Metodo ad alta velocità effettiva per la misurazione del tempo di sedazione alcolica del melanogaster di Drosophila individuale
April 20th, 2020
Gli attuali metodi per misurare la sensibilità all'alcol nella Drosophila sono progettati per testare gruppi di mosche. Vi presentiamo un semplice, a basso costo, ad alto costo di analisi per valutare la sensibilità di sedazione di alcol in un gran numero di mosche singole. Il metodo non richiede strumenti specializzati e può essere eseguito in qualsiasi laboratorio utilizzando materiali comuni.
Drosophila fornisce un modello eccellente per studiare le basi genetiche della sensibilità all'alcol perché è possibile quantificare la sensibilità all'alcol proprio in contesti genetici controllati e condizioni ambientali. Metodi attuali per misurare la sensibilità all'alcol nei gruppi di mosche di prova drosophila. Presentiamo un metodo semplice, a basso costo e ad alta produttività per valutare la sensibilità all'alcol in un gran numero di mosche singole.
La variazione della sensibilità all'alcol nella Drosophila può essere tradotta in fenotipi simili nell'uomo perché le mosche condividono circa il 75% dei loro geni con ortologi umani. Il saggio che abbiamo sviluppato può anche essere applicato per misurare gli effetti della tossicità acuta dei volatili su altri insetti, comprese altre specie di mosca o vettori di malattie. Inizia creando un modello di cartone di un piatto di coltura cellulare da 24 po '.
Traccia intorno al piatto e ritaglia l'area designata. Quindi usa il modello di cartone per creare un pezzo di piccola rete di zanzare per insetti delle dimensioni del piatto. Posizionare una piccola linea di colla a caldo attorno al perimetro di una piastra di coltura da 24 porsi e apporre la rete dello schermo sopra i pozzi.
Quindi utilizzare la pistola per colla a caldo per fissare un bastone artigianale di legno su tre lati della piastra di coltura. Preparare il maggior numero possibile di piatti nella camera di riprese. Per creare la camera di riprese, tagliare un foro delle dimensioni dell'obiettivo della videocamera su un lato di una scatola di polistirolo e una fessura aggiuntiva sulle dimensioni del cuscinetto di illuminazione sul lato opposto.
Inserire il cuscinetto di illuminazione nella fessura e posizionare la fotocamera nel foro dell'obiettivo sopra il cuscinetto di illuminazione. Posizionare tutti i materiali di prova in un ambiente controllato, preferibilmente una camera comportamentale con circa il 30% di umidità, 25 gradi Celsius di temperatura, flusso d'aria uniforme e livelli di rumore inferiori a 65 decibel. Utilizzare il modello di cartone precedentemente realizzato per tagliare due pezzi di tela da formaggio.
Quindi pipettare un millilitro di etanolo al 100% attraverso la rete dello schermo in ogni pozzo. Asciugare la rete e posizionare i due pezzi di tela da formaggio sopra. Tagliare un piccolo pezzo di tagliere in plastica sottile, flessibile utilizzando il modello di cartone come guida per espandere l'area di uno o due centimetri su uno dei lati corti.
Dopo il taglio, assicurarsi che la plastica si adatti ancora tra i tre bastoncini di legno sull'apparato di prova, ma pende da un'estremità. Preparare un aspiratore secondo le indicazioni manoscritte e utilizzarlo per trasferire una mosca per pozzo in una piastra di coltura cellulare di 24 po ', coprendo tutti i pozzi con mosche aspirate in precedenza con la plastica flessibile. Registrare la posizione del pozzo e tutte le informazioni rilevanti sul genotipo o sul fenotipo di ogni mosca.
Tenere il filo di plastica flessibile con la parte superiore della piastra di coltura cellulare contenente le mosche e invertire la piastra sulla parte superiore della piastra di coltura cellulare modificata con l'etanolo. Utilizzare i bastoncini artigianali per allineare la piastra di coltura cellulare invertita, assicurandosi che ogni bene con etanolo si allinei con ogni pozzo contenente una mosca. Assicurarsi che il pad di illuminazione sia acceso a piena luminosità e iniziare a registrare con la videocamera.
Esporre le mosche all'etanolo rimuovendo con cura la plastica tra le due piastre, assicurandosi di non spodestiare la tela da formaggio. Quando si sospetta che tutte le mosche abbiano perso il controllo posturale, toccare saldamente al centro della piastra. Se c'è movimento, continua a registrare, toccando ogni uno o due minuti fino a quando non si verifica alcun movimento.
Terminare la registrazione una volta che non c'è movimento. Per recuperare le mosche, rimuovere la piastra superiore dall'apparato di prova e aspirare le singole mosche nei contenitori scelti. Sostituire l'etanolo nelle piastre di coltura cellulare modificate almeno una volta all'ora per mantenere un'esposizione costante all'etanolo durante tutto il saggio e ripetere l'esperimento per tutti i campioni desiderati.
Guarda la registrazione video per determinare il tempo di sedazione della mosca, che è definito come il momento in cui una mosca perde il controllo posturale e l'abilità locomotoria. Per garantire la precisione, guardare il film in retromarcia e registrare l'ora in cui la mosca inizia a muoversi. Questo metodo può essere utilizzato per generare dati su un gran numero di mosche entro 10 minuti.
Due piastre da 24 potte sono state utilizzate per misurare simultaneamente i tempi di sedazione dell'etanolo per 48 mosche individuali di due linee DGRP con sensibilità diverse all'alcol. Le grandi dimensioni del campione aumentano la precisione e riducono l'errore alle variazioni ambientali. RAL_555 mosche erano meno sensibili delle mosche RAL-177.
Maschi e femmine di RAL_177 non mostravano effetti sessualmente dimorfici, mentre le femmine di linea RAL_555 erano meno sensibili all'esposizione all'etanolo rispetto ai maschi. Quando si tenta questo protocollo, è fondamentale eseguire l'aspirazione delle mosche e l'inversione della piastra di coltura cellulare con precisione per ottenere il risultato desiderato. Poiché la capacità di valutare singole mosche evita effetti confondenti dovuti alle interazioni di gruppo, questo saggio migliora l'utilità del modello Drosophila per studi ad alta produttività sugli effetti acuti dell'esposizione all'alcol.
Panoramica
Questo studio presenta un saggio ad alto rendimento semplice ed economico per valutare la sensibilità alla sedazione da alcol nei singoli moscerini Drosophila. Il metodo permette una quantificazione precisa della sensibilità all'alcol in condizioni controllate, migliorando l'utilità di Drosophila come modello per studiare i fattori genetici legati alla sensibilità all'alcol.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Biologia comportamentale
- Genetica
Sfondo
- Drosophila è un prezioso organismo modello per studiare la sensibilità all'alcol grazie alle sue somiglianze genetiche con gli esseri umani.
- I metodi attuali tipicamente valutano gruppi di mosche, che possono oscurare le variazioni individuali.
- Il nuovo saggio permette la valutazione di singole mosche, riducendo gli effetti confondenti dalle interazioni di gruppo.
- Comprendere la sensibilità all'alcol in Drosophila può fornire informazioni su fenotipi simili negli esseri umani.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo ad alto rendimento per misurare la sensibilità alla sedazione da alcol nei singoli Drosophila.
- Facilitare grandi campioni di studio per una maggiore precisione nei risultati.
- Esplorare la base genetica della sensibilità all'alcol utilizzando diverse linee di Drosophila.
Metodi utilizzati
- Creazione di un modello in cartone per una piastra di coltura a 24 pozzetti.
- Uso di una rete per insetti e colla a caldo per preparare il setup del saggio.
- Condizioni ambientali controllate per i test, inclusi umidità e temperatura.
- Registrazione del comportamento delle mosche in risposta all'esposizione all'etanolo per determinare i tempi di sedazione.
Risultati principali
- Il saggio ha misurato con successo i tempi di sedazione da etanolo per 48 mosche individuali di due diverse linee DGRP.
- Le mosche RAL_555 hanno mostrato una minore sensibilità all'etanolo rispetto alle mosche RAL-177.
- Nessuno effetti dimorfici sessuali sono stati osservati in RAL_177, mentre le femmine RAL_555 erano meno sensibili dei maschi.
- Il metodo permette una rapida raccolta dati su un gran numero di mosche.
Conclusioni
- Questo saggio migliora la capacità di studiare la sensibilità all'alcol in Drosophila ad alto rendimento.
- Fornisce un mezzo affidabile per valutare le variazioni individuali nella sensibilità all'alcol.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dei fattori genetici che influenzano la sensibilità all'alcol.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
High-throughput quantification of alcohol sedation in individual Drosophila melanogaster enables precise genetic dissection of alcohol sensitivity under rigorously controlled conditions. This scalable assay supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for neurobehavioral phenotypes relevant to human alcohol response. The method's throughput and reproducibility position it as a foundational tool for portfolio triage and hypothesis-driven discovery in neurogenetics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of genetic determinants underlying alcohol sensitivity in a controlled model system.
- Supports functional target validation by isolating genotype-phenotype relationships at the individual level.
- Facilitates predictive confidence in translational research by modeling conserved behavioral responses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, reproducible behavioral assays for downstream compound screening or genetic perturbation studies.
- Standardizes quantitative measurement of sedation time, supporting robust assay reproducibility.
- Enables scalable, high-throughput data collection for reliable phenotype evaluation across large cohorts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant behavioral endpoints for translational biomarker exploration.
- Provides continuity from genetic discovery to preclinical validation of neuroactive compounds or interventions.
- Reduces mechanistic ambiguity by isolating individual-level responses, supporting risk-adjusted advancement.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the early discovery-to-lead identification continuum, enabling hypothesis testing and mechanistic de-risking prior to preclinical model selection.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification for alcohol sensitivity genes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative sedation time outputs for assay readiness and scalability.
- Analytics: Provides precise, video-based measurements for statistical comparison of genotypes and conditions.
- Translational Research: Bridges genetic findings to behavioral phenotypes relevant for preclinical exploration.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for volatile compound testing across insect models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces biological ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible behavioral phenotyping.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and efficient resource allocation in early discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of genetic targets and phenotypic endpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in behavioral genetics and video-based phenotyping.
- Needs controlled environmental chambers and video recording infrastructure.
- Demands cross-team standardization for data collection and analysis protocols.
- Adaptable to other insect models and volatile exposures with protocol modifications.
- Precision in fly handling and plate alignment is critical for assay reliability.
