In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

L'elettroporazione in utero di MAGIC Marker è una tecnica potente e versatile per individualizzare e valutare rapidamente la morfologia degli astrociti corticali. Il vantaggio principale di questa particolare tecnica è quello di marcare più cellule progenitrici e la progenie neuronale e virale con un controllo preciso. A dimostrare la procedura con me sarà Karine Loulier, la ricercatrice principale di Prima di iniziare la procedura, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici ad alta temperatura in uno sterilizzatore a perle di vetro.

E metti una goccia di gel per elettrodi in un piatto da 35 millimetri. Inserire una micropipetta in un supporto per microiniezione e rompere la punta della micropipetta. Aspirare la soluzione di DNA e mettere una goccia da un microlitro di una soluzione verde veloce con una pipetta nel coperchio di un piatto di tre centimetri come riferimento.

Quindi aggiungere un volume dalla micropipetta rotta accanto alla goccia di riferimento e regolare nuovamente il parametro di pressione o tempo, se necessario; in modo che le gocce di dimensioni equivalenti saranno prodotte dal micro iniettore. Se il volume è inferiore a quello di riferimento, rompere nuovamente la punta della micropipetta e ripetere. Per preparare il topo gravido, dopo la pesatura e l'iniezione di anestetico, confermare la mancanza di risposta nel topo femmina anestetizzato e applicare un unguento sugli occhi dell'animale.

Rasato delicatamente l'addome del topo posto in posizione supina su un termoforo. Pulire la pelle esposta con un tampone imbevuto di iodio e uno imbevuto di alcol. E posizionare impacchi sterili intorno all'area chirurgica rasata, pulita e igienizzata dell'animale.

Quando il topo è stato preparato, praticare un'incisione verticale di due centimetri sulla linea mediana nell'addome inferiore. E manipolare delicatamente le borse embrionali per esporre le corna uterine. Valutare la posizione della cervice e il numero di sacche embrionali su ciascun lato della cervice.

E orientare il cervello dell'embrione del giorno 15,5 da elettroporare in modo che il brahma, che è facilmente riconoscibile alla giunzione dei tre principali vasi sanguigni che corrono lungo le fessure cerebrali, possa essere visualizzato. Immaginando una linea virtuale tra il brahma e l'occhio, introduci la micropipetta tra la linea virtuale e la fessura longitudinale. Quindi premere il pedale per erogare un microlitro di soluzione di DNA nel ventricolo laterale dell'emisfero bersaglio.

Un ventricolo iniettato con successo apparirà blu. Dopo che il DNA è stato iniettato, applicare elettrodi su entrambi i lati dell'embrione con l'anodo che copre l'emisfero iniettato. Premere il pedale dell'elettroporatore per erogare una serie di quattro cariche da 50 millisecondi a 35 volt, separate da intervalli di 950 millisecondi.

Quindi idratare l'embrione con una soluzione salina calda. Quando tutti gli embrioni bersaglio sono stati elettroporati, rimetti le corna uterine nell'addome e riempi la cavità addominale con soluzione salina calda. Chiudere il muscolo addominale con una sutura riassorbibile continua.

E chiudere la pelle con circa 10 punti singoli di una sutura assorbibile 4-0. Al termine della procedura chirurgica, posizionare regolarmente le suture cutanee lungo l'incisione. Quindi posizionare l'animale in una gabbia pulita con monitoraggio fino al completo recupero.

La topolina incinta completamente guarita dovrebbe avere un pelo pulito e un'incisione chirurgica intatta. Per l'imaging confocale multicanale dei tessuti iniettati, impostare il microscopio per l'eccitazione dei laser appropriati. E localizza gli astrociti più luminosi nell'area elettroporata.

Poiché le celle etichettate più vicine alla superficie possono apparire più luminose di quelle più profonde all'interno della sezione, regolare le impostazioni di acquisizione sulle celle della superficie per evitare di saturare le immagini, utilizzando la tabella di ricerca alto-basso. Un'immagine adeguatamente bilanciata dovrebbe mostrare solo pochi pixel blu e quasi nessun pixel rosso. Quindi, utilizzare il tavolino motorizzato del microscopio per acquisire pile Z piastrellate da 1024 x 1024 pixel con una sovrapposizione del 10% tra pile adiacenti per consentire successivamente ricostruzioni a mosaico dell'area elettroporata o della zona di interesse.

Gli astrociti marcati possono essere valutati con immagini confocali affiancate acquisite con un obiettivo 20x, 0,8na e assemblate come ricostruzioni Z stack come dimostrato. Il contorno dei singoli astrociti può essere delineato su ogni singola sezione ottica delle pile di immagini confocali per la segmentazione e la ricostruzione del dominio territoriale occupato da ciascun astrocita. Dalle stesse pile di immagini Z, la morfologia dei rami degli astrociti corticali individuati può essere segmentata utilizzando un software ad accesso aperto che consente l'estrazione dello scheletro dei principali processi astrocitari.

Una corretta idratazione durante l'intervento chirurgico e prima che vengano posizionate le suture di chiusura è fondamentale per aumentare la sopravvivenza degli embrioni e il recupero della madre. L'elettroporazione in utero del toolbox MAGIC Marker può essere utilizzata per marcare le cellule progenitrici in un modello distinto nelle fasi di valore dello sviluppo per tracciare il lignaggio alla risoluzione della singola cellula.