Name: Scoperta dei geni del conducente nelle scansioni tumorali del cancro derivato dal cancro colorettale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Scopri l'identificazione dei geni driver sovraespressi nelle cellule staminali tumorali del cancro colorettale utilizzando RNA-Seq e strumenti bioinformatici. Questo metodo computazionale rivela meccanismi molecolari chiave per terapie mirate.

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Gli autori ringraziano il Radiation Biology Core Laboratory of Institute for Radiological Research, Chang Gung Memorial Hospital, per il supporto tecnico. Questo studio è stato sostenuto dalle sovvenzioni del Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1J0321), del Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06) e del Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 e MMH-106-61). Gli organismi finanziatori non hanno avuto alcuna influenza nella progettazione dello studio e nella raccolta, analisi e interpretazione dei dati o nella scrittura del manoscritto.

1. Coltura cellulare e formazione della sfera della tumore
<ol><li>Coltura cellule HT29 in un piatto da 10 cm contenente il mezzo aquila modificato di Dulbecco (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% antibiotico penicillina-streptomicina (P/S).</li>
	<li>Coltiva le cellule in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 e il 95% di umidità in condizioni aptiche, fino a raggiungere l'80% di confluenza.</li>
	<li>Provare le celle HT29 con 1 mL di 0,25% trypsin per 5 min a 37 s c e di conseguenza neutralizzare la trypsin aggiungendo 2 mL di DMEM con 10% FBS e 1% P/S.</li>
	<li>Contare le cellule HT29 usando un emocitometro.</li>
	<li>Aggiungere 2.000 cellule / pozzo ad un basso attaccato 6 piastre di pozzo con 2 mL di DMEM senza sè erolo con 1% P / S e integrato con 0.2% B27, 20 ng/mL del fattore di crescita epidermico (EGF), 20 ng/mL del fattore di crescita del fibroblasto (bFGF), 20 ng/mL del fattore di crescita epatocite (HGF) e 20 ng/mL di interleucina 6 (IL6).</li>
	<li>Far crescere le cellule a 37 gradi centigradi con un'umidità del 5% di CO2 e del 95% in condizioni aptiche.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL di media delle cellule staminali tumorali ogni 2 giorni fino a quando le sfere tumorali misurano >100 m di diametro per almeno 7 giorni.</li>
	<li>Osservare e misurare il diametro della biosfera della tumore utilizzando un microscopio invertito con un sistema di imaging cellulare digitale.</li>
	<li>Quando le sfere tumorali raggiungono >100 m di diametro, provare le sfere tumorali con 0,25% di prova per 5 min a 37 gradi centigradi e neutralizzare la metapsina aggiungendo 2x il volume del mezzo di crescita. Contare le cellule usando un emocitometro.</li>
	<li>Centrifuga a 1.200 giri/mm per 10 min e rimuovere il supernatante.</li>
	<li>Incubare 5 x 104 celle con 2 -L di anti-LGR5-PE e 2 -L di anti-CD133-PE in 100 - L di DMEM singolarmente per 30 min a temperatura ambiente, tremando a 200 rpm. NOTA: CD133 è un biomarcatore a cellule staminali tumorali generale altamente espresso nelle cellule HT29.</li>
	<li>Aggiungere 900 l di PBS e analizzare l'espressione LGR5 e CD133 utilizzando la citometria di flusso. Un cambiamento di fluorescenza nel canale FL2-H indica l'espressione genica.</li>
</ol>2. Isolamento dell'RNA
NOTA: Utilizzare un kit commerciale (vedere Tabella dei materiali) con una colonna rapida per l'isolamento dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore.
<ol><li>Aggiungere 50 l di PBS alle cellule raccolte (2 x 105 celle) e sospenderle con la pipettatura.</li>
	<li>Aggiungere 200 l di buffer di lisi contenente 2 - L di beta-mercaptoetanolo (z-ME). Vortice rapidamente e lasciare riposare per 5 min.</li>
	<li>Centrifugare la soluzione a 16.000 x g per 10 min. Raccogliere il supernatante e mescolare con 200 l undi 70% di etanolo.</li>
	<li>Utilizzare la colonna allegata per rimuovere il solvente mediante centrifugazione a 14.000 x g per 1 min.</li>
	<li>Lavare utilizzando la soluzione di lavaggio 1 e 2 per rimuovere completamente i non-RNA con centrifugazione a 14.000 x g per 1 min.</li>
	<li>Centrifuga di nuovo a 14.000 x g per 2 min per rimuovere l'etanolo residuo.</li>
	<li>Aggiungete 50 l di acqua distillata, centrifugate a 14.000 x g per 1 min e raccogliete la soluzione.</li>
	<li>Misurare la concentrazione di RNA utilizzando OD260 con uno spettrofotometro. Concentrazione di RNA (G/mL) - (OD260) x (40 g di RNA/mL) e OD260/OD280 > 2. I campioni di RNA devono avere un numero di integrità dell'RNA (RIN) > 7.</li>
</ol>3. Profilazione degli RNA e analisi bioinformatica
NOTA: L'analisi degli RNAseq è stata eseguita commercialmente (vedi Tabella dei materiali)per studiare i geni differenziali nelle sfere tumorali derivate dall'HT29 rispetto alle cellule hT29 dei genitori.
<ol><li>Utilizzare servizi commerciali per fasi RNAseq, tra cui la costruzione della libreria, il controllo qualità della libreria e il sequenziamento del DNA.</li>
	<li>Il report dei dati deve contenere informazioni importanti, tra cui i conteggi di lettura, la modifica della piega log2 e il valore p. Selezionare i geni differenziali in base ai seguenti parametri: geni con un > 1 log2 fold change con conteggi di lettura >100 nel gruppo HT29 tumorsphere e gene <-1 log2 (conta piegatura con read count >100 nel gruppo genitoriale HT29). In questo caso, un valore p < 0.05 è stato considerato accettabile e i dati sono stati utilizzati(tabella 1). NOTA: Qui, un conteggio genico >100 è stato utilizzato come soglia per continuare lo studio di un particolare gene e convalidarne l'espressione.</li>
	<li>Utilizzare un software di analisi statistica (vedere Tabella dei materiali), per mostrare una mappa termica e identificare i geni sovraespressi >1 e i geni downregulated < 1 nella modifica della piega log2.</li>
	<li>Utilizzare il software R per disegnare il grafico vulcano con x: log2 modifica piega; y: -log10 (valore p) per mostrare i geni differenziali.<ol>
<li>Installare la libreria RInstall R library install.packages(libreria(calibrato))</li>
		<li>Leggere i dati in RStudio con il seguente programma: res <-read.csv("/Users/xxx.csv", intestazione: T) head(res) with(res, plot(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch-19, main,"HT29CSC vs HT29", xlim-c(-6,6), col'"#C0C0C0")) with(subset(res, pvalue<.05 & log2FoldChange>1), punti(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch with(subset(res, pvalue<.05 & log2FoldChange<(-1)), punti(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch-19, col "blue")) with(subset(res, pvalue>.05), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch-19, col'"#444444")) abline (h , 1,3, lty - 2) abline(v, 1, lty-2) abline(v) (-1), lty</li>
		<li>Eseguire la corsa per ottenere il grafico vulcano.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Selezione genica del conducente
<ol><li>Selezionare Input gene singolo in NetworkAnalyst.Select Single gene Input in NetworkAnalyst.</li>
	<li>Copiare e incollare i geni sovraespressi selezionati dalla Tabella 1 con "umano" specificato come organismo e ID tipo Simbolo Gene ufficiale. NOTA: In alternativa, utilizzare Ensembl Gene ID per copiare e incollare.</li>
	<li>Inserire i dati facendo clic su Carica e procedi per analizzarli utilizzando l'interazione proteina-proteina (PPI) in seguito al PPI genetico.</li>
	<li>Utilizzare il database dell'interactoma STRING con un punteggio di confidenza di 900 per mostrare i geni dei semi che collegano i geni caricati. I geni dei semi che si associano a più geni individuali sono stati selezionati come geni guida che possono essere coinvolti nel mantenimento della formazione di sfere tumorali derivate dall'HT29. NOTA: sono disponibili tre set di dati di interazione da utilizzare: IMEx, STRING e Rolland. STRING contiene prove sperimentali di maggiore sicurezza. Con un numero di geni caricati più bassi, IMEx può essere selezionato per prevedere e raccogliere i geni del conducente nelle reti interagentiche.</li>
	<li>Selezionare Procedi nella panoramica del mapping.</li>
	<li>Selezionare Bianco nell'Atlante sfondo e Forza nella manopola Layout.</li>
	<li>Selezionare PANTHER BP per analizzare il gruppo genico di upregulation. NOTA: Questo mostra che HSPA5 era responsabile dell'anti-apoptosi nelle tumori derivanti dall'HT29 in questo studio (Figura 3A). Per restringere il campo funzionale specifico, la classificazione KEGG, GO o PANTHER può essere utilizzata in alternativa per selezionare i geni del conducente specifici.</li>
</ol>

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<li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42(2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno informazioni finanziarie rilevanti.

In questo studio, le tumori del cancro coltivato sono state utilizzate come modello nell'analisi dei dati degli RNA con la bioinformatica disponibile. Per un modello di malattia, sono state utilizzate sfere tumorali derivate dall'HT29. Poiché le sfere tumorali hanno resistenza ai farmaci contro le terapie tumorali, il modello stabilito può essere utilizzato per studiare i meccanismi dettagliati della resistenza studiando le differenze nell'espressione genica. Inoltre, la tecnologia genomica che utilizza l'RNAseq con la b...

Il cancro colorettale (CRC) è una delle principali cause di morte con un'elevata prevalenza e mortalità in tutto il mondo1,2. A causa di mutazioni genetiche e amplificazioni, le cellule tumorali crescono senza controllo proliferativo, che contribuisce alla sopravvivenza cellulare3, anti-apoptosi4e stesità del cancro5,6,7. All'interno di un tessuto tumorale, l'eterogeneità tumorale permette alle cellule tumorali di adattarsi e sopravvivere durante i trattamenti terapeutici8. Le cellule staminali tumorali (CSC), con un più alto tasso di auto-rinnovamento e pluripotenza rispetto ai tipi di cancro differenziale, sono principalmente responsabili della recidiva tumorale9,10 e CRC metastatico11. I CSC presentano più resistenza ai farmaci12,13,14 e proprietà anti-apoptosi15,16, superstiggino così le chemioterapie tumorali.
Qui, al fine di studiare il potenziale meccanismo di stelo nelle cellule staminali CRC selezionate, è stato eseguito RNAseq per vagliare i geni espressi in modo differenziale negli sferoidi tumorali. Le cellule tumorali possono formare sferoidi (chiamati anche sfere tumorali) quando coltivati in condizioni di bassa aderenza e stimolati da fattori di crescita aggiunti al mezzo coltivato, tra cui EGF, bFGF, HGF, e IL6. Pertanto, abbiamo selezionato le cellule tumorali CRC HT29 che resistono alle chemioterapie con un aumento della STAT3 fosforolata quando trattate con oxaliplatin e irinotecon17. Inoltre, HT29 ha espresso marcatori di gambo più elevati quando coltivato nelle condizioni di coltura descritte. Il modello CSC derivato dall'HT29 esprimeva quantità più elevate di recettore G-proteina accoppiato a proteina 5 (LGR5)18,un marcatore specifico delle cellule staminali CRC19,20. Inoltre, CD133, considerato un biomarcatore generale per le cellule staminali tumorali, è anche altamente espresso nella linea cellulare HT2921. Lo scopo di questo protocollo è quello di scoprire gruppi di geni di guida nelle sfere tumorali simili a stelo del cancro stabilite basate su set di dati bioinformatici anziché studiare oncogeni individuali22. Esamina i potenziali meccanismi molecolari attraverso l'analisi degli RNAeq seguita da analisi bioinformatiche disponibili.
Il sequenziamento di nuova generazione è un metodo di sequenziamento del DNA ad alta produttività, facilmente reperibile e affidabile basato su un aiuto computazionale, utilizzato per vagliare in modo completo i geni del conducente per guidare le terapie tumorali23. La tecnologia viene utilizzata anche per rilevare l'espressione genica dalla trascrizione inversa di un campione di RNA isolato24. Tuttavia, durante lo screening con RNAseq, i geni più importanti da rivolgere con la terapia potrebbero non avere il differenziale di espressione più alto tra campioni sperimentali e di controllo. Pertanto, sono state sviluppate alcune bioinformatice per classificare e identificare i geni in base ai set di dati attuali come KEGG25, GO26,27o PANTHER28, tra cui Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 e NetworkAnalyst30. Questo protocollo mostra l'integrazione di RNAseq e NetworkAnalyst per scoprire rapidamente un gruppo di geni negli sferoidi selezionati derivati dall'HT29 rispetto alle cellule parentali HT29. L'applicazione di questo metodo ad altri modelli di malattia è anche suggerita per scoprire le differenze nei geni importanti.
Rispetto allo studio dell'espressione genica individuale, una tecnica ad alto throughput offre vantaggi per trovare facilmente potenziali geni del conducente per la medicina di precisione del tumore. Con set di dati utili come KEGG, GO o PANTHER, geni specifici possono essere identificati sulla base dei modelli di malattia, dei percorsi di segnalazione o di funzioni specifiche, e questo permette di concentrarsi rapidamente su geni specifici e importanti, risparmiando tempo e costi di ricerca. Un'applicazione simile viene utilizzata negli studi precedenti14,18,31. In particolare, un tumore è più complicato perché diversi tipi di tumori esprimono geni distintivi e percorsi per la sopravvivenza e la proliferazione. Pertanto, questo protocollo può raccogliere geni che distinguono diversi tipi di tumore in circostanze diverse. C'è il potenziale per trovare strategie efficaci contro i tumori comprendendo il meccanismo di un'espressione genica specifica.

<table><tbody><tr><td>iRiS Digital Cell Imaging System</td><td>Logos Biosystems, Inc</td><td>I10999</td><td>per l'osservazione della formazione delle tusfere Citometria a</td></tr><tr><td>flusso</td><td>BD biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>per la rilevazione di LGR5 e CD133 nelle sfere tumorali</td></tr><tr><td>anti-LGR5-PE</td><td>Biolegend</td><td>373803</td><td>Reagente di rilevamento LGR5</td></tr><tr><td>anti-CD133-PE</td><td>Biolegend</td><td>372803</td><td>Rilevamento di CD133 reagente</td></tr><tr><td>EGF</td><td>GenScript</td><td>Z00333</td><td>per coltura di tumore</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>GenScript</td><td>Z03116</td><td>per coltura di tumore</td></tr><tr><td>HGF</td><td>GenScript</td><td>Z03229</td><td>per coltura di tumore</td></tr><tr><td>IL6</td><td>GenScript</td><td>Z03034</td><td>per coltura di tumore Kit</td></tr> di <tr><td>estrazione dell'RNA PureLink</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>12183025 isolato RNA totale per l'analisi dell'RNAseq</td></tr><tr><td>Prestazioni dell'RNAseq</td><td>Biotools, Taiwan</td><td></td><td>L'analisi dell'RNAseq viene eseguita commercialmente da Biotools, Ttaiwan</td></tr><tr><td>NetworkAnalyst</td><td>Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada</td><td></td><td>http://www.networkanalyst.ca/</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td>un software di analisi statistica</td></tr></tbody></table>

scoperta dei geni del conducente nelle scansioni tumorali del cancro derivato dal cancro colorettale

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Le cellule staminali tumorali svolgono un ruolo vitale contro le terapie cliniche, contribuendo alla ricaduta del tumore. Ci sono molti oncogeni coinvolti nella tumorigenesi e l'avvio delle proprietà dello stelo del cancro. Poiché l'espressione genica nella formazione delle sfere tumorali derivate dal cancro colorettale non è chiara, ci vuole tempo per scoprire i meccanismi che lavorano su un gene alla volta. Questo studio dimostra un metodo per scoprire rapidamente i geni del conducente coinvolti nella sopravvivenza delle cellule staminali del cancro colorettale in vitro. Le cellule tumorali del coloretalizzatore HT29 che esprimono il LGR5 quando coltivate come sferoidi e accompagnano un aumento dei marcatori di stelo CD133 sono state selezionate e utilizzate in questo studio. Il protocollo presentato viene utilizzato per eseguire RNAaseq con bioinformatica disponibile per scoprire rapidamente i geni del pilota sovraespressi nella formazione di sfere tutolali di tipo stelo derivato dall'HT29. La metodologia è in grado di vagliare e scoprire rapidamente potenziali geni del conducente in altri modelli di malattia.

Per stabilire il modello per studiare il meccanismo nelle cellule staminali tumorali, le cellule del colon-retto HT29 sono state utilizzate per colture le sfere tumorali simili a stelo del cancro in vitro in una piastra a basso attaccamento contenente B27, EGF, bFGF, HGF e IL6. Le sfere tumorali &gt; 100 m di diametro si sono formate in 7 giorni (Figura 1A). Le sfere tumorali sono state provate in singole cellule e analizzate usando la citometria di flusso per rilevare l'espressione LGR5 e C...

Presentato qui è un protocollo per scoprire i geni del pilota sovraespressi che mantengono le cellule staminali tumorali stabilite derivate dalle cellule del colon-retto HT29. È stato eseguito RNAseq con bioinformatica disponibile per studiare e vagliare le reti di espressione genica per chiarire un potenziale meccanismo coinvolto nella sopravvivenza delle cellule tumorali mirate.

Scoperta dei geni del conducente nelle scansioni tumorali del cancro derivato dal cancro colorettale

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Il nostro protocollo utilizzava RNA-Seq e strumenti bioinformatici per scoprire rapidamente i geni driver sovraespressi che contribuiscono alla formazione di tumori colorettali simili a staminali. Questo protocollo viene utilizzato per migliorare le vie geniche e di segnale espresse in modo differenziato per studiare un meccanismo molecolare per la staminalità tumorale in un cancro colorettale selettivo. Il settimo giorno di coltura, utilizzare un microscopio invertito con un sistema di imaging cellulare digitale per osservare e misurare il diametro delle tumorisfere.Quando le tumorisfere raggiungono un diametro superiore a 100 micrometri, trattare la coltura con lo 0,25% di tripside. Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, neutralizzare la tripside con due volte il volume del mezzo di crescita e contare le cellule usando un emocitometro. Raccogliere le cellule per centrifugazione.E rimospendò il pellet a un cinque per 10 alle quattro cellule per 100 microlitri di media concentrazione. Aggiungere due microlitri dell'anticorpo primario di interesse per ogni tubo e incubare le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente e 200 giri al minuto. Al termine dell'incubazione, lavare ogni tubo con 900 microlitri di PBS e analizzare le cellule per l'espressione della proteina di interesse per citometria di flusso secondo protocolli standard.Per l'isolamento dell'RNA dopo la raccolta della tripsina, come appena dimostrato, rimescolare le cellule a due volte 10 alla quinta colonna per 50 microlitri di concentrazione di PBS e lyse ogni campione con 200 microlitri di tampone di lysis integrati con due microlitri di beta mercaptoetanolo per tubo. Dopo un breve vortice e un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente, raccogliere i lisati per centrifugazione e aggiungere 200 microlitri di 70% di etanolo a ciascun tubo. Trasferire i campioni in colonne rapide e rimuovere il solvente mediante centrifugazione.Lavare i campioni con 400 microlitri di soluzione di lavaggio uno e 600 microlitri di soluzione di lavaggio due per rimuovere completamente qualsiasi non RNA per centrifugazione, seguito da una centrifugazione aggiuntiva di due minuti nelle stesse condizioni di centrifugazione per rimuovere qualsiasi etanolo residuo. Quindi rimospendare i pellet in 50 microlitri di acqua distillata per tubo e centrifugare il campione per un minuto prima di raccogliere l'RNA contenente supernanti. Studiare l'espressione genica differenziale tra le cellule tumorali rispetto alle cellule tumorali parentali dopo l'analisi del sequenziamento dell'RNA.Selezionare i geni con un cambiamento da più di uno a meno una variazione di log2 volte con conteggi di lettura maggiori di 100 nella tumorsfera e nei gruppi parentali. E usa i comandi come indicato. Per ottenere un grafico vulcano dei dati per determinare l'espressione genica differenziale.Per la selezione del gene di azionamento nell'analista di rete, selezionare l'input di un singolo gene e copiare e incollare i geni sovraespressi selezionati con l'essere umano specificato come organismo e il simbolo genico ufficiale come tipo id. Fare clic su Carica e procedere. Per inserire e analizzare i dati utilizzando l'interazione proteina-proteina, a seguito dell'interazione proteina-proteina genetica, utilizzare il database interactome STRING con un punteggio di confidenza di 900 per mostrare i geni dei semi.Cross-linking dei geni caricati. I geni dei semi associati a più geni individuali possono essere selezionati come geni driver che possono essere coinvolti nel mantenimento della formazione della tumorsfera. Selezionate Procedi nella panoramica della mappatura bianca nella manopola Sfondo e Force Atlas nella manopola Layout.Quindi selezionare la coppia di basi PANTHER per analizzare il gruppo genico di upregulation. Le tumorisfere di diametro superiore a 100 micrometri si formano entro sette giorni dalla coltura. L'analisi citometrica del flusso rivela un aumento dell'espressione LGR5 e CD133 nelle tumorisfere derivate da HT29 rispetto alle cellule HT29 parentali.Dopo il sequenziamento dell'RNA, i geni con un cambiamento di 2 volte maggiore nella loro up o downregulation con un valore P inferiore a 0,05 come determinato dalla mappa termica possono essere tracciati per distinguere i geni significativi tra le tumorsfere derivate da HT29 e le cellule parentali HT29. In questo esperimento rappresentativo, l'analisi dei geni upregolati con una piega superiore a un log2 ha portato a 10 geni di semi, incrociando le reti geniche. L'analisi della coppia di basi PANTHER ha indicato che due geni erano associati alla regolazione negativa dell'apoptosi.Inoltre, i geni selezionati sono stati di conseguenza convalidati dalla PCR quantitativa confermando la loro maggiore espressione nelle tumorisfere derivate da HT29. La selezione genica differenziale è la fase più importante delle procedure. Ricordarsi di utilizzare una modifica di piegatura log2 maggiore di una con riconteggi maggiori di 100 come criteri.Utilizzando questo protocollo, i geni selezionati dalle tumorsfere derivate dal colon-retto possono essere abbattuti o sovraespressi per scoprire i loro potenziali ruoli nella formazione della tumorsfera.

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In questo articolo si descrive la preparazione di tessuti melanoma appena ottenuto in colture cellulari primarie, e come rimuovere le contaminazioni di eritrociti e fibroblasti dalle cellule tumorali. Infine, si descrive come...

Paziente coltura cellulare derivato e isolamento di CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativi staminali alle cellule tumorali di melanoma

I saggi delle sfere in vitro sono comunemente usati per identificare le cellule staminali tumorali. Qui confrontiamo saggi basati su sfere singole con più cellule. I saggi più laboriosi basati su singole cellule o l'integrazione di metilcellulosa forniscono risultati più accurati, mentre i saggi basati su più cellule eseguiti in mezzo liquido possono essere fortemente influenzati dalla densità cellulare.

La valutazione delle proprietà sulle cellule staminali in cellule di carcinoma ovarico umano Utilizzo multi e single cell-based Spheres Assays

Comprendere il ruolo delle cellule staminali tumorali nella recidiva del tumore e nella resistenza alle terapie è diventato un argomento di grande interesse nell'ultimo decennio. Questo articolo descrive l'isolamento e la caratterizzazione della sottopopolazione di cellule staminali tumorali da linee cellulari di carcinoma squamoso della testa e del collo (HNSCC).

Isolamento e caratterizzazione di un testa e del collo a cellule squamose Carcinoma sottopopolazione Avere Stem Cell Caratteristiche

Utilizzando i tumori derivati ​​da pazienti in un modello preclinico per via sottocutanea è un ottimo modo per studiare l'efficacia di nuove terapie, scoperta di biomarcatori predittivi, e percorsi resistenti ai farmaci. Questo modello, nel processo di sviluppo di un farmaco, è essenziale nel determinare il destino di molte nuove terapie anti-cancro prima indagine clinica.

Sviluppo e manutenzione di un tumore del paziente preclinici Derivato dello xenotrapianto modello per il Controllo delle Novel Anti-Cancer Therapies

Descriviamo la creazione di tumori colorettali ortotopici attraverso l'iniezione di cellule tumorali o organoidi nel cecum dei topi e il successivo isolamento di cellule tumorali circolanti (CTC) da questo modello.

Isolamento delle cellule tumorali circolanti in un modello di topo ortotopico del tumore del colon-retto

Viene presentato un protocollo per la creazione di un modello di topi geneticamente modificato del cancro del colon-retto mediante infezione adenocarica segmentale e la sua sorveglianza mediante colonscopia ad alta risoluzione.

Un modello di mouse geneticamente modificato del cancro colorettale sporadico

Descriviamo un protocollo dettagliato per l'isolamento delle cellule che hanno invitato il tumore dalle cellule tumorali che hanno avuto l'ecosmia torace dal paziente xenografti derivati dal paziente mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, usando l'antigene leucocito umano-1 (HLA-1) come marcatore negativo, e per l'ulteriore convalida e caratterizzazione di queste cellule tumorali hLA-1-negative.

Isolamento e caratterizzazione delle cellule che invitano il tumore dalle cellule che hanno invitato il tumore da Sarcoma Xenotrapianto derivato dal paziente

Per consentire la rivelazione altamente sensibile del cancro colorettale umano diffondere cellule (CRC), colonizzando tessuti, mostriamo qui un protocollo per la trasduzione efficiente delle particelle lentivirali proteina fluorescente verde (GFP) in cellule di organoid PDX-derivato CRC prima del loro iniezione nel destinatari topi, con osservazione al microscopio stereo-fluorescenza.

Rilevamento ad alta sensibilità dei Micrometastases generati da GFP trasdotte Lentivirus Organoids coltivate da un tumore del Colon paziente-derivato

Lo scopo di questa metodologia è quello di identificare le cellule staminali tumorali (CSC) nelle linee cellulari del cancro e nei campioni tumorali umani primari con il protocollo di formazione della sfera, in modo robusto, utilizzando saggi funzionali e caratterizzazione fenotipica con citometria di flusso e occidentale Macchia.

Ottenere le sfere delle cellule staminali tumorali da tumori ginecologici e tumori del cancro

In questo protocollo, presentiamo un progetto sperimentale utilizzando un sistema di knockdown condizionale e un saggio di formazione della sfera adattato per studiare l'effetto della clusterina sullo stelo dei GCSC derivati dal paziente. Il protocollo può essere facilmente adattato per studiare sia in vitro che in vivo la funzione dei geni associati alla derivazione in diversi tipi di CSC.

Knockdown condizionale combinato e formazione di sfere adattate Per studiare un gene associato alla staminalizza delle cellule staminali del cancro gastrico derivato dal paziente

Questo protocollo presenta un nuovo sistema di coltura robusto e riproducibile per generare e far crescere sferoidi tridimensionali dalle cellule adenocarcinoma del colon Caco2. I risultati forniscono la prima prova di concetto per l'appropriatezza di questo approccio allo studio della biologia delle cellule staminali tumorali, compresa la risposta alla chemioterapia.

Un modello tridimensionale di sferoidi per studiare le cellule staminali del cancro del colon

Scopri l'identificazione dei geni driver sovraespressi nelle cellule staminali tumorali del cancro colorettale utilizzando RNA-Seq e strumenti bioinformatici. Questo metodo computazionale rivela meccanismi molecolari chiave per terapie mirate.

Scoperta dei geni del conducente nelle scansioni tumorali del cancro derivato dal cancro colorettale

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