico in vitro per studiare le interazioni sangue-endoteliali intere e le dinamiche del coagulo di sangue in tempo reale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Scopri un modello microfluidico in vitro per studiare le interazioni sangue-endotelio e valutare la trombogenicità in tempo reale. Questo metodo supporta la medicina personalizzata nelle malattie vascolari.

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Ringraziamo Jan Voorberg del Dipartimento di Proteine plasmatiche, Sanquin Research e Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academic Medical Center, Amsterdam, Paesi Bassi, per il suo contributo in questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Dutch CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-11] assegnata al Phaedra e al consorzio Reconnect, nonché dalla sovvenzione Impulse 2018 assegnata al consorzio Phaedra IMPACT. Queste sovvenzioni includono finanziamenti collettivi da parte della Dutch Heart Foundation, della Federazione olandese dei centri medici universitari, dell'Organizzazione olandese per la ricerca e lo sviluppo della salute e della Royal Netherlands Academy of Sciences. Inoltre, questo lavoro è stato finanziato dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito del programma Advanced Grant "VESCEL" (numero di sovvenzione: 669768). XDM è finanziato da una sovvenzione di ricerca dell'Institute for CardioVascular Research (ICaR-VU) presso il VU University Medical Center di Amsterdam, Paesi Bassi.

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</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

La coagulazione è il risultato dell'interazione complessa e controllata tempormente tra l'endotelio e i componenti del sangue. Questo saggio in vitro presenta un metodo per studiare le proprietà trombogeniche delle cellule endoteliali in tempo reale. Possono essere utilizzati vari tipi di cellule endoteliali umane primarie, facilitando la trombosi in situ in un organo e in modo specifico del paziente. In questo studio, abbiamo illustrato l'uso di questo protocollo confrontando le proprietà trombogeniche dei PAIC isolati dai donatori sani rispetto ai pazienti CTEPH. La formazione di trombo vivo è stata studiata per la perfusione di sangue intero da soggetti sani rispetto all'endotelio attivato dall'istamina, mentre l'effetto di un DOAC è stato testato come agente antitrombotico.
Oltre all'uso di microcandoli disponibili in mercato, come mostrato nei risultati rappresentativi, l'introduzione dei canali microfluidici su base su base consente lo studio dell'influenza dei cambiamenti della geometria vascolare sulla formazione dei trombi. Ad esempio, la diminuzione del flusso in un punto di diramazione o stenosi comporta un aumento della sollecitazione di taglio e un aumento dell'attivazione dellepiastrine 36. Tuttavia, una limitazione significativa di questi canali microfluidici su cui su modelli è il requisito di numeri di cellule elevati per formare un monostrato stabile di EC, come descritto al punto 2.3.2. Ciò può presentare un fattore limitante quando le cellule derivate dal paziente sono scarse. I punti di forza delle microastrazioni disponibili in mercato sono che le superfici vengono modificate per la coltura cellulare e le aree di crescita sono più grandi, consentendo così agli EIc di formare un monostrato confluente e stabile. D'altra parte, una superficie più grande si tradurrà in un lume più grande. Secondo l'equazione 1, ciò richiede volumi di sangue più elevati per raggiungere flussi simili a quello della microfluidica su cui su base.
Un miglioramento di questo protocollo potrebbe essere quello di studiare la perdita di CE in tempo reale o i cambiamenti nell'integrità delle barriere. I danni comunitari nel presente protocollo sono misurati solo alla fine dell'esperimento. Per il monitoraggio in tempo reale, ECs può essere contrassegnato con mCherry VE-cadherin, ad esempio37. Tuttavia, poiché ciò avrebbe bisogno di un protocollo altamente ottimizzato con una trasmissione di virus efficiente, l'ECIS (Electric Cell-substrate Impedance Sensing) potrebbe essere utilizzato come alternativa allo studio dell'integrità endoteliale e della funzione dibarriera 38. La perfusione su speciali canali di flusso ECIS consente il monitoraggio longitudinale dell'integrità delle barriere endoteliali in corso. Queste caratteristiche specifiche di ECIS consentono misurazioni parallele delle proprietà delle barriere endoteliali e della formazione di trombo. Le modalità alternative per le misurazioni parallele delle barriere CE, in particolare negli array su misura, includono l'uso di dextrans fluorescente nel profumo, che si diffondono dal lumen, a seconda delle proprietà della barriera COMUNITARIA.
Una limitazione del protocollo descritto è che gli EIc vengono rimossi dal corpo umano e colturati sulla plastica di coltura tissurica, che è un substrato rigido e artificiale. Le cellule si adattano al loro ambiente biofisico. Ciò potrebbe influire sulla risposta endoteliale all'attivazione delle piastrine, in quanto esiste un'associazione tra l'attivazione delle piastrine e la rigiditàdella parete 39. Nonostante questi adattamenti alla plastica di coltura, le cellule mantengono caratteristiche specifiche della malattia che possono essere identificate in confronto diretto con gli EC derivati da donatori sani come mostrato con il controllo, CTEPH-PAEC e HUVEC che hanno esercitato diversi modelli di adesione alle piastrine e deposizione di fibrina dopo 5 minuti di perfusione di sangue.
A differenza di altri protocolli, questo sistema utilizza sangue intero, mentre altri studiano l'interazione CE con un singolo componente del sangue come piastrine e leucociti19,20,21. Sono stati sviluppati modelli microfluidici più avanzati che consentono lo studio della funzione endoteliale in un modello vascolare con una geometria rotonda del vaso e una matrice extracellulare morbida. Tuttavia, questi sono ottimizzati con HUVECs40,41,42. La novità del protocollo descritto è l'uso di EC primari combinati con sangue intero portando la modellazione della trombosi in situ un passo più vicino alle condizioni in vivo. L'ottimizzazione del protocollo per l'uso di EC derivati dal paziente e sangue derivato dal paziente ottimizza ulteriormente la modellazione della malattia in vitro,consentendo la valutazione della formazione personalizzata di trombo e del trattamento farmacologico.
Il protocollo descritto può essere applicato per studiare l'effetto delle terapie anticoagulanti sulle cellule derivate dal paziente. Mentre abbiamo usato il dabigatran per inibire la formazione di trombi, è possibile utilizzare altri anticoagulanti, come rivaroxaban, che inibisce direttamente il fattore Xa nella cascata di coagulazione. Inibitori a piastrine dirette come clopidogrel o aspirina possono essere studiati, in quanto agiscono sulla fase primaria dell'emostasi in cui le piastrine si legano agli EC. In definitiva, le capacità trombogeniche dei VC specifici del paziente in interazione con il sangue del paziente possono essere utilizzate per prevedere l'effetto personale della terapia anticoagulante sul singolo paziente. Inoltre, un knockdown di proteine specifiche può fornire ulteriori informazioni funzionali.
Ci sono alcuni passaggi nel protocollo descritto che sono fondamentali per un esperimento di perfusione di successo. In primo luogo, durante l'isolamento delle cellule primarie, è necessario ottenere una coltura CE altamente pura. In secondo luogo, è importante che gli EIc formino un monostrato confluente stabile. Se questo non è il caso, un leggero cambiamento nella sollecitazione di taglio può causare danni endoteliali e l'attivazione della cascata di coagulazione, o piastrine possono iniziare a legarsi alla membrana seminterrato, che fornirà risultati falsi positivi. In terzo luogo, è essenziale prevenire le bolle d'aria, in quanto possono danneggiare l'endotelio e quindi influenzare i risultati.
Dopo il ricalcolo del sangue citrato con cloruro di calcio e cloruro di magnesio, è importante avviare immediatamente l'esperimento di perfusione. Il ricalcolo induce una risposta rapida nell'attivazione delle piastrine e nella formazione di trombi, con conseguente coagulazione rapida nel campione.
In conclusione, descriviamo un protocollo altamente versatile per studiare intere interazioni tra cellule endoteliali del sangue durante la trombosi.

L'endotelio forma lo strato cellulare interno dei vasi sanguigni e separa il sangue dal tessuto circostante. È stato descritto come un organo dinamico che regola attivamente il suo micro-ambiente e risponde agli stimoli esterni1. A causa del suo contatto diretto con il sangue che scorre, l'endotelio è fondamentale nel controllo dell'emostasi e della trombosi ed è la fonte primaria di molte delle principali molecole regolatorie che controllano l'aggregazione delle piastrine, la coagulazione e la fibrinolisi2. Le cellule endoteliali sane e non attivate (EC) producono diverse molecole che contrastano l'attivazione delle piastrine e impediscono la coagulazione e la formazione di trombosi per mantenere il flusso sanguigno, come la prostaciclina, la trombomodulina o l'inibitore del percorso del fattore tissutale (TFPI)2,3. Ciò impedisce l'adesione di piastrine, aggregazione piastrine, e la formazione di trombo. Lesione o attivazione della parete del vaso si traduce in un fenotipo endoteliale procoagulant che avvia l'adesione delle piastrine localizzate e la formazione delcoagulo 2,4. Dopo l'attivazione endoteliale piastrine aderire a von Willebrand Factor (VWF), una proteina multimerica rilasciata da ECs, o ai siti di legame esposti della matrice subendoteliale sottostante. Successivamente, i cambiamenti molecolari nelle piastrine e l'esposizione al fattore tessuto (TF) avviano l'attivazione del sistema di coagulazione, che induce la formazione di trombo per polimerizzazione fibrina5,6. Insieme, il coagulo risultante fornisce la base per la chiusura delle ferite mediante re-endotelializzazione7. Le perturbazioni del sistema di coagulazione possono provocare disturbi emorragici, come la malattia di von Willebrand, l'emofilia o la trombosi, che spesso derivano da un equilibrio pro-e antitrombotico disregolato del percorso emostatico endoteliale2,3.
Il processo di emostasi si verifica sia nella circolazione arteriosa che venosa. Tuttavia, i meccanismi alla base della trombosi arteriosa e venosa sono fondamentalmente diversi. Mentre la trombosi arteriosa, come si vede nella cardiopatia ischemica, è per lo più guidata dalla rottura di una placca aterosclerotica in condizioni di alto stress di taglio, la trombosi venosa si sviluppa principalmente in assenza di lesioni endoteliali in una condizione di stasi8,9,10. Un trombo venito profondo può embolizzare e viaggiare verso le arterie polmonari, dove provoca un'embolia polmonare. Ciò può provocare ostruzioni vascolari croniche che portano a significative capacità funzionali compromesse che potrebbero favorire lo sviluppo di malattie polmonari chonic tra cui lo sviluppo di ipertensione polmonare tromboembolica cronica (CTEPH)11,12,13,14. Il CTEPH è caratterizzato da una pressione polmonare elevata dovuta a ostruzioni delle arterie polmonari da parte di materiale tromboembolico dopo almeno tre mesi di terapia anticoagulante15. Oltre all'emboli polmonare, è postulato che l'endotelio polmonare fornisca un ambiente protrombotico in CTEPH che facilita la trombosi in situ e le ostruzioni croniche delle arterie polmonari, causando l'aumento della pressione sanguigna che alla fine può provocare insufficienza cardiaca, se non trattata16,17.
Negli ultimi anni, vari studi hanno portato allo sviluppo di saggi per esaminare la formazione di trombo misurando la funzione delle piastrine e la coagulazione18. Tuttavia, la maggior parte di loro o studiare l'interazione di sangue intero con singoli componenti di matrice extracellulare come collageni o fibrin, o funzione endoteliale in interazione con singoli componenti del sangue, come endoteliale-piastrine o interazione endoteliale-leucocato19,20,21,22. Questi saggi sono più comunemente eseguiti con cellule endoteliali vene ombelicali umane (HUVEC), come queste cellule sono facilmente ottenute. Tuttavia, i geni emostatici sono espressi in modo differenziale tra l'albero vascolare, i tipi di vaso e i sistemi di organi23,24, che fa uso di HUVEC per rappresentare le cellule endoteliali coinvolte nella trombosi arteriosa o nelle embolie polmonari problema23.
Oltre alla plasticità comunitaria, le alterazioni emodinamiche specifiche della malattia e i cambiamenti nella morfologia vascolare possono promuovere la formazione di trombo al normale endotelio25. Tassi di taglio più elevati, a causa della vasoconstriction locale o dei cambiamenti nella geometria del vaso, ad esempio, possono provocare la formazione di trombosi acuta, causando una stenosi che accelera la cessazione del flusso sanguigno26. L'uso di canali di flusso microingegneri su base personalizzata consente di progettare specificamente geometrie vascolari rappresentative della biologia (pato). In questo modo, è possibile studiare l'effetto delle forze biomeccanici locali sulla CE27 sana o mata.
Ci sono terapie anticoagulanti disponibili per il targeting di diverse fasi e molecole nella cascata di coagulazione, che tutti pongono rischi e benefici particolari che possono essere specifici per alcuni disturbi. L'approccio della modellazione della malattia descritto in questo documento è particolarmente adatto per testare gli effetti di varie terapie anticoagulanti e antiplatelet sulla dinamica del trombo.
L'obiettivo è quello di presentare un modello di trombosi che includa eC primarie, producendo un modello versatile adatto per l'analisi di varie forme di trombosi a seconda del tipo di ECs primario utilizzato. A prima illustrazione, abbiamo usato cellule endoteliali dell'arteria polmonare di pazienti affetti da CTEPH in interazione con sangue umano intero contenente tutti i componenti coinvolti nella formazione di trombi (piastrine, leucociti, erytrociti, proteine di coagulazione e cofattori). Questo approccio può essere applicato nei canali di flusso paralleli commerciali o in canali di flusso microfluidico su su cui su modelli con una progettazione vascolare specifica. Come tale, il modello può eventualmente essere utilizzato nello studio della formazione e risoluzione del trombo, per la valutazione delle risposte infiammatorie nella modellazione della malattia, per la terapia antiplatelet o anticoagulante e, infine, per la medicina personalizzata.
Questo studio descrive l'isolamento delle cellule endoteliali dell'arteria polmonare primaria. Per l'isolamento di altri tipi di cellule endoteliali umane primarie, ci riferiamo a metodi precedentemente pubblicati, tra cui le cellule endoteliali microvaricolari polmonari25, le cellule endoteliali della vena ombelicaleumana 28e le cellule di formazione della colonia endoteliale circolante del sangue Figura 1A29.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 20 mL</td><td>BD</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>20X obiettivo</td><td>Olympus</td><td>N1492900</td><td>LUCPLFLN20XPH/0.45</td></tr><tr><td>2-propanolo (IPA)</td><td>Boom</td><td>760514555000</td><td></td></tr><tr><td>Aladdin Pompa a siringa</td><td>Word Precision Instruments</td><td>AL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488-Fibrinogen</td><td>Invitrogen</td><td>F13191</td><td>15 ug/mL</td></tr><tr><td>Alexa647-Capra anti coniglio</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Punzone per biopsia diametro 1 mm</td><td>Ted Pella</td><td>15110-10</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Calceina AM-Red</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>CD42b-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-208</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Merck</td><td>100244</td><td></td></tr><tr><td>Collagene di tipo I, coda di ratto</td><td>Corning</td><td>354249</td><td>0,1 mg/mL</td></tr><tr><td>Corning CellBIND Superficie 60 mm Piatto di coltura</td><td>Corning</td><td>3295</td><td></td></tr><tr><td>Cappa a flusso incrociato</td><td>Basan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Duran</td><td>2478269</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Merck</td><td>14431-43-7</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo cellulare endoteliale (ECM)</td><td>ScienCell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina Plasma umano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Tubo</td><td>di flusso ibidi</td><td>10831, 10841</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Merck</td><td>104070</td><td>0,1%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>micron-Slide VI 0.4 camere di flusso</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v1.49</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Forno da laboratorio</td><td>Quincy</td><td>10GC</td><td></td></tr><tr><td>LS720 Microscopio fluorescente</td><td>Etaluma</td><td>LS720</td><td></td></tr><tr><td>Luer connettore</td><td>ibidi</td><td>10802, 10825</td><td>Connettori a gomito maschio, Connettori per tubi femmina</td></tr><tr><td>Perle magnetiche MACS (anti-CD144)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-857</td><td>1:5</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopia, 76 x 26 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAAA000001##12E</td><td></td></tr><tr><td>Negativo fotoresist, SU-8</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali (NEAA)</td><td>Lonza</td><td>13-114E</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Merck</td><td>818715</td><td>4% PFA in PBS</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>senza calcio o magnesio</td></tr><tr><td>Plasma CUTE</td><td>Femto Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsilossano (PDMS), Sylgard 184</td><td>Dow</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>provette per la raccolta del sangue con citrato di sodio</td><td>BD</td><td>363048</td><td></td></tr><tr><td>citrato trisodico</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>25300-045</td><td></td></tr><tr><td>VE-Caderina (D87F2)-XP</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>2500</td><td>1:300</td></tr></tbody></table>

modello di malattia microfluidico in vitro per studiare le interazioni sangue-endoteliali intere e le dinamiche del coagulo di sangue in tempo reale

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

La formazione di coaguli di sangue comporta interazioni complesse tra le cellule endoteliali, la loro matrice sottostante, varie cellule del sangue, e proteine. L'endotelio è la fonte primaria di molte delle principali molecole emostatiche che controllano l'aggregazione delle piastrine, la coagulazione e la fibrinolisi. Anche se il meccanismo della trombosi è stato studiato per decenni, gli studi in vitro si concentrano principalmente su situazioni di danno vascolare in cui la matrice subendoteliale viene esposta, o sulle interazioni tra le cellule con singoli componenti del sangue. Il nostro metodo permette di studiare le interazioni tra sangue intero e una rete di cellule vascolari intatte e confluenti.
Utilizzando le cellule endoteliali umane primarie, questo protocollo offre l'opportunità unica di studiare l'influenza delle cellule endoteliali sulle dinamiche del trombo e fornisce preziose informazioni sulla fisiofisiologia della malattia trombotica. L'uso di canali di flusso microfluidico su base personalizzata consente l'applicazione di geometrie vascolari specifiche della malattia e cambiamenti vascolari morfologici specifici del modello. Lo sviluppo di un trombo è registrato in tempo reale e quantitativamente caratterizzato da adesione piastrine e deposizione di fibrina. L'effetto della funzione endoteliale nella dinamica alterata del trombo è determinato dalla postanalysis attraverso la colorazione dell'immunofluorescenza di molecole specifiche.
I risultati rappresentativi descrivono l'impostazione sperimentale, la raccolta dei dati e l'analisi dei dati. A seconda della domanda di ricerca, i parametri per ogni sezione possono essere regolati tra cui il tipo di cellula, i tassi di taglio, la geometria del canale, la terapia farmacologica e le procedure di postalisi. Il protocollo è convalidato quantificando la formazione di trombo sulla pulmoniale endotelio dell'arteria polmonare dei pazienti con malattia tromboembolica cronica.

I risultati rappresentativi possono essere suddivisi in tre parti, ognuna delle quali rappresenta le rispettive fasi di configurazione sperimentale, raccolta dei dati e analisi dei dati. A seconda della domanda di ricerca, i parametri per ogni passo possono essere modificati. I dati presentati vengono applicati per studiare l'influenza dell'endotelio sulla formazione di trombi.
Configurazione sperimentale È ben noto che le cellule endoteliali sono altamente eterogenee nella struttura e nella funzione, a seconda della posizione e del tempo, durante la salute e la malattia23. Varie fonti di cellule endoteliali possono essere utilizzate per studiare l'interazione endoteliale-sangue, che in questo caso erano disponibili in mercato HUVEC e PAC (Figura 1A). Gli HUVEC sono stati i più comunemente utilizzati nei modelli di laboratorio, mentre i PAIC sono cellule isolate derivate dal paziente dalle arterie polmonari. Inoltre, esistono protocolli ben consolidati disponibili per isolare le cellule endoteliali microvascolari (MVEC) dalla circolazione polmonare o dalle cellule endoteliali che formano la colonia endoteliale circolante (ECFC)25,28,29.
Dopo l'isolamento, le cellule endoteliali sono state caratterizzate da colorazione VE-cadherin, CD31 e TIE2 per confermare un fenotipo endoteliale. La caratterizzazione per la presenza di SMA e citokeratin indicava l'assenza di un fenotipo fibroblasta o epiteliale (Figura 1B). Dopo aver ottenuto una popolazione altamente pura di EC, le cellule di passaggio da 3 a 5 sono state utilizzate per seminare una microslide commerciale o canali di flusso microfluidico su su (Figura 1C). Mentre le microsocrapie disponibili in commercio sono principalmente camere di flusso parallele, o canali a forma di Y con parametri specificamente definiti in altezza o angolo di biforcazione, l'uso di vetrini microfluidico consente di adattare i parametri sperimentali alla geometria dei vasi in vivo e alla dinamica del flusso sanguigno31. Tuttavia, le dimensioni microfluidiche su base su impostazioni sono più piccole e tendono a limitare la diffusione delle cellule e a indurre piùmorte cellulare 32,33. Utilizzando un surplus di cellule compensa il fatto che solo una piccola percentuale di cellule aderisce. Questo è stato osservato quando è stata introdotta una stenosi, dove le cellule endoteliali hanno mostrato un fenotipo più allungato rispetto a un canale microfluidico parallelo (Figura 1D). Le camere di flusso commerciali hanno una superficie più grande a cui le cellule possono legarsi. Ciò richiede un numero inferiore di numeri di cella per il seeding.
Per studiare l'interazione endoteliale tra cellule e sangue, il sangue intero è stato perfuso su un monostrato endoteliale. Il sangue citrato è stato raccolto il giorno dell'esperimento e immediatamente prima della perfusione ricalcolata. Le cellule sono state stimolate con istamina per indurre il rilascio di VWF e l'adesione alle piastrine 30 min prima della perfusione (Figura 1E)34,35. A causa delle piccole dimensioni, i canali microfluidi su scala hanno permesso l'uso di volumi di sangue più piccoli.
Raccolta dati Per studiare la formazione di trombo su PAECs, Calcein AM-Rosso fluorescentemente etichettato cellule del sangue e Alexa488-coniugato fibrin sono stati perfusi per 5 min a 2,5 dina/cm2 (Figura 2A–C). Le cellule del sangue aderenti e la fibrina depositata sono state quantificate. Le immagini sono state acquisite ogni 30 s e quantificate con ImageJ. Era importante sottrarre lo sfondo per eliminare l'autofluorescenza delle piastrine non aderenti. L'algoritmo triangolare per la soglia è stato utilizzato per definire uno sfondo minimo. Ha consentito la misurazione di aggregati di piccole piastrine (Figura 2D).
Previsto, in condizioni non stimolate, non vi era alcun legame di piastrine e fibrina all'endotelio. Per promuovere il rilascio di VWF e l'associazione delle piastrine, i PAIC sono stati stimolati con l'istamina, che ha portato ad un aumento immediato dell'adesione delle piastrine raggiungendo un altopiano dopo 2,5 min. A quel tempo, le piastrine iniziarono a seciare i fattori autocrini che indusse l'aggregazione delle piastrine e la scissione del fibrinogeno in fibrina. Fibrin è stato depositato dopo 3 min e formato un aggregato stabile con piastrine dopo 4 min (Figura 2E).
Per indagare se questo effetto potrebbe essere inibito da un anticoagulante orale diretto (DOAC), il sangue è stato trattato con 10 nM dabigatran. Dabigatran è stato aggiunto alla diluizione del sangue, dove inibisce il fattore IIa nel percorso di coagulazione, e ha impedito alla scissione del fibrinogeno di formare fibre di fibrina. Quando il sangue trattato da dabigatran è stato perfuso su PAIC stimolato, la formazione di coaguli potrebbe essere direttamente inibita principalmente ritardando la deposizione di fibrina (Figura 2F).
Analisi dei dati Per studiare l'influenza di varie fonti endoteliali sulla formazione di trombo, sono stati analizzati i cambiamenti cellulari su 5 min di perfusione di sangue. L'endotelio è stato fissato e le piastrine aderenti sono state etichettate con CD42b prima dell'imaging al microscopio confocale. Ciò ha fornito un'analisi dettagliata per la colocalizzazione di piastrine e fibrina che potrebbero indicare fattori di coagulazione disfunzionali nel sangue. L'influenza della CE nella formazione dei coaguli è stata determinata dalla colorazione immunofluorescente standard. I contatti endoteliali tra cellule cellulari sono stati mantenuti, come confermato dalla colorazione VE-cadherin, indicando che i coaguli di sangue si sono formati sopra il monostrato endoteliale piuttosto che sulla matrice sottostante tra le lacune endoteliali (Figura 3). Inoltre, l'uso di diverse fonti cellulari ha provocato diversi modelli di trombmbi che si formano sull'endotelio. Gli HUVEC sono cellule endoteliali venose e hanno mostrato una limitata adesione alle piastrine e deposizione di fibrina, mentre la PAEC primaria maestra da pazienti affetti da CTEPH ha mostrato un'abbondante adesione alle piastrine e una maggiore deposizione di fibrina sulla stimolazione dell'istamina rispetto alla PAEC sana. Ciò suggerisce che l'endotelio dei pazienti affetti da CTEPH mostra una maggiore reattività alla vasoattivazione che si traduce in una maggiore formazione di trombi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig1.jpg"> Figura 1: panoramica schematica del protocollo. (A) Varie fonti e diversi tipi di cellule endoteliali sono stati isolati e ristrutturati per l'utilizzo in un canale di flusso microfluidico per esperimenti di perfusione. Immagini rappresentative di campi luminosi di diversi tipi di cellule endoteliali. La barra della scala - 50 m . (B) Le cellule isolate sono state caratterizzate da colorazione immunofluorescente per confermare un fenotipo endoteliale. Barra della scala - 50 m. (C) Le celle possono essere testate in diapositive di flusso commerciali o in un canale microfluidico su cui è possibile eseguire il seeding. (D) Rappresentante immagini di campo luminoso di HUVEC coltivate in diverse geometrie di canale. Barra della scala - 50 m. (E) Configurazione sperimentale degli esperimenti di perfusione di sangue. Il sangue citrato è stato raccolto, diluito con tampone salino, e perfuso su cellule endoteliali con una pompa di siringa. La vena polmonare e ombelicale in questa figura è stata modificata da Servier Medical Art, concessa in licenza con licenza generica Creative Common Attribution 3.0. http://smart.servier.com/ Si <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig1large.jpg" target="_blank">prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig2.jpg"> Figura 2: Acquisizione di immagini e quantificazione della formazione di trombi. (A) Immagine in time-lapse rappresentativa delle piastrine etichettate Calcein AM-Red aderenti e depositata fibrina coniugata alexa488 a 1, 3 e 5 minuti dopo la perfusione di sangue intero su PAIC non stimolati (B) e su PAIC stimolati dall'istamina. (C) Immagini in time-lapse rappresentative dell'adesione alle piastrine e della deposizione di fibrina a 1, 3 e 5 minuti di perfusione con sangue intero incubato con dabigatran perfuso su PAIC stimolati dall'istamina. Barra della scala : 50 m. (D) Panoramica schematica della quantificazione dell'immagine in ImageJ. (E) Quantificazione dell'adesione alle piastrine e deposizione di fibrina per ogni 30 s su un endotelio stimolato e istamina non stimolato. (F) Quantificazione dell'effetto del dabigatran sulla formazione di trombo quantificato dall'adesione alle piastrine e dalla deposizione di fibrina. I dati sono rappresentati come ± SD, n e 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig3.jpg"> Figura 3: Immagini confocali rappresentative di esperimenti di flusso per caratterizzare la formazione di trombo nell'adesione delle piastrine e nella deposizione di fibrina sulle cellule endoteliali. I contatti endoteliali tra cellule cellulari sono stati caratterizzati da VE-cadherin e misurati in PAIC di controllo, CTEPH PAIC derivati dal paziente e HUVEC. Barra della scala : 50 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Presentiamo un modello di malattia vascolare in vitro per studiare le interazioni del sangue intero con l'endotelio derivato dal paziente. Questo sistema permette lo studio delle proprietà trombogeniche delle cellule endoteliali primarie in varie circostanze. Il metodo è particolarmente adatto per valutare in situ trombogenicità e terapia anticoagulante durante diverse fasi della coagulazione.

Modello di malattia microfluidico in vitro per studiare le interazioni sangue-endoteliali intere e le dinamiche del coagulo di sangue in tempo reale

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

Questo modello di malattia in vitro, può essere utilizzato per studiare l'interazione del sangue intero e delle cellule derivate dal paziente, in particolare l'endoteliale, per valutare la trombogenicità e l'efficacia degli agenti anticoagulanti. Si tratta di cellule di endotelio che possono essere utilizzate in varie circostanze e possono essere modificate introducendo microfluidica su misura o regolando i parametri del flusso sanguigno. Inoltre, questo modello può essere utilizzato per studiare la dinamica del trombo in condizioni infiammatorie o per valutare gli effetti della terapia anticoagulante e antipiastrinica.In definitiva, questi approcci possono essere utilizzati in un metodo di medicina personalizzata. Dopo aver ottenuto un campione chirurgico di tessuto dell'arteria polmonare umana, rivestire un piatto di coltura cellulare ad alta affinità di 60 millilitri con due millilitri di cinque microgrammi per millilitro fiboronectina e incubare il piatto a 37 gradi Celsius per almeno 15 minuti. Alla fine dell'incubazione, utilizzare forcep sterili in un armadio a flusso laminare in condizioni sterili, per trasferire il tessuto in una piastra di Petri di PBS.Se il tessuto è ancora in un anello, tagliare l'arteria aperta con le forbici, facendo attenzione a non toccare lo strato più interno del vaso, poiché l'endotelio è facilmente danneggiato e rimosso. Dopo aver rimosso la fibronectina, aggiungere quattro millilitri di mezzo cellulare endoteliale completo al piatto e utilizzare le forcelle per trasferire il campione di tessuto nel mezzo, utilizzare un bisturi per raschiare con cura lo strato interno del vaso nel mezzo, facendo attenzione a evitare eventuali accumuli lipidici osservati nella parete del vaso. Dopo che le cellule sono state raccolte, posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare.Se i fibroblasti contaminano la coltura, utilizzare la separazione cellulare di affinità magnetica per un CD144, secondo le istruzioni del produttore per purificare le cellule. Generalmente, la coltura è definita pura, quando la citometria a flusso rileva il 10% o meno di cellule contaminanti. Quando il numero sufficiente di cellule endoteliali è stato ottenuto per uso sperimentale, le cellule endoteliali primarie possono essere caratterizzate per la presenza di marcatori specifici delle cellule endoteliali e per l'assenza di marcatori muscolari ed epiteliali lisci.Per la preparazione della camera di flusso, codificare un canale di uno scivolo a flusso di sei pozzi con 30 microlitri di gelatina allo 0,1% e incubare questo scivolo per almeno 15 minuti a 37 gradi Celsius. Oltre alle camere di flusso commerciali, è possibile utilizzare camere di flusso su misura con dimensioni specifiche per studiare l'influenza della geometria vascolare sulla dinamica del coagulo. Mentre lo scivolo è in incubazione, raccogliere le cellule da un'arteria polmonare confluente coltura cellulare endoteliale con EDTA e tripina e sedimentare che le cellule per centrifugazione, sospendere il pellet in 600 microlitri di mezzo cellulare endoteliale completo e con forza ma delicatamente, aggiungere 100 microlitri di cellule in ogni canale, aggiungere altri 50 microlitri di mezzo cellulare endoteliale completo al canale , per fornire un mezzo sufficiente per l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica, cambiare il mezzo il giorno successivo per lavare via le cellule non unite.Dopo sei giorni di coltura, le cellule avrebbero dovuto formare un monostrato confluente stabile. Il settimo giorno di coltura cellulare endoteliale dell'arteria polmonare, acquisire campioni di sangue venoso da soggetti che non ricevono un trattamento anticoagulante in 109 tubi anticoagulanti citrato monosodici e trasferire il sangue in un tubo da 50 millilitri. Il sangue può contenere virus e altri agenti infettivi.Pertanto è importante indossare sempre i guanti e seguire le linee guida di sicurezza per lavorare con il materiale umano. Etichettati fluorescentmente i globuli con una concentrazione da 1 a 10.000 di Calcein AM Red e 50 microgrammi per millilitro e aggiungere alexa 488 fibrinogeno, quindi incubare il sangue a 37 gradi Celsius per 15 minuti per consentire il completo assorbimento. 30 minuti prima della perfusione, trattare le cellule endoteliali dell'arteria polmonare con 100 microlitri di un'istamina micromolare nel mezzo cellulare endoteliale e l'1% di siero bovino fetale senza altri additivi.E utilizzare una siringa da 20 millilitri riempita con tampone di lavaggio per risciacquare i tubi del sistema di flusso, caricare una siringa da terzo a 20 millilitri con due millilitri di tampone di lavaggio e caricare la siringa su una pompa per siringhe. Utilizzare una seconda siringa da 20 millilitri per riempire i tubi di flusso con hippy più tampone contenente l'1% di albumina di siero bovino e utilizzare un connettore Laura a forma di gomito per collegare accuratamente i tubi al micro scivolo, collegare l'uscita della diapositiva alla siringa, riparare dalla microscopia posizionando la cella contenente lo scivolo sul palco e assemblando la configurazione per l'esperimento , regolare il microscopio e impostare i parametri per l'imaging. Ricalcificazione del sangue enfatico.E questo è un felice co-sponsor della coagulazione, inoltre cerca di evitare la formazione di bolle d'aria perché questo danneggerà lo strato cellulare endoteliale e influenzerà i tuoi risultati. Immediatamente prima della perfusione, diluire il sangue due volte con tampone di ricalcolo e posizionare il tubo di ingresso del micro scivolo nel tubo del sangue, premere start sulla pompa della siringa. Non appena il sangue inizia a scorrere sull'endotelio, premere start al microscopio per acquisire immagini utilizzando i canali attivi preselezionati e le posizioni della regione di interesse, ogni 15 secondi per cinque minuti.Al termine dell'analisi, interrompere la registrazione e la pompa della siringa e pulire correttamente. L'etichettatura delle piastrine con Calcein AM Red e l'aggiunta di fibrinogeno coniugato Alexa 488, consente lo studio della formazione di trombo per adesione piastrinica e fibra e deposizione. In condizioni non stimolate, non vi è alcun legame di piastrine o fibrina all'endotelio.La stimolazione con istamina si traduce in un immediato aumento dell'adesione piastrinica, che raggiunge un plateau dopo 2,5 minuti, in questo momento, le piastrine iniziano a secernere fattori autocrini che inducono un'aggregazione piastrinica e una scissione fibrinogena alla fibrina, con conseguente fibra e deposizione a tre minuti e la formazione di un aggregato stabile con le piastrine dopo quattro minuti. Il trattamento con anticoagulante diretto, inibisce sia la formazione di coaguli che l'adesione piastrinica rispetto al sangue non trattato. L'analisi immunofluorescente delle interazioni piastrine cellulari endoteliali dell'arteria polmonare dopo cinque minuti di perfusione, rivela il mantenimento della cellula endoteliale, dei contatti cellulari, come confermato dalla colorazione della cadherina endoteliale vascolare, indicando che i coaguli di sangue si formano sugli strati del modello endoteliale piuttosto che sulla matrice sottostante tra spazi endoteliali.le cellule endoteliali della vena ombelicale umana dimostrano meno adesione piastrinica e deposizione di fibrina rispetto all'endotelio dell'arteria polmonare. In particolare, le cellule endoteliali dell'arteria polmonare primaria maestra da pazienti cronici di ipertensione polmonare tromboembollica, mostrano un aumento dell'adesione piastrinica e una maggiore deposizione di fibrina rispetto alle cellule sane. La trombogenicità dell'endotelio dipende da molteplici fattori come l'origine del letto vascolare o le parti dello sfondo biologico.Utilizzando questo protocollo, le disfunzioni intrinseche nei componenti vascolari ed ematici, così come l'efficacia della terapia anti coagulata possono essere testate durante diverse fasi dell'emostasi della trombosi. Questo protocollo può essere utilizzato per comprendere le interazioni tra sangue e Teo, in varie malattie tromboemboliche con il potenziale finale di prevedere risposte specifiche del paziente alla terapia anticoagulante.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un metodo per la cultura un monostrato di cellule endoteliali durante l'intera superficie interna 3D di un dispositivo a microfluidi con microvascolare canali di dimensioni (&lt;30 micron) è descritta.

Microfluidica Endothelialized per lo studio delle interazioni microvascolari nelle patologie ematologiche

Una piattaforma microcanali-on-a-chip è stato sviluppato dalla combinazione di tecnica fotolitografica reflowable photoresist, litografia soft, e microfluidica. La piattaforma microcanali endothelialized imita il tridimensionale (3D) geometria in vivo microvasi, corre sotto flusso perfusione continua controllato, permette l'imaging di alta qualità e in tempo reale e può essere applicato per la ricerca microvascolare.

Procedura per lo sviluppo di multi-profondità circolare a sezione trasversale Endothelialized microcanali-on-a-chip

L'accessibilità di modelli affidabili per studiare le interazioni vascolari del sangue negli esseri umani è carente. Presentiamo un modello in vitro di cellule endoteliali umane primarie in coltura combinate con sangue intero umano per studiare le interazioni cellulari sia nel sangue (ELISA) che nel compartimento vascolare (microscopia).

A Novel In vitro Modello per lo studio delle interazioni tra l'uomo di sangue intero e l'endotelio

Questo protocollo replica fisiologica o patologica flusso di sangue in vitro per aiutare a determinare la risposta cellulare in patologie malattia. Introducendo una pressione camera di smorzamento a valle di una pompa per il sangue, il flusso di sangue attraverso il sistema vascolare può essere riassunta e imposto un monostrato di endotelio vascolare o un co-coltura mimetica.

Modello in vitro di fisiologiche e patologiche flusso sanguigno con applicazione di indagini di rimodellamento vascolare cellulare

La trasfusione piastrinica e l'emostasi sono state modellate utilizzando la ricostituzione del sangue e camere a flusso microfluidico per studiare la funzione delle piastrine della banca del sangue. I dati dimostrano le conseguenze della lesione da accumulo piastrinico sull'emostasi, in vitro.

Microfluidic Flusso Camere con sangue ricostituito al modello Emostasi e piastrine Transfusion<em&gt; In Vitro</em

Le cellule endoteliali primarie della vena ombelicale umana (HUVEC) sono state coltivate fino alla confluenza all'interno di un dispositivo di rete microfluidica. Sono state illustrate le distribuzioni della giunzione delle cellule endoteliali e della F-actina e sono stati quantificati in tempo reale a livello di singola cellula le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio e della produzione di ossido nitrico in risposta all'adenosina trifosfato (ATP).

Sviluppo e caratterizzazione di<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvasi Rete e misurazioni quantitative di endoteliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; E ossido nitrico Produzione

Questo articolo descrive un modello sperimentale di emostasi che misura contemporaneamente la funzione piastrinica e la coagulazione. Piastrine e di fibrina fluorescenza viene misurata in tempo reale, e il tasso di piastrine di adesione, il tasso di coagulazione, e l'inizio della coagulazione sono determinati. Il modello viene utilizzato per determinare le proprietà delle piastrine procoagulanti sotto flusso nei concentrati di trasfusione.

Un Microfluidic flusso Camera Modello per la trasfusione di piastrine e Emostasi Misure Deposizione delle piastrine e la formazione di fibrina in tempo reale

Vi presentiamo un modello in vitro che permette lo studio e l'analisi di coagulazione in intero, anticoagulato. L'anticoagulazione nel sistema dipende l'effetto anticoagulante naturale delle cellule endoteliali sane e attivazione endoteliale delle cellule si tradurrà nella coagulazione.

Valutazione delle proprietà anticoagulanti e anti-infiammatori delle cellule endoteliali mediante coltura cellulare 3D e Non intero anticoagulato

Presentato qui è un protocollo per un modello standardizzato di loop emodinamico in vitro. Questo modello consente di testare l'emocompatibilità di tubi perfusione o stent vascolari per essere conforme allo standard ISO (International Organization for Standardization) 10993-4.

Un modello di loop emodinamico in vitro per indagare l'emocitocompatibilità e l'attivazione delle cellule ospiti dei dispositivi medici vascolari

I test di trombolisi in vitro hanno spesso faticato a replicare le condizioni in vivo, sia nel trombo modello da digerire che nell'ambiente in cui si verifica la trombolisi. In questo articolo, esploriamo come l'accoppiamento del ciclo di Chandler e del saggio di fibrinolisi a flusso fluorimetrico in tempo reale (RT-FluFF) viene utilizzato per il monitoraggio della lisi del coagulo ex-vivo ad alta fedeltà.

Monitoraggio della fibrinolisi di coaguli di sangue intero formati ad ansa di Chandler sotto flusso di taglio in un modello di trombolisi in vitro

Qui presentiamo un protocollo per fabbricare e operare un sistema microfluidico che espone le cellule endoteliali a iperglicemia oscillatoria sincronizzata e a stress di taglio pulsatile. Questo approccio fornisce un modello in vitro fisiologicamente rilevante per lo studio della disfunzione endoteliale diabetica. Questo protocollo consente la misurazione quantitativa dello stress ossidativo e delle risposte delle cellule endoteliali.

Un sistema microfluidico per modellare la disfunzione endoteliale sotto stress fisiologico di taglio pulsatile combinato e iperglicemia oscillatoria

Scopri un modello microfluidico in vitro per studiare le interazioni sangue-endotelio e valutare la trombogenicità in tempo reale. Questo metodo supporta la medicina personalizzata nelle malattie vascolari.

Modello di malattia microfluidico in vitro per studiare le interazioni sangue-endoteliali intere e le dinamiche del coagulo di sangue in tempo reale (Video) | JoVE Journal

Modello di malattia microfluidico in vitro per studiare le interazioni sangue-endoteliali intere e le dinamiche del coagulo di sangue in tempo reale

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