Modello alveolare umano multicellulare composto da cellule epiteliali e cellule immunitarie primarie per la valutazione del pericolo

Questi singoli modelli audio umani utilizzano cellule immunitarie rilevanti come potente strumento per prevedere la risposta immunitaria acuta di sostanze tra cui nanomateriali e farmaci per la conoscenza. Questi medici combinano cellule epiteliali umane e cellule immunitarie primarie umane per valutare tali reazioni specifiche. L'uso di monociti freschi e congelati offre flessibilità per il piano di esperimento.

Numerosi studi hanno dimostrato che questo modello può fornire una visione della comunicazione interstellare tra senso del comportamento e senso immunitario. Poiché questa dimostrazione include tutti i dettagli importanti per studiare il modello come tratto personale nella coltura cellulare, istruzioni visive per replicare gli esperimenti. Diversi passaggi del protocollo della vescica sono complessi e richiedono una manipolazione speciale.

Pertanto vengono dimostrati con tutti i dettagli richiesti che possono essere facilmente seguiti. Per l'isolamento dei monociti di sangue periferico dai cappotti Buffy umani, dividere il contenuto del sacchetto del mantello Buffy raccolto, uniformemente tra 250 tubi conici milliliter. Portare con cura il volume totale in ogni tubo 250 millilitri con PBS e mescolare i tubi con tre dolci inversioni.

Quindi dividere equamente la soluzione PBS del mantello Buffy tra quattro nuovi tubi da 50 millilitri, quindi aggiungere 10 microlitri di perline magnetiche positive CD 14 alla settima celle totali al tubo e mescolare bene con la pipettazione. Al momento del riempimento, staccare la pipetta dalla pipetta e collegare immediatamente l'apertura superiore della pipetta con un pollice, quindi posizionare la pipetta riempita nella parte inferiore di un tubo e scollegare l'apertura della pipetta per consentire al mezzo gradiente di densità di fluire lentamente sotto la miscela PBS del mantello buffy, fino a quando un millilitro del mezzo gradiente di densità viene lasciato all'interno della pipetta. Quando il mezzo gradiente di densità è stato aggiunto a ciascun tubo allo stesso modo, separare le cellule per centrifugazione gradiente di densità e utilizzare una pipetta sierologica per raccogliere lo strato bianco di cellule mononucleari del sangue periferico spesso da due a tre millimetri tra il plasma e gli strati medi gradienti di densità.

Il modo migliore per collegare il livello è rimuovere prima il plasma e quindi sopprimere le nostre pipette logiche per raccogliere le cellule. Estrarre le cellule mononucleari del sangue periferico da ogni insieme di due tubi in un nuovo tubo da 50 millilitri e lavare le cellule due volte con un volume totale di 50 millilitri di PBS fresco per lavaggio. Quindi scartare il supernatante e rimescolare la pipetta in ciascuno in cinque millilitri di PBS fresco e mettere in comune le sospensioni cellulari in un unico tubo per il conteggio.

Dopo il conteggio, centrifugare di nuovo le cellule e rimospendare la pelette a 80 millilitri di tampone di separazione magnetica per assistere alla settima parte. Quindi aggiungere 10 microlitri di perline magnetiche positive CD 14 per frequentare la settima parte totale delle celle al tubo e mescolare bene con la pipettazione. Dopo un'incubazione di 15 minuti a quattro gradi Celsius sciacquare una colonna magnetica con tre millilitri di tampone di separazione magnetica e aggiungere le cellule alla colonna.

Lavare la colonna tre volte con tre volumi millilitri di tampone per lavaggio e trasferire la colonna in un tubo da 15 millilitri contenente un millilitro di tampone di separazione magnetica fresco. Quindi utilizzare lo stantuffo e cinque millilitri di tampone per scaricare le celle positive CD 14 nel tubo. Indurre la differenziazione delle cellule positive isolate del CD 14 perline magnetiche.

In primo luogo, rimorsi le cellule in una sola volta occuparsi delle sei cellule per concentrazione di millilitro nel mezzo di coltura cellulare. O differenziazione MDDC, aggiungere 10 nanogrammi per millilitro di e del fattore stimolante della colonia di macrofagi del sito di granula al tubo e aggiungere tre millilitri di cellule a ciascun pozzo di una piastra di coltura cellulare di sei pozzi, o differenziazione MDM aggiungere 10 nanogrammi per millilitro di fattore stimolante della colonia di macrofagi alle cellule e placcare le cellule come appena dimostrato. Per impostare un modello di co-coltura del tessuto epiteliale epiteliale alveolare umano, prima trasferire 1,5 millilitri di mezzo di coltura cellulare pre-caldo nel numero appropriato di pozzi di una piastra di 12 pozzi e posizionare un inserto di coltura cellulare in ogni pozzo.

Successivamente aggiungere 500 microlitri di sospensione cellulare epiteliale ad una densità di cinque volte 10 alla quinta cella per millilitro nel lato apicale di ogni inserto e coprire la piastra per un'incubazione di quattro giorni nell'incubatore di coltura cellulare. Oppure la semina MDDC sostituisce il supernatante dai pozzi di sei piastre di pozzo utilizzate per la differenziazione MDDC, con un millilitro di mezzo di coltura cellulare caldo fresco e utilizzare un raschietto cellulare per staccare le cellule di aderenza da ogni pozzo. Lavare ogni bene tre volte con il supernato e in ogni pozzo e unire tutte le soluzioni cellulari in un unico tubo di centrifuga.

L'MDDC raccolto per centrifugazione e pinzette sterili per posizionare gli inserti dalle 12 piastre del pozzo capovolte in una piastra di Petri sterile. Raschiare qualsiasi cellula epiteliale dal lato basale dell'inserto e risosopendire gli MDC nel mezzo di coltura cellulare fresco fare una concentrazione di 4,2 per 10 di queste cellule per millilitro. Quindi aggiungere 150 microlitri di celle su ogni inserto in modo che l'intera superficie basale dell'inserto sia ugualmente coperta con il liquido senza bolle.

Per la semina MDDM dopo aver raccolto gli MDDM differenziati come dimostrato per gli MDDC, diluire le cellule a 2,5 per 10 alle quattro cellule per millilitro di concentrazione media di coltura cellulare fresca e aggiungere 500 microlitri di cellule lungo la parete di ogni cellula epiteliale e MDDC contenente inserto di coltura cellulare, quindi posizionare il coperchio sulla piastra e posizionare la piastra in un incubatore di coltura cellulare per 24 ore. Il giorno dopo aspira il supernatante sia dalle aree apicali che basali di ogni inserto di coltura cellulare e pozzi. Quindi sterilizzi le pinzette per sollevare gli inserti dai pozzi e aggiungere 600 microlitri di prevendite fresco al mezzo di coltura cellulare ad ogni pozzo.

Dopo sei giorni di differenziazione, gli MMM appaiono di forma rotonda mentre gli MDDC formano cluster fatti di celle con una forma più allungata e sporgenze osservabili. Dopo tre giorni di crescita su inserti di membrana, le cellule epiteliali formano un denso Un aumento significativo del rilascio di lattato deidrogenasi si osserva nel mezzo di coltura cellulare del compartimento basale dopo l'esposizione a un controllo positivo per la rottura della membrana, dimostrando la reattività del modello a una sostanza citotossica. Nessun aumento del rilascio di lattato deidrogenasi misurato sulla stimolazione apicale con TNF alfa o LPS.

Aumenti statisticamente significativi nel rilascio di IL6 e IL8 si osservano sia nei campioni trattati con alfa LPS che in quello TNF rispetto alle cellule non trattate di controllo. Non si osservano differenze nella morfologia cellulare tra i modelli di co-coltura che utilizzano MDDM e MDDC da monociti di sangue periferici freschi rispetto a quelli che utilizzano cellule scongelate in co-coltura esposta alfa LPS e TNF, è stato osservato uno strato epiteliale interrotto. È possibile utilizzare altri tipi di cellule umane come le vie aeree o le cellule bronchiolari, possono essere analizzati anche altri punti finali.

Principalmente i ricercatori sono stati ispirati da questa tecnica usando un simile per impostare ma con diversi tipi di cellule.