Una piattaforma Lab-On-A-Chip per stimolare la Meccanotrazione osteocite e analizzare i risultati funzionali della rimodellamento osseo

Qui presentiamo protocolli per la coltivazione delle cellule ossee all'interno di una piattaforma lab-on-a-chip adattabile. Queste tecniche possono essere utilizzate per promuovere la nostra comprensione dei meccanismi che regolano il rimodellamento osseo indotto meccanicamente. Il nostro sistema consente la coltivazione a lungo termine delle cellule ossee, che consente la quantificazione diretta della formazione ossea e del riassorbimento in risposta ad ambienti di carico meccanico alterati.

L'uso di queste tecniche fondamentali può portare a scoperte che si estendono a una serie di problemi legati alle ossa come l'osteoporosi, la guarigione delle fratture e l'osteolisi periprotesi. Per creare lo strato di pozzo e microcanale, unire il prepolimero PDMS e l'agente polimerizzante con un rapporto di 10 a uno in una tazza di plastica e mescolare vigorosamente, quindi degasare il polimero per 30 minuti. Versare lentamente la miscela sulla maschera pre-livellata appropriata.

Lasciare riposare per 30 minuti e cuocerlo a 45 gradi Celsius per 18 ore. Allentare i bordi del PDMS con una spatola da laboratorio affusolata e staccarla con cura dalla maschera, quindi ritagliare i singoli trucioli con un bisturi e un modello stampato in 3D e pulirli in superficie con nastro adesivo. Per creare lo strato di membrana PDMS, ripetere i passaggi precedenti per la miscelazione, il versamento e la cottura del PDMS.

Rimuovere il foglio PDMS dalla scatola di livellamento e tagliare le singole membrane che corrispondono alle dimensioni del pozzo e dello strato di microcanale. Utilizzare le pinze per misurare lo spessore della membrana al centro e scartare tutte le membrane che si trovano al di fuori dello spessore desiderato, quindi pulire accuratamente le membrane con nastro adesivo e posizionarle su un pezzo di pellicola di paraffina. Per creare lo strato di coperchio PDMS, ripetere i passaggi precedenti per la miscelazione, il versamento e la cottura del PDMS.

Dopo aver tagliato i singoli coperchi a misura, perforare i fori di accesso attraverso il PDMS con un punzone di biopsia di un millimetro e quindi pulirli in superficie con nastro adesivo. Attivare le superfici dei livelli uno e due con un detergente al plasma per 30 secondi su un'impostazione di potenza a media radiofrequenza, quindi allineare i fori di accesso nel primo strato con i microcanali nello strato due e premere saldamente i due strati insieme. Per il design profondo, ripetere questo processo con strati due e tre utilizzando nastro a doppia parte per attaccare la pellicola di paraffina dello strato tre a una superficie piana durante il trattamento al plasma.

Tagliare il materiale in eccesso dalla membrana PDMS e rimuovere con cura il foglio di pellicola di paraffina dal fondo del chip. Cuocere il truciolo a 65 gradi Celsius per 10 minuti per aumentare la resistenza del legame tra gli strati PDMS, quindi inserire punte di erogazione dell'angolo nei fori di accesso nel coperchio e fissarli con un epossidico in due parti utilizzando una punta in micropipetta per applicare l'epossidico intorno a ogni punta. Dopo che l'epossidico è stato completamente polimerizzato, pulire in superficie il chip con il 70% di etanolo e trasferirlo in un armadio di biosicurezza.

Collegare una siringa da cinque millilitri alle punte di erogazione con tubi sterili in silicone e riempire l'intero chip con il 70% di etanolo per almeno 30 secondi. Rimuovere l'etanolo dal chip e sterilizzarlo con luce UV durante la notte. Il giorno successivo, lavare il truciolo tre volte con acqua distillata, riempirlo con acqua e rimuovere il tubo dalle punte di erogazione.

Incubare il chip per almeno 48 ore a 37 gradi Celsius. Posizionare una molla di compressione attorno all'albero della piastra e inserirla nel foro centrale sul fondo della base, quindi attaccare il blocco del quadrante sul fondo della base con quattro viti autofilettanti. Posizionare una seconda molla di compressione attorno alla vite centrale.

Inserire la vite nel foro a forma esagonale nella parte inferiore del quadrante e avvitare l'assieme nel foro filettato al centro del blocco del quadrante. Avvitare quattro standoff maschio-femmina nella parte inferiore della base. Rimuovere il margine di flessibilità dal dispositivo ruotando il quadrante in senso antiorario fino a quando la parte superiore della piastra non è sotto la parte superiore della base, quindi ruotare lentamente il quadrante in senso orario fino a quando la parte superiore della piastra non è livellata con la parte superiore della base.

Utilizzare una siringa da cinque millilitri per rimuovere l'acqua dal chip del pozzo profondo e rivestire il fondo del pozzo con 200 microlitri di collagene di tipo I nell'acido acetico per un'ora. Risciacquare il truciolo tre volte utilizzando DPBS con calcio e magnesio e posizionarlo nel supporto del truciolo. Seminare il chip con osteociti MLO-Y4 in mem alfa medium integrato con siero di vitello, FBS e penicillina/streptomicina.

Rimuovere i tubi dalle punte di erogazione, posizionare il chip in un piatto di coltura profondo e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 72 ore. Dopo l'incubazione, attaccare tubi sterili alle punte di erogazione e utilizzare una siringa da cinque millilitri per rimuovere il mezzo di coltura trascorso dal chip, quindi riempire lentamente il truciolo con mezzo fresco. Posizionare il supporto del truciolo nell'inserto rettangolare nella parte superiore della base del dispositivo di carico, alimentare il tubo attraverso le fessure situate sul coperchio e fissare il coperchio alla base.

Applicare il carico sulle celle ruotando il quadrante in senso orario fino a raggiungere lo spostamento della piastra desiderato, quindi posizionare il dispositivo di caricamento in una scatola di punta vuota di micropipette P1000 e incubare le celle con il carico per 15 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere il carico dalle celle ruotando il quadrante in senso antiorario nella posizione iniziale originale, quindi rimuovere il coperchio dal dispositivo, posizionare il supporto del truciolo nella piastra di coltura del pozzo profondo e incubare le cellule per un periodo di recupero post carico di 90 minuti. Utilizzare una siringa da cinque millilitri per rimuovere il mezzo condizionato dal chip e rimuovere il chip dal supporto del chip, quindi utilizzare una spatola rastrettata per rompere il legame tra il coperchio PDMS e lo strato del pozzo.

Le cellule sono ora pronte per essere analizzate. La configurazione superficiale-pozzo può essere utilizzata per analizzare l'attività funzionale di osteoblasti e osteoclasti. La formazione ossea dai preosteoblasti è stata quantificata usando macchie di alizarina rossa e von Kossa.

Il riassorbimento osseo dagli osteoclasti è stato quantificato utilizzando la colorazione blu toluidina e la microscopia elettronica a scansione è stata utilizzata per verificare la presenza di pozzi di riassorbimento. La configurazione del chip a pozzo profondo è stata utilizzata per indurre la meccanotraduzione degli osteociti allungando le cellule attraverso una distensione statica fuori dal piano. Le immagini di osteociti seminati in trucioli dimostrano che l'incubazione di 48 ore del chip con acqua distillata è fondamentale per mantenere la vitalità cellulare nella morfologia tipica.

Durante gli attacchi di carico, gli osteociti sono stati esposti a un gradiente di deformazione indotto sulla membrana PDMS. È stata determinata la relazione tra deformazione equivalente media e spostamento della piastra per valori compreso tra uno e due millimetri ed è stata generata una mappa termica rappresentativa del ceppo indotto. Dopo il carico, la vitalità cellulare è stata analizzata con la colorazione della lattato deidrogenasi e l'annesso V e il saggio delle cellule morte.

La colorazione lattato deidrogenasi degli osteociti allungati ha mostrato una colorazione più chiara vicino al bordo esterno del pozzo, che corrisponde alla posizione di valori di deformazione più elevati. La nostra piattaforma offre un alto grado di versatilità e può essere utilizzata per indagare una varietà di fattori che regolano il rimodellamento osseo come la meccanotrasduzione indotta dal carico, l'infiammazione e gli effetti dei farmaci. Le tecniche qui presentate forniscono una base per lo sviluppo di un vero organo osseo su un chip che potrebbe migliorare notevolmente la nostra comprensione delle complessità multicellulari che regolano la salute delle ossa.