Metodo ad alta velocità effettiva per la misurazione del tempo di sedazione alcolica del melanogaster di Drosophila individuale

Drosophila fornisce un modello eccellente per studiare le basi genetiche della sensibilità all'alcol perché è possibile quantificare la sensibilità all'alcol proprio in contesti genetici controllati e condizioni ambientali. Metodi attuali per misurare la sensibilità all'alcol nei gruppi di mosche di prova drosophila. Presentiamo un metodo semplice, a basso costo e ad alta produttività per valutare la sensibilità all'alcol in un gran numero di mosche singole.

La variazione della sensibilità all'alcol nella Drosophila può essere tradotta in fenotipi simili nell'uomo perché le mosche condividono circa il 75% dei loro geni con ortologi umani. Il saggio che abbiamo sviluppato può anche essere applicato per misurare gli effetti della tossicità acuta dei volatili su altri insetti, comprese altre specie di mosca o vettori di malattie. Inizia creando un modello di cartone di un piatto di coltura cellulare da 24 po '.

Traccia intorno al piatto e ritaglia l'area designata. Quindi usa il modello di cartone per creare un pezzo di piccola rete di zanzare per insetti delle dimensioni del piatto. Posizionare una piccola linea di colla a caldo attorno al perimetro di una piastra di coltura da 24 porsi e apporre la rete dello schermo sopra i pozzi.

Quindi utilizzare la pistola per colla a caldo per fissare un bastone artigianale di legno su tre lati della piastra di coltura. Preparare il maggior numero possibile di piatti nella camera di riprese. Per creare la camera di riprese, tagliare un foro delle dimensioni dell'obiettivo della videocamera su un lato di una scatola di polistirolo e una fessura aggiuntiva sulle dimensioni del cuscinetto di illuminazione sul lato opposto.

Inserire il cuscinetto di illuminazione nella fessura e posizionare la fotocamera nel foro dell'obiettivo sopra il cuscinetto di illuminazione. Posizionare tutti i materiali di prova in un ambiente controllato, preferibilmente una camera comportamentale con circa il 30% di umidità, 25 gradi Celsius di temperatura, flusso d'aria uniforme e livelli di rumore inferiori a 65 decibel. Utilizzare il modello di cartone precedentemente realizzato per tagliare due pezzi di tela da formaggio.

Quindi pipettare un millilitro di etanolo al 100% attraverso la rete dello schermo in ogni pozzo. Asciugare la rete e posizionare i due pezzi di tela da formaggio sopra. Tagliare un piccolo pezzo di tagliere in plastica sottile, flessibile utilizzando il modello di cartone come guida per espandere l'area di uno o due centimetri su uno dei lati corti.

Dopo il taglio, assicurarsi che la plastica si adatti ancora tra i tre bastoncini di legno sull'apparato di prova, ma pende da un'estremità. Preparare un aspiratore secondo le indicazioni manoscritte e utilizzarlo per trasferire una mosca per pozzo in una piastra di coltura cellulare di 24 po ', coprendo tutti i pozzi con mosche aspirate in precedenza con la plastica flessibile. Registrare la posizione del pozzo e tutte le informazioni rilevanti sul genotipo o sul fenotipo di ogni mosca.

Tenere il filo di plastica flessibile con la parte superiore della piastra di coltura cellulare contenente le mosche e invertire la piastra sulla parte superiore della piastra di coltura cellulare modificata con l'etanolo. Utilizzare i bastoncini artigianali per allineare la piastra di coltura cellulare invertita, assicurandosi che ogni bene con etanolo si allinei con ogni pozzo contenente una mosca. Assicurarsi che il pad di illuminazione sia acceso a piena luminosità e iniziare a registrare con la videocamera.

Esporre le mosche all'etanolo rimuovendo con cura la plastica tra le due piastre, assicurandosi di non spodestiare la tela da formaggio. Quando si sospetta che tutte le mosche abbiano perso il controllo posturale, toccare saldamente al centro della piastra. Se c'è movimento, continua a registrare, toccando ogni uno o due minuti fino a quando non si verifica alcun movimento.

Terminare la registrazione una volta che non c'è movimento. Per recuperare le mosche, rimuovere la piastra superiore dall'apparato di prova e aspirare le singole mosche nei contenitori scelti. Sostituire l'etanolo nelle piastre di coltura cellulare modificate almeno una volta all'ora per mantenere un'esposizione costante all'etanolo durante tutto il saggio e ripetere l'esperimento per tutti i campioni desiderati.

Guarda la registrazione video per determinare il tempo di sedazione della mosca, che è definito come il momento in cui una mosca perde il controllo posturale e l'abilità locomotoria. Per garantire la precisione, guardare il film in retromarcia e registrare l'ora in cui la mosca inizia a muoversi. Questo metodo può essere utilizzato per generare dati su un gran numero di mosche entro 10 minuti.

Due piastre da 24 potte sono state utilizzate per misurare simultaneamente i tempi di sedazione dell'etanolo per 48 mosche individuali di due linee DGRP con sensibilità diverse all'alcol. Le grandi dimensioni del campione aumentano la precisione e riducono l'errore alle variazioni ambientali. RAL_555 mosche erano meno sensibili delle mosche RAL-177.

Maschi e femmine di RAL_177 non mostravano effetti sessualmente dimorfici, mentre le femmine di linea RAL_555 erano meno sensibili all'esposizione all'etanolo rispetto ai maschi. Quando si tenta questo protocollo, è fondamentale eseguire l'aspirazione delle mosche e l'inversione della piastra di coltura cellulare con precisione per ottenere il risultato desiderato. Poiché la capacità di valutare singole mosche evita effetti confondenti dovuti alle interazioni di gruppo, questo saggio migliora l'utilità del modello Drosophila per studi ad alta produttività sugli effetti acuti dell'esposizione all'alcol.