Modello di cardiomiociti ischemici e confronto video-based della contrazione cardiomiocite utilizzando cardiomiociti derivati da hiPSC
5 maggio 2020
Presentiamo un modello di cardiopatia ischemica utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo, insieme a un metodo per la valutazione quantitativa dei danni ai tessuti causati dall'ischemia. Questo modello può fornire una piattaforma utile per lo screening farmacologico e ulteriori ricerche sulle cardiopatie ischemiche.
La ricerca sulle malattie cardiache viene spesso eseguita in piccoli e mammiferi come i roditori. Tuttavia, la fisiologia del cuore umano differisce significativamente da quella del cuore del roditore. Il nostro protocollo utilizza cardiomiociti differenziati dalle cellule iPS umane per modellare le malattie cardiache ischemiche e quantificare i danni e la compromissione funzionale dei cardiomiociti ischemici.
Questo protocollo può fornire un metodo conveniente per lo screening personalizzato dei farmaci utilizzando cellule iPS derivate da singoli pazienti, l'adeguata gestione delle cellule iPS, come nell'uso di mezzi freschi, e cambiare il mezzo lentamente e puntualmente è fondamentale per garantire una differenziazione di successo in cardiomiociti funzionali. A dimostrare la procedura con Yun Liu, Yin Liang e Mengxue Wang sarà Chen Wang, dottorando di un laboratorio. Per indurre la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo in cellule cardiache, rivestire prima i pozzi di una piastra di coltura di 96 pozzi con 100 microlitri di 1.675 microgrammi per millilitro di laminina in PBS.
Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius, vedere tre volte 10 alla quarta cellula staminale in 200 microlitri di mezzo di manutenzione IPS integrati con 10 micromolari Y27632 in ogni pozzo e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare. Dopo 24 ore, sostituire i super mezzi con 200 microlitri di mezzo di crescita IPS per pozzo e restituire la piastra all'incubatore di coltura cellulare per altri due o tre giorni. Quando le celle raggiungono la confluenza dal 70 all'80%.
Sostituire il mezzo in ogni pozzo con 200 microlitri di mezzo di differenziazione preri riscaldato A e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare per altre 48 ore. Al termine dell'incubazione ha lentamente sostituito il supernatante in ogni pozzo con 200 microlitri di mezzo di differenziazione prerivolto B e ha restituito la piastra all'incubatore di colture cellulari. Dopo due giorni, sostituire i supernaganti con 200 microlitri di mezzo di manutenzione cardiomiocitare preri riscaldato per pozzo e restituire la piastra all'incubatore di coltura cellulare per un massimo di 30 giorni.
Per valutare la contrattilità dei cardiomiociti, installare l'immagine di particelle velocimetria immagine j plugin e utilizzare un microscopio a contrasto di fase e l'obiettivo forche per registrare immagini video delle cellule a circa 20 fotogrammi al secondo per circa 10 secondi. Quindi salva il file video come analizzato la nostra API e crea una struttura di cartelle come indicato. Per analizzare campi vettoriali bidimensionali discreti di spostamento cellulare, avviare VG e selezionare plugin, macro e modificare per aprire l'analisi vettoriale.
ijm, quindi fare clic su esegui l'analisi verrà eseguita automaticamente. Per il trattamento ischemico, sostituire il supernatante in ogni pozzo con 200 microlitri di dmem senza glucosio e siero, quindi posizionare la piastra in una camera ipossia, quindi infondere gas azoto nella camera, mantenendo la concentrazione interna di ossigeno al 2% e la concentrazione di anidride carbonica al 5% per 24 ore. Differenziando con successo le cellule, dimostra una contrazione spontanea osservata al microscopio con il 50% dei pozzi di coltura che in genere mostrano una contrazione spontanea in meno di 20 giorni.
La proteina marcatore cardiaco può anche essere usata per confermare una differenziazione di successo Le cellule del gruppo ischemico mostrano tipicamente una minore vitalità nei test MTT e una contralità inferiore rispetto a quelle del gruppo di controllo normossico. Il rapporto tra cellule positive propidio ioduro è anche più alto nel gruppo ischemico, che nel gruppo di controllo, indicando una maggiore incidenza di danni cellulari. È importante individuare con precisione le regioni di interesse nella piastra di cattura per consentire il confronto della contrattilità dei cardiomiociti.
Questa tecnica può essere utilizzata per lo screening farmacologico, utilizzando cellule iPS derivate dal paziente. Fornisce inoltre una piattaforma unica per chiarire ulteriormente i meccanismi alla base delle malattie cardiache ischemiche
Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo per la modellizzazione della malattia cardiaca ischemica mediante cardiomiociti differenziati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPS-CMs). Il metodo consente la quantificazione del danno cellulare e del deficit funzionale in condizioni ischemiche, fornendo una piattaforma clinicamente rilevante per la ricerca sulla malattia cardiaca e per lo screening personalizzato di farmaci.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Ricerca cardiovascolare
- Biologia delle cellule staminali
- Fisiologia cellulare
Sfondo
- La malattia cardiaca ischemica è una delle principali cause di mortalità a livello mondiale.
- I modelli rodentici sono comunemente utilizzati ma differiscono in modo significativo dalla fisiologia cardiaca umana.
- I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane offrono un modello più pertinente per lo studio delle malattie cardiache umane.
- Esiste la necessità di piattaforme che facilitino sia la modellizzazione delle malattie sia lo screening farmacologico in un contesto umano.
Scopo dello studio
- Stabilire un protocollo per la differenziazione di cellule iPS umane in cardiomiociti.
- Modellare in vitro la malattia cardiaca ischemica utilizzando cardiomiociti derivati da cellule iPS umane (hiPS-CMs).
- Quantificare i danni cellulari e il deterioramento funzionale in condizioni ischemiche.
Metodi Utilizzati
- Differenziamento di cellule iPS umane in cardiomiociti mediante l'uso sequenziale di mezzi di coltura e piastre rivestite con laminina.
- Induzione di ischemia esponendo i cardiomiociti derivati da cellule iPS umane a un'atmosfera con il 2% di ossigeno e a un mezzo privo di glucosio e siero per 24 ore in una camera ipossica.
- Valutazione della vitalità cellulare mediante saggio MTT e colorazione con ioduro di propidio.
- Misurazione della contrattilità tramite analisi del campo vettoriale di spostamento mediante microscopia a contrasto di fase e software di velocimetria basata sull'immagine delle particelle.
Risultati principali
- Le condizioni ischemiche hanno aumentato la percentuale di cellule danneggiate, come indicato da una maggiore colorazione con ioduro di propidio.
- La vitalità cellulare è diminuita nel gruppo ischemico rispetto ai controlli.
- La contrattilità dei miocardiociti derivati da hiPS era ridotta in condizioni ischemiche.
- Circa il 50% delle pozzette di coltura ha mostrato contrazione spontanea entro 20 giorni dalla differenziazione.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un modello robusto in vitro per la malattia cardiaca ischemica utilizzando cardiomiociti di origine umana.
- Questo sistema consente la quantificazione sia del danno cellulare sia del deficit funzionale.
- Il modello è adatto per lo screening personalizzato di farmaci e ulteriori studi meccanicistici sulla malattia cardiaca ischemica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I modelli di cardiomiociti derivati da iPSC umane colmano il divario traduttivo tra gli studi su roditori e le malattie cardiache umane, consentendo una scoperta più predittiva nelle fasi iniziali della malattia cardiaca ischemica. L'analisi quantitativa della contrattilità basata su video e i saggi di vitalità forniscono dati utili per la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico. Questa piattaforma supporta decisioni di portafoglio corrette in base al rischio e strategie di screening personalizzato dei farmaci nella ricerca e sviluppo cardiovascolare.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dei meccanismi del danno ischemico in un sistema rilevante per l'uomo.
- Consente la validazione funzionale degli obiettivi attraverso letture quantitative della contrattilità e della vitalità.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico modellando le risposte cellulari rilevanti per la malattia.
- Migliora l'affidabilità predittiva per la selezione precoce del portafoglio nei programmi cardiovascolari.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce una piattaforma standardizzata di cardiomiociti derivati da iPSC umane per la valutazione riproducibile di composti.
- Fornisce metriche quantitative della contrattilità mediante analisi del campo vettoriale di spostamento.
- Consente schermature scalabili basate su video per rilevare alterazioni funzionali in condizioni ischemiche.
- Supporta la prontezza del saggio per successivi screening farmacologici e studi meccanicistici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i risultati ottenuti in vitro alla biologia delle malattie umane, garantendo una continuità traslazionale.
- Consente l'uso di cellule derivate da pazienti per la caratterizzazione personalizzata della risposta ai farmaci.
- Riduce la dipendenza da modelli non umani, aumentando la rilevanza delle malattie nei dati preclinici.
- Supporta la scoperta e la validazione di biomarcatori in un contesto clinicamente rilevante.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello di ischemia basato su cardiomiociti derivati da iPSC umane collega la fase iniziale della scoperta, l'identificazione dei composti promettenti e la ricerca traslazionale fornendo endpoint funzionali e di vitalità specifici per l'uomo.
- Biologia della scoperta: Quantifica il danno ischemico e la disfunzione contrattile per la verifica di ipotesi e l'analisi dei percorsi molecolari.
- Screening: Offre parametri quantitativi riproducibili di contrattilità e vitalità per la selezione di composti.
- Analisi: Integra l'analisi del movimento basata su video e saggi di vitalità per confronti statistici robusti.
- Ricerca traslazionale: Permette la modellizzazione personalizzata per paziente e supporta l'allineamento di biomarcatori con endpoint clinici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile e scalabile per la scoperta di farmaci cardiovascolari e studi meccanicistici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione delle target.
- Valore operativo: Standardizza i saggi funzionali e supporta flussi di lavoro scalabili e riproducibili.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione e migliora l'efficienza del capitale riducendo i rischi biologici nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e la progressione di asset cardiovascolari corretta rispetto al rischio.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella coltura di iPSC umane, nella differenziazione e nella validazione dei marcatori cardiaci.
- Necessita dell'accesso a camere ipossiche, microscopia a contrasto di fase e software per l'analisi video.
- Richiede una standardizzazione tra team per garantire la riproducibilità del saggio e la confrontabilità dei dati.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse linee di iPSC derivate da pazienti o sottotipi di malattia.
- La selezione accurata della regione di interesse è fondamentale per un confronto preciso della contrattilità.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:05
Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC) Cardiac Differentiation Induction
2:30
Induced Pluripotent Stem Cell-Cardiomyocyte (iPS-CM) Contractility Assessment
3:15
Ischemia Exposure
3:42
Results: Representative Cardiac Cell Differentiation
4:27
Conclusion
