Name: Analisi di competenza vettoriale sulle zanzare Aedes aegypti utilizzando il virus Zika (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Impara l'analisi di competenza vettoriale su Aedes aegypti per valutare la trasmissione del virus Zika. Questo metodo identifica le popolazioni di zanzare a rischio e supporta strategie di prevenzione delle malattie trasmesse da arbovirus.

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Riconosciamo lo staff del World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton e Divya Mirchandani, per il loro instancabile lavoro nel curare e fornire molti dei ceppi virali utilizzati per gli esperimenti di competenza vettoriale nostri e di altri gruppi. Il lavoro presentato è stato finanziato dal McLaughlin Fellowship Fund (SRA) e dalle sovvenzioni NIH AI120942 e AI121452.

Tutte le procedure eseguite in questi protocolli sono state eseguite nel pieno rispetto dei protocolli approvati dall'Institutional Biosafety Committee e dall'Institutional Animal Care and Use Committee della University of Texas Medical Branch di Galveston.
1. Amplifica ZIKV nelle celle Vero
<ol><li>Coltiva cellule Vero (CCL-81 o VeroE6) nella modifica di Dulbecco del mezzo essenziale minimo (DMEM) di Eagle integrato con il 10% v / v siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS) e l'1% (v / v) penicillina-streptomicina (100 U / mL e 100 μg / mL, rispettivamente) in un incubatore umidificato a 37 ° C con co5% con co 2 a una confluenza compresa tra 80-90% in un pallone di coltura tissutale di 150 cm2.</li>
	<li>In un armadio di biosicurezza (BSC), rimuovere il mezzo e smaltire in candeggina al 10% o in una diluizione di lavoro di doppio ammonio quaternario (Tabella dei materiali). Inoculare immediatamente il monostrato con 1 mL di stock virale, mirando a 0,1-1 particella virale infettiva per cellula. Agitare immediatamente il pallone in modo tale che l'inoculo entri in contatto con il monostrato nella sua interezza.</li>
	<li>Ricaricare il mezzo a un volume di 5 ml utilizzando DMEM integrato con FBS inattivato dal calore al 2% v / v e 1% (v / v) penicillina-streptomicina. Quindi spostare il pallone nell'incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2 per 60 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il pallone dall'incubatrice e portarlo in un BSC. Aggiungere ulteriore mezzo a un volume totale di 15 ml utilizzando DMEM integrato con FBS inattivato dal calore al 2% v / v e 1% (v / v) penicillina-streptomicina. Spostare il matraccio in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2.</li>
	<li>Esaminare il pallone ogni giorno al microscopio a contrasto di fase per l'evidenza di effetti citopatici (CPE). Procedere alla raccolta virale (fase 1.7) quando solo circa il 40-50% delle cellule rimane nel monostrato, generalmente 3-5 giorni dopo la concentrazione a seconda del ceppo di ZIKV utilizzato.</li>
	<li>Aspirare il surnatante e metterlo in un flaconcino conico da 50 ml. Chiarire il surnatante dei detriti cellulari mediante centrifugazione (3.500 x g per 20 min). NOTA: se più palloni sono stati infettati in modo identico, i supernatanti di più palloni possono essere combinati in tubi conici da 50 ml.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante dal tubo conico da 50 ml in uno fresco, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Integrare il surnatante con FBS inattivato dal calore ad una concentrazione finale del 30% (v/v). Aliquotare questa miscela in singoli tubi con tappo a vite e congelare a -80 °C fino all'uso.</li>
</ol>2. Preparazione di farine di sangue artificiali
<ol><li>Il giorno in cui le zanzare devono essere esposte a farina di sangue infettiva, accendere la fonte di energia (Tabella dei materiali) in un impianto di contenimento degli artropodi in modo tale che le unità di alimentazione ( Tabella deimateriali) siano preriscaldate nel momento in cui le zanzare sono preparate per l'esposizione.</li>
	<li>Preparare farine di sangue artificiali utilizzando uno dei metodi descritti di seguito.<ol>
<li>Metodo 1: Combinare sangue umano appena raccolto (entro una settimana) citrato o eparinizzato acquistato commercialmente 1:1 v/v con brodo virale (preparato come descritto nel paragrafo 1). NOTA: Questo metodo è subordinato all'assenza di anticorpi contro la famiglia virus/virus presenti nel sangue.</li>
		<li>Se l'assenza di anticorpi non può essere confermata o se la fonte di sangue è nota per avere una precedente esposizione al flavivirus, lavare e imballare manualmente gli eritrociti.<ol>
<li>In un BSC, aggiungere 30 mL di sangue umano intero a un tubo conico da 50 mL e rabboccare fino a 50 mL con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).</li>
			<li>Centrifuga a 3.500 x g per 20 min.</li>
			<li>Aspirare il surnatante versando delicatamente in una vaschetta contenente candeggina al 10% o diluizione di lavoro di doppio ammonio quaternario, facendo attenzione a non scartare il pellet di eritrociti.</li>
			<li>Aggiungere 10 ml di PBS e picchiettare delicatamente il fondo del tubo conico contro il fondo del BSC in modo tale che il pellet di eritrociti sia stato ricostituito. Portare il volume della sospensione fino a 50 ml con PBS. Mescolare per inversione delicata.</li>
			<li>Ripetere i passaggi 2.2.2.1−2.2.2.4 per un totale di 4−6x. Confermare che il surnatante è chiaro o solo leggermente rosa e non più opaco. Rimuovere tutto il surnatante usando una pipetta sierologica. Sospendere il pellet di eritrociti in 1−2 ml di PBS.</li>
			<li>Assemblare la farina di sangue: 350 μL di eritrociti confezionati, 100 μL di saccarosio al 10%, 200 μL di FBS inattivato dal calore, ATP ricombinante da 900 μM e 2 ml di stock virale opportunamente diluito utilizzando DMEM integrato con FBS inattivato dal calore al 2% v / v e 1% (v / v) penicillina-streptomicina.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sovrapporre un'unità serbatoio standard da 3 ml(Tabella dei materiali)con la pelle di un topo non infetto (altre opzioni includono film di paraffina, membrane collagenose o involucro di salsiccia).</li>
	<li>Posizionare il serbatoio coperto su asciugamani di carta bianca. Aggiungere ~ 2 mL di farina di sangue infettiva al serbatoio 1 mL alla volta. Ispezionare l'asciugamano sotto l'alimentatore per eventuali prove di perdite. Se sono presenti perdite, recuperare la farina di sangue dagli alimentatori e scartare le coperture. Sigillare gli alimentatori con tappi. Ancora una volta conferma che non sono presenti perdite.</li>
</ol>3. Backtitration di farine di sangue/test della placca
<ol><li>Utilizzando il volume rimanente della farina di sangue preparata, eseguire una serie di diluizioni seriali 10x (cioè 6 diluizioni, che vanno da diluito 10x a 1.000.000x) utilizzando DMEM integrato con FBS inattivato dal calore al 2% v / v e 1% (v / v) penicillina-streptomicina.</li>
	<li>Aliquota 100 μL delle diluizioni nei pozzetti di 24 o 12 piastre di pozzo dal più diluito al più concentrato.</li>
	<li>Incubare per 1 ora in un incubatore a 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Alla fine del periodo di incubazione di 1 ora, riportare le piastre nel BSC e aggiungere 1 mL o 2 mL di sovrapposizione di metilcellulosa alle piastre a 24 pozzetti o 12 pozzetti, corrispondentemente.</li>
	<li>Riposizionare le piastre sovrapposte in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 e incubare per 3-7 giorni (virus dipendente dal ceppo).</li>
	<li>Dopo l'incubazione, rimuovere le piastre dall'incubatore e portarle nel BSC. Scartare la sovrapposizione di metilcellulosa in una vaschetta contenente il 10% di candeggina o un doppio disinfettante al ammonio quaternario.</li>
	<li>Lavare ogni pozzetto 2 volte con PBS, scartando il lavaggio in una teglia contenente il 10% di candeggina o doppio ammonio quaternario.</li>
	<li>Aggiungere ~1 mL di metanolo:acetone (1:1 v:v) e lasciare che le celle si fissino sulla piastra per almeno 30 minuti nel BSC a temperatura ambiente (RT). Scartare il metanolo: acetone secondo la politica istituzionale sui rifiuti organici.</li>
	<li>Visualizza ZIKV utilizzando uno dei due metodi descritti di seguito.<ol>
<li>Dopo la rimozione del metanolo: acetone, colorare immediatamente con una soluzione di cristallo viola (0,25% p/v in metanolo al 30%) per 5 minuti. Risciacquare 2 volte nell'acqua del rubinetto e lasciare asciugare, quindi visualizzare direttamente ad occhio per prove di placche o distruzione del monostrato.</li>
		<li>In alternativa, eseguire il test di formazione del focus.<ol>
<li>Lasciare asciugare le piastre all'aria fino a quando non rimane alcun fissativo organico. NOTA: questo dovrebbe richiedere ~ 2-3 ore al di fuori del BSC, ma può essere accelerato dall'essiccazione all'aria in un BSC o in una cappa di fumi chimici.</li>
			<li>Lavare ogni pozzetto 3 volte per 15 minuti ciascuno in PBS non sterile (Mg2+ e Ca2+ libero) su un bilanciere a piastra orbitale. Rimuovere PBS e aggiungere 1 mL di soluzione di blocco (PBS + 3% FBS) a ciascun pozzo e roccia per 15 minuti a RT.</li>
			<li>Aggiungere 100 μL per pozzetto di anticorpo primario α-ZIKV o α-flavivirus (ad esempio, ibridoma del gruppo flavivirus D1-4G2-4-15 [4G2]) a una diluizione 1:2.000 in soluzione bloccante. Incubare con dondolo per un minimo di 4 ore (preferibilmente durante la notte, non superiore a 18 ore) a RT.</li>
			<li>Rimuovere l'anticorpo primario e lavare 3 volte per 15 minuti ciascuno con PBS (Mg2+ e Ca2+ libero) su un bilanciere a piastra orbitale.</li>
			<li>Aggiungere 100 μL per pozzetto dell'anticorpo secondario (capra α topo HRP-marcato) diluito 1:2.000 nel tampone bloccante. Incubare con dondolo per 1 ora a RT.</li>
			<li>Lavare 3 volte per 15 minuti ciascuno con PBS (Mg2+ e Ca2+ libero) su un bilanciere a piastra orbitale.</li>
			<li>Aliquota 100 μL di reagente per lo sviluppo del substrato (Tabella dei materiali) per pozzetto. Piastre di roccia a RT per 15 min.</li>
			<li>Arrestare la reazione allo sviluppo di focolai / placche rimuovendo il substrato e risciacquando le piastre 2 volte con acqua del rubinetto. Versare l'acqua del rubinetto e lasciare asciugare all'aria le piastre prima di quantificare.</li>
			<li>Contare i focolai virali per determinare il numero di FFU presenti nel campione dato.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Somministrazione di farine di sangue
<ol><li>Usa le zanzare Ae. aegypti 2-4 giorni dopo l'eclosione. Ordinare le zanzare femmine in cartoni di cartone da 0,5 L con coperchi schermati e privarle di zucchero (generalmente 36-48 ore prima della farina di sangue infettiva). Fornire acqua ad libitum tramite batuffoli di cotone saturi d'acqua.</li>
	<li>Rimuovere i batuffoli di cotone saturi d'acqua al mattino in cui le zanzare saranno esposte alla farina di sangue infettiva.</li>
	<li>Collegare serbatoi contenenti farine di sangue artificiali ai cavi dell'unità di alimentazione all'interno di un vano portaoggetti di plastica trasparente.</li>
	<li>All'interno del vano portaoggetti, posizionare una scatola di cartone da 0,5 L con un coperchio schermato, contenente 50-100 zanzare Ae. aegypti affamate, sotto l'unità di alimentazione attaccata al serbatoio. NOTA: le zanzare opportunamente affamate si nutrono generalmente entro 20 minuti. L'alimentazione può essere prolungata secondo necessità per aumentare le dimensioni del campione nelle popolazioni più lente, anche se questo non dovrebbe estendersi oltre i 60 minuti, perché il titolo virale (ZIKV) può diminuire all'interno dell'alimentatore dopo ~ 60 minuti.</li>
	<li>Al termine dell'alimentazione, rimuovere il serbatoio e immergere nella candeggina al 10% appena fatta.</li>
	<li>Anestetizzare a freddo le zanzare mediante incubazione per 30 s a -20 °C o per 5 minuti in frigorifero.</li>
	<li>All'interno del vano portaoggetti, versare le zanzare in una capsula di Petri sul ghiaccio. Conta e ordina le femmine ingorgate dalle zanzare non impegnate. Smaltire le zanzare non innestate per immersione in un tubo conico da 50 ml riempito con etanolo al 70%. Mentre le zanzare sono ancora anestetizzate, versarle di nuovo nella scatola di cartone da 0,5 L e coprire rapidamente con lo schermo e il coperchio. Tagliare la rete dello schermo in eccesso dal cartone e fissare la rete con del nastro adesivo.</li>
	<li>Aggiungere un batuffolo di cotone saturo di saccarosio acquoso filtrato sterile al 10% sullo schermo di ciascuna scatola. Metti tutti i cartoni delle zanzare in un grande contenitore secondario di plastica con una spugna umida per mantenere l'umidità.</li>
	<li>Posizionare un contenitore secondario contenente cartoni di zanzare in un'incubatrice con una temperatura di 27 ± 1 °C (o a seconda dei casi per simulare le condizioni nella regione di interesse) con l'80% di ± il 10% di umidità relativa e un ciclo luce-buio 16:8). Mantenere le zanzare con accesso ad libitum al 10% di saccarosio fino al completamento degli esperimenti.</li>
</ol>5. Acquisizione ed elaborazione del campione
<ol><li>Nei giorni specificati dopo l'alimentazione, aspirare un numero predeterminato di zanzare dai cartoni appropriati utilizzando un aspiratore meccanico all'interno di un vano portaoggetti. Coprire il tubo di raccolta con un tondo di cotone dopo aver acquisito il numero richiesto di zanzare.</li>
	<li>Anestetizzare a freddo le zanzare mediante incubazione per 30 secondi a -20 °C o per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>All'interno del vano portaoggetti, versare le zanzare in una capsula di Petri sul ghiaccio. Utilizzando due paia di pinze, rimuovere tutte e sei le zampe di ciascuna zanzara e posizionarle in un tubo microcentrifuga a fondo rotondo preetichettato da 2 mL contenente un cuscinetto a sfere in acciaio inossidabile sterilizzato (7/32 ") e 500 μL di mezzi di raccolta delle zanzare (MCM) composti da DMEM, 2% FBS, 1% penicillina-streptomicina e 2,5 μg / mL di amfotericina.</li>
	<li>Posizionare delicatamente la zanzara su una goccia di olio minerale per trattenerla, avendo cura di non permettere alcun contatto tra l'olio e la testa e la proboscide della zanzara.</li>
	<li>Inserire la proboscide della zanzara in una punta della pipetta da 10 μL riempita con 10 μL di FBS inattivato dal calore. NOTA: In alternativa, la pipetta può essere riempita con saccarosio, sangue o olio minerale. L'olio consente la visualizzazione diretta delle bolle di saliva tramite microscopia ottica.</li>
	<li>Lasciare salivare la zanzara per 30 minuti. Espellere la punta della micropipetta contenente FBS + saliva in un tubo di microcentrifuga contenente 100 μL di MCM, quindi posizionare la carcassa in un tubo microcentrifuga a fondo tondo da 2 mL separato contenente un cuscinetto a sfere in acciaio sterilizzato e 500 μL di MCM. Assicurarsi che i tubi utilizzati per i corpi, le gambe e la saliva siano etichettati in modo che sia chiaro che tutti e tre i campioni provengono dalla stessa zanzara.</li>
	<li>Mentre le zanzare stanno salivando, eseguire i passaggi 5.3-5.5 sulle zanzare rimanenti.</li>
	<li>Trasportare i tubi contenenti i corpi e le gambe a un dispositivo di omogeneizzazione del tessuto di fresatura di perline contenuto all'interno di un BSC. Triturare tutti i campioni del corpo e delle gambe a 26 Hz per 5 minuti per liberare particelle virali nel surnatante. Chiarire tutti i campioni mediante centrifugazione a 200 x g per 5 minuti a pellet detriti cellulari. NOTA: A questo punto, i campioni possono essere congelati a -80 °C o analizzati immediatamente.</li>
</ol>6. Rilevazione di ZIKV mediante test infettivo
<ol><li>In un BSC, preparare 24 piastre di coltura tissutale con cellule Vero(10 5 cellule per pozzetto) 24 ore prima dell'inizio del test infettivo. Etichettare ogni pozzetto con l'identità di una singola zanzara/campione.</li>
	<li>Se i campioni sono stati congelati a -80 °C, lasciare scongelare.</li>
	<li>Rimuovere il supporto dalle piastre cellulari Vero prima dell'inoculazione con campioni una piastra alla volta.</li>
	<li>Per i campioni contenenti corpi o zampe, aliquotare accuratamente 100 μL di surnatante chiarificato in ciascun pozzetto, facendo attenzione a non disturbare i detriti delle cellule di zanzara dal pellet. NOTA: i campioni di saliva possono essere diluiti 1:1 (v/v) con MCM prima dell'inoculazione sulle cellule per conservare i campioni per una successiva titolazione, se necessario.</li>
	<li>Spostare le piastre in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 e incubare per 1 ora.</li>
	<li>Riportare le piastre al BSC e aggiungere ~ 1 mL di copertura di metilcellulosa a ciascun pozzetto. Riposizionare le piastre sovrapposte in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 e incubare per 3-7 giorni (virus/ceppo-dipendente).</li>
	<li>Eseguire la fissazione e la visualizzazione come descritto nei passaggi 3.6-3.9.</li>
	<li>Per quanto riguarda il punteggio tramite un test di formazione del fuoco, quantificare i pozzetti positivi esaminando al microscopio ottico. Il rilevamento della colorazione intracitoplasmatica delle cellule in un pozzo indica la presenza di virus. I campioni vengono valutati esclusivamente come focus-positivi o -negativi.</li>
</ol>

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<li>Guo, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Feeding+Patterns+of+Mosquitoes+in+a+Rural+Malaria-Endemic+Region+in+Hainan+Island%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).</li>
<li>Kuno, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+history+of+laboratory+breeding+of+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29+focusing+on+the+origins+and+use+of+selected+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains.</a> Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).</li>
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<li>Althouse, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+Zika+Virus+to+Establish+a+Sylvatic+Transmission+Cycle+in+the+Americas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055(2016).</li>
<li>Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fever+from+the+forest%3A+prospects+for+the+continued+emergence+of+sylvatic+dengue+virus+and+its+impact+on+public+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).</li>
<li>Vasilakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+ancestral+sylvatic+dengue-2+viruses+to+re-emerge%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge.</a> Virology. 358 (2), 402-412 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I metodi qui descritti forniscono un flusso di lavoro generalizzato per condurre analisi delle competenze vettoriali. Come quadro generale, molte di queste metodologie sono conservate in tutta la letteratura. Tuttavia, c'è un notevole spazio per le modifiche (recensito in Azar e Weaver1). Virus (ad esempio, lignaggio virale, conservazione del virus di sfida, storia di passaggio virale), entomologia (ad esempio, colonizzazione di laboratorio di popolazioni di zanzare, immunità innata, microbioma / ...

La competenza vettoriale è definita come la capacità a livello di specie, popolazione e persino individuo, di un dato artropode come una zanzara, una zecca o una mosca di sabbia flebotomina, di acquisire e trasmettere un agente biologicamente con replicazione o sviluppo nell'artropode1,2. Per quanto riguarda le zanzare e i virus trasmessi dagli artropodi (cioè gli arbovirus), l'agente viene assorbito da un ospite viremico da una zanzara femmina. Dopo l'ingestione, il virus deve infettare in modo produttivo una di una piccola popolazione di cellule epiteliali dell'intestino medio3, superando vari ostacoli fisiologici come la degradazione proteolitica da parte degli enzimi digestivi, la presenza del microbiota (barriera di infezione dell'intestino medio, o MIB) e la matrice peritrofica secreta. L'infezione dell'epitelio midgut deve essere seguita dalla replicazione del virus e dall'eventuale fuga dal midgut nel sistema circolatorio aperto della zanzara, o emolinfa, che rappresenta l'insorgenza di un'infezione disseminata che supera la barriera di fuga del midgut (MEB). A questo punto il virus può stabilire infezioni dei tessuti secondari (ad esempio, nervi, muscoli e corpi adiposi) e continuare a replicarsi, sebbene tale replicazione secondaria possa non essere strettamente necessaria affinché il virus infetti le cellule acinari delle ghiandole salivari (superando la barriera di infezione della ghiandola salivare). L'uscita dalle cellule acinari della ghiandola salivare nelle loro cavità apicali e quindi il movimento nel dotto salivare consente l'inoculazione del virus in ospiti successivi al morso e completa il ciclo di trasmissione1,2,4,5,6,7.
Dato questo meccanismo di diffusione ben caratterizzato e generalmente conservato all'interno di un vettore di zanzara, le valutazioni delle competenze vettoriali di laboratorio sono spesso metodologicamente simili, sebbene esistano differenze nei protocolli1,2. Generalmente, dopo l'esposizione orale al virus, le zanzare vengono sezionate in modo che i singoli tessuti come l'intestino medio, le gambe, le ovaie o le ghiandole salivari possano essere analizzati per l'infezione virale, l'infezione disseminata, l'infezione disseminata / potenziale trasmissione transovarica e l'infezione disseminata / potenziale competenza di trasmissione, rispettivamente8. La semplice presenza di un virus nelle ghiandole salivari, tuttavia, non è una prova definitiva della capacità di trasmissione, data l'evidenza di una barriera di fuga/uscita della ghiandola salivare (SGEB) in alcune combinazioni vettore/virus1,2,4,5,7,9. Il metodo standard per dimostrare la competenza di trasmissione rimane la trasmissione delle zanzare a un animalesuscettibile10,11,12. Tuttavia, dato che per molti arbovirus ciò richiede l'uso di modelli murini immunocompromessi13,14,15,16,questo metodo è spesso proibitivo in termini di costi. Un'alternativa comunemente usata è la raccolta della saliva della zanzara, che può essere analizzata mediante reazione a catena trascrizione inversa-polimerasi (RT-PCR) o un test infettivo per dimostrare la presenza del genoma virale o di particelle infettive, rispettivamente. Vale la pena notare che tali metodi di raccolta della saliva in vitro possono sovrastimare12 o sottostimare17 la quantità di virus depositata durante l'alimentazione in vivo, indicando che tali dati devono essere interpretati con cautela. Tuttavia, il metodo in vitro è molto prezioso se analizzato dal punto di vista della semplice presenza di virus nella saliva, indicando il potenziale di trasmissione.
Esistono due approcci principali per determinare il ruolo dei vettori di zanzare nelle epidemie di malattie arbovirali. Il primo metodo prevede la sorveglianza sul campo, in cui le zanzare vengono raccolte nel contesto della trasmissione attiva18,19,20,21,22,23,24. Tuttavia, dato che i tassi di infezione sono in genere piuttosto bassi (ad esempio, il tasso di infezione stimato dello 0,061% delle zanzare nelle aree di circolazione attiva del virus Zika (ZIKV) negli Stati Uniti21), l'incriminazione di potenziali specie di vettori può essere fortemente distorta dalla metodologia di cattura25,26 e dalla casualità (ad esempio, campionando un individuo infetto su 1.600 non infetti)21 . Tenendo conto di ciò, un determinato studio potrebbe non acquisire zanzare sufficienti sia in numero grezzo che in diversità di specie per campionare accuratamente le zanzare coinvolte nella trasmissione. Al contrario, le analisi della competenza vettoriale vengono eseguite in un ambiente di laboratorio, consentendo un controllo rigoroso di parametri come la dose orale. Sebbene non pienamente in grado di rappresentare la vera complessità dell'infezione da zanzara e la capacità di trasmissione in un ambiente di campo, queste valutazioni di laboratorio rimangono potenti strumenti nel campo dell'arbovirologia.
Sulla base di varie analisi di competenza vettoriale con ZIKV in diverse specie di zanzare, popolazioni e metodi27,28,29,30,31,32,nonché di una recente revisione delle valutazioni della competenza vettoriale1,descriviamo qui molti dei protocolli associati a un tipico flusso di lavoro di competenza vettoriale. In questi esperimenti, tre popolazioni di Ae. aegypti provenienti dalle Americhe (la città di Salvador, Brasile; repubblica Dominicana; e la bassa valle del Rio Grande, TX, USA) sono state esposte a un singolo ceppo di ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) a 4, 5 o 6 log10 unità di focalizzazione (FFU) / mL dosi sotto forma di farine di sangue artificiali. Successivamente, sono stati analizzati per prove di infezione, infezione disseminata e competenza di trasmissione dopo vari periodi di incubazione estrinseca (2, 4, 7, 10 e 14 giorni) mediante dissezione e un test infettivo basato su colture cellulari. Sebbene l'attuale flusso di lavoro / protocolli sia ottimizzato per ZIKV, molti elementi sono direttamente traducibili in altri arbovirus trasmessi dalle zanzare nel contenimento degli artropodi e nei livelli di biosicurezza 2 e 3 (ACL / BSL2 o ACL / BSL3).

<table><tbody><tr><td>Serbatoio standard da 3 ml</td><td>R37P30</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Attrezzatura per insetti</td></tr><tr><td>7/32" Acciaio inossidabile 440 Sfere di grado C</td><td>4RJH9</td><td></td><td>Grainger Mezzi di macinazione</td></tr><tr><td>Acetone, grado istologico, prodotti chimici Fisher, bottiglia in polietilene, 4L, 4/caso</td><td>A16-P4</td><td>FisherScientific</td><td>Adenosina fissativa</td></tr><tr><td>5'-trifospato sale disodico idrat, microbico, BioReagente, adatto per cellule coltura</td><td>A6419-1G</td><td>Reagente</td><td>MilliporeSigma</td></tr><tr><td>Anticorpo antigene del gruppo Anti-Flavivirus, clone D1-4G2-4-15</td><td>MAB10216</td><td>Anticorpo primario MilliporeSigma</td><td>per il test di formazione del fuoco</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-IgG (H+L) di topo, siero umano adsorbito e marcato con perossidasi, 1,0 ml/flacone</td><td>5450-0011</td><td>KPL/Seracare</td><td>Anticorpo secondario per il test di formazione del fuoco</td></tr><tr><td>Candeggina</td><td>NC0427256</td><td>FisherScientific</td><td>Decontaminazione</td></tr><tr><td>Corning, fiasche trattate per colture cellulari, 150 cm2, tappo ventilato, confezione da 50</td><td>10-126-34</td><td>FisherScientific</td><td>Materiale di consumo per colture cellulari</td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari Costar, 24 pozzetti, 5/sacchetto, 100/cassa, Corning</td><td>07-200-740</td><td>FisherScientific</td><td>Materiale di consumo per colture cellulari</td></tr><tr><td>Costar Piastre per colture cellulari, 96 pozzetti, 5/sacchetto, 100/cassa, Corning</td><td>07-200-91</td><td>FisherScientific</td><td>Materiale di consumo per colture cellulari</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>C0775-100G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Stain</td></tr><tr><td>Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case</td><td>05-402-7</td><td>FisherScientific</td><td>Materiale di consumo in plastica</td></tr><tr><td>Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes</td><td>14-959-70C</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumabile</td></tr><tr><td>Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes</td><td>14-959-49A</td><td>FisherScientific</td><td>Materiale di consumo in plastica</td></tr><tr><td>Falcon Pipette monouso in polistirene 10 ml, 200/Confezione</td><td>13-675-20</td><td>FisherScientific</td><td>Consumabile in plastica</td></tr><tr><td>Falcon Pipette monouso in polistirene sierologiche da 1 ml, 1000/Confezione</td><td>13-675-15B</td><td>FisherScientific</td><td>Consumabile in plastica</td></tr><tr><td>Falcon Sierologico monouso in polistirene Pipette da 25 ml, 200/Confezione</td><td>13-675-30</td><td>FisherScientific</td><td>Consumabile in plastica</td></tr><tr><td>Falcon Polistirene monouso Sierologico da 5 ml, 200/Confezione</td><td>13-675-22</td><td>FisherScientific</td><td>Consumabile in plastica</td></tr><tr><td>Falcon Piastre standard per colture tissutali</td><td>08-772B</td><td>FisherScientific</td><td>Consumabile in plastica</td></tr><tr><td>Fetale Siero bovino-Premium, 500 ml</td><td>S11150</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>Reagente</td></tr> <tr><td>per colture cellulariFisherbrand Economy Vetrini per microscopio in vetro semplice</td><td>12-550-A3</td><td>FisherScientific</td><td>Immobilizzazione delle zanzare</td></tr><tr><td>FU1 Alimentatore</td><td>FU1-0</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Attrezzatura per insetti; unità di alimentazione</td></tr><tr><td>Gibco DPBS con calcio e magnesio, 10 bottiglie da 500 ml</td><td>140-040-182</td><td>FisherScientific</td><td>Reagente per colture cellulari</td></tr><tr><td>Gibco Fungizone, amfotericina B, 250&mu; g/mL, 50mL/flacone</td><td>15-290-026</td><td>Fisher Scientific</td><td>Reagente per colture cellulari</td></tr><tr><td>Gibco Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL), 100mL/Flacone, 20 Flaconi/Cassa</td><td>15-140-163</td><td>FisherScientific</td><td>Reagente per colture cellulari</td></tr><tr><td>Gibco, Tripsina-EDTA (.25%), Rosso fenolo, 20 flaconi da 100 ml</td><td>25-200-114</td><td>FisherScientific</td><td>Reagente per colture cellulari</td></tr><tr><td>Gibcom DMEM, glicemia alta, 10 flaconi</td> <td>da 500 ml11-965-118</td><td>FisherScientific</td><td>Reagente per colture cellulari</td></tr><tr><td>Sangue umano, sesso non specificato, Na-citrato, 1 unità</td><td>7203706</td><td></td><td>Lampire Preparazione della farina di sangue</td></tr><tr><td>Aspiratore InsectaVac</td><td>2809B</td><td>Bioquip</td><td>Attrezzatura per insetti</td></tr><tr><td>Metanolo, ACS certificato, Fisher Chemicals, Bottiglia di vetro ambrato, 4L, 4/Cassa</td><td>A412-4</td><td>FisherScientific</td><td>Fissativo</td></tr><tr><td>Metilcellulosa, viscosità: 3.500-5.600 cP, 2 % in acqua (20 gradi; C), 250 g/flacone</td><td>M0512-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagente per colture cellulari</td></tr><tr><td>Micro-chem Plus Detergente disinfettante</td><td>C849T34</td><td>Thomas Scientific</td><td>Decontaminazione; diluizione di lavoro di olio minerale di ammonio quaternario doppio</td></tr><tr><td>, BioReagente, per biologia molecolare</td><td>M5904-5X5ML</td><td>MilliporeSigma</td><td>Immobilizzazione di zanzare</td></tr><tr><td>O-ring</td><td>OR37-25</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Apparecchiature per insetti</td></tr><tr><td>Tappi in plastica</td><td>PP5-250</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Apparecchiature per insetti</td></tr><tr><td>PS6 Unità di alimentazione (110-120 V)</td><td>PS6120</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Apparecchiature per insetti; fonte di alimentazione</td></tr><tr><td>Pinze Rubis, lame sfalsate, punte superfini</td><td>4525</td><td>Bioquip</td><td>Attrezzature per insetti</td></tr><tr><td>Sarstedt Inc, 2 ml di tappo a vite per microtubi, fondo conico, tappo O-ring, sterile, 1000/Caso</td><td>50-809-242</td><td>FisherScientific</td><td>Consumabile in plastica</td></tr><tr><td>Saccarosio, BioUltra, per biologia molecolare</td><td>84097-250G</td><td>MilliporeReagente Sigma</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barriera a bassa ritenzione 1000&mu; L Puntali per pipette, 100 puntali/rack, 8 rack/confezione, 4 confezioni/confezione</td><td>21-402-487</td><td>FisherScientific</td><td>Materiale di consumo in plastica</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200&mu; L Puntali per pipette, 96 puntali/rack, 10 rack/confezione, 5 confezioni/cartone</td><td>21-402-486</td><td>FisherScientific</td><td>Materiale di consumo in plastica</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20&mu; L Puntali per pipette, 96 puntali/rack, 10 rack/confezione, 5 confezioni/cartone</td><td>21-402-484</td><td>FisherScientific</td><td>Materiale di consumo in plastica</td></tr><tr><td>ThermoScientific, barriera ART a bassa ritenzione, portata estesa 10&mu; L Puntali per pipette, 96 puntali/rack, 10 rack/confezione, 5 confezioni/confezione</td><td>21-402-482</td><td>FisherScientific</td><td>Materiale di consumo in plastica</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>85300</td><td>QIAGEN</td><td>Omogeneizzazione</td></tr><tr><td>Kit substrato perossidasi TrueBlue, 200 ml</td><td>5510-0030</td><td>Seracare</td><td>Soluzione di sviluppo per il saggio di formazione del fuoco</td></tr><tr><td>Vero</td><td>CCL-81</td><td>Collezione</td> <td>di colture di tipo americanoLinea cellulare di mammifero per amplificare il virus e condurre un test infettivo</td></tr><tr><td>Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6]</td><td>CRL-1586</td><td>American Type Culture Collection</td><td>Linea cellulare di mammifero per amplificare il virus e condurre test infettivi</td></tr></tbody></table>

analisi di competenza vettoriale sulle zanzare aedes aegypti utilizzando il virus zika

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Le procedure presentate descrivono una metodologia generalizzata per infettare le zanzare Aedes aegypti con il virus Zika in condizioni di laboratorio per determinare il tasso di infezione, l'infezione disseminata e la potenziale trasmissione del virus nella popolazione di zanzare in questione. Queste procedure sono ampiamente utilizzate con varie modifiche nelle valutazioni delle competenze vettoriali a livello globale. Sono importanti nel determinare il ruolo potenziale che una data zanzara (cioè specie, popolazione, individuo) può svolgere nella trasmissione di un determinato agente.

Tre popolazioni di Ae. aegypti provenienti dalle Americhe (Salvador, Brasile; Repubblica Dominicana; e la Valle del Rio Grande, TX, USA) sono state esposte a un ceppo epidemico di ZIKV dalle Americhe (ZIKV Mex 1-7, Stato del Chiapas, Messico, 2015) su una gamma di titoli di farina di sangue (4, 5 e 6 log10 FFU / mL) presentati in una farina di sangue artificiale a base di eritrociti umani lavati. Nei giorni 2, 4, 7, 10 e 14 postnfection, sottoinsiemi di zanzare sono stati elaborati per determinare l'i...

Il protocollo presentato può determinare la competenza vettoriale delle popolazioni di zanzare Aedes aegypti per un dato virus, come Zika, in un ambiente di contenimento.

Analisi di competenza vettoriale sulle zanzare Aedes aegypti utilizzando il virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

In caso di focolai mediati da arbovirus, le contromisure sono in gran parte limitate alla riduzione delle popolazioni di zanzare. Pertanto, le analisi della competenza vettoriale rappresentano strategie di prevenzione fondamentali, poiché determinano quali popolazioni e specie di zanzare possono agire da vettori per un determinato arbovirus e, di conseguenza, dovrebbero essere bersaglio degli interventi. Uno dei componenti più importanti del nostro arsenale per valutare il ruolo delle zanzare e di altri vettori nella trasmissione delle malattie infettive è quindi lo studio della competenza vettoriale. Si tratta di esperimenti in cui è possibile controllare con grande precisione non soltanto la specie di zanzara o di zecca, ad esempio, ma anche ceppi geografici, nonché ceppi molto specifici di un diverso virus o altro organismo infettivo, al fine di ottenere dati precisi e ben controllati sul rischio rappresentato da diverse specie nella trasmissione di diversi agenti in aree molto specifiche del mondo. Il lavoro con zanzare infette richiede strutture dedicate, formazione, esperienza e una pianificazione accurata per minimizzare i rischi per l’operatore, oltre al pericolo di rilascio accidentale di zanzare infette. È pertanto estremamente importante che i nuovi operatori che accedono a tali strutture impieghino del tempo lavorando con zanzare alimentate con sangue non infetto, per familiarizzare con le tecniche e il flusso di lavoro.Nel giorno dell'esposizione, accendere la fonte di alimentazione in un impianto di contenimento per artropodi per preriscaldare le unità di alimentazione. Combinare sangue umano appena raccolto citrato o eparinizzato con un ceppo virale in rapporto volumetrico uno a uno, e ricoprire un'unità standard di riserva da tre millilitri con la pelle di un topo naïve non infetto. Posizionare il serbatoio coperto su tovaglioli di carta bianca, e aggiungere circa due millilitri di sangue infetto al serbatoio, un millilitro alla volta.Quindi, ispezionare con tovaglioli di carta per verificare che non ci siano perdite. 24 ore prima di eseguire il saggio infettivo, preparare piastre per colture cellulari a 24 pozzetti con cellule Vero e contrassegnare ogni pozzetto con l'identità della zanzara e del campione. Al mattino in cui le zanzare verranno esposte al pasto ematico infetto, rimuovere le palline di cotone sature di acqua e fissare i serbatoi con i pasti ematici artificiali ai collegamenti dell'unità di alimentazione mediante una scatola guanto in plastica trasparente.Posizionare il cartone con le zanzare a digiuno nella cappa a flusso laminare sotto l'unità di alimentazione. Al termine dell'alimentazione, rimuovere il serbatoio e immergerlo in una soluzione di candeggina al 10% appena preparata. All'interno della cappa, versare le zanzare anestetizzate a freddo in una piastra di Petri su ghiaccio e separare le zanzare sazie da quelle non sazie.Versare le zanzare sazie nuovamente nel contenitore di cartone, coprendolo rapidamente con una rete e un coperchio. Tagliare l'eccesso di rete dal cartone e fissare il coperchio con del nastro adesivo. Aggiungere una pallina di cotone saturata con saccarosio sterile filtrato al 10% sulla rete e posizionare il cartone in un contenitore secondario di plastica di grandi dimensioni con una spugna umida per mantenere l'umidità.Incubare il contenitore secondario a 27 gradi Celsius, consentendo alle zanzare un accesso libitum al saccarosio fino al completamento degli esperimenti. Utilizzare un aspiratore meccanico per ottenere un numero predeterminato di zanzare incubate dal cartone, chiudendo il tubo di raccolta con un batuffolo di cotone al termine. Lavorando all'interno della cappa a flusso laminare, versare le zanzare anestetizzate a freddo in una piastra di Petri posta sul ghiaccio.Rimuovere tutte e sei le zampe di ciascun moscerino e posizionarle in un tubo microcentrifugato da due millilitri pre-etichettato, contenente un cuscinetto di acciaio inox sterilizzato e 500 microlitri di mezzo di raccolta per zanzare, o MCM. Posizionare delicatamente il moscerino su una goccia di olio minerale, avendo cura che l'olio non entri in contatto con la testa o il proboiscide. Inserire il proboiscide in una punta di pipetta microliter contenente 10 microlitri di FBS inattivato termicamente e lasciare che il moscerino salivi per 30 minuti.Espellere il puntale della pipetta con la saliva in una provetta da microcentrifuga contenente 100 microlitri di MCM e posizionare la carcassa in una provetta separata da due millimetri con la sfera di acciaio sterilizzata e 500 microlitri di MCM. Trasportare le provette in un omogeneizzatore tissutale a perle all'interno di una cappa a sicurezza biologica e triturare tutti i campioni di corpo e zampe a 26 hertz per cinque minuti per liberare le particelle virali nel soprannatante. Clarificare tutti i campioni mediante centrifugazione a 200 ×g per cinque minuti per formare un pellet di detriti cellulari.Immediatamente prima dell'inoculazione con i campioni, rimuovere il terreno di coltura dalle cellule Vero precedentemente preparate. Aliquotare con attenzione 100 microlitri di supernatanti chiarificati dai corpi o dalle zampe in ciascun pozzetto, avendo cura di non disturbare il detrito cellulare di zanzara presente nel pellet. Successivamente, incubare le piastre per un'ora.Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di soluzione di metilcellulosa in ogni pozzetto e reinserire le piastre nell'incubatore per tre-sette giorni. Rimuovere le piastre dalla cappa incubatrice e portarle in una cappa a sicurezza biologica. Smaltire la soluzione di metilcellulosa in un vassoio contenente candeggina al 10% e lavare ogni pozzetto due volte con PBS, smaltendo ogni lavaggio nel vassoio.Rimuovere il PBS e aggiungere un millilitro di metanolo-acetone per pozzetto, lasciando le cellule fissare sulla piastra per 30 minuti. Successivamente, eliminare il fissativo e lasciare asciugare le piastre. Lavare ogni pozzetto tre volte con PBS non sterile su un agitatore orbitale per 15 minuti per ogni lavaggio, quindi aggiungere un millilitro di soluzione bloccante in ogni pozzetto e agitare la piastra per altri 15 minuti.Aggiungere 100 microlitri di anticorpo primario anti-virus Zika o anti-flavivirus in ogni pozzetto e incubare la piastra con movimento oscillatorio durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere l'anticorpo primario e ripetere i lavaggi con PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 microlitri di anticorpi secondari e incubare la piastra con movimento oscillatorio per un'ora.Ripetere i lavaggi con PBS, quindi aggiungere 100 microlitri di reagente di sviluppo del substrato per ogni pozzetto e agitare la piastra per 15 minuti. Quando si sviluppano i focolai o le placche, arrestare la reazione risciacquando la piastra con acqua del rubinetto. Svuotare l'acqua del rubinetto e lasciare asciugare le piastre all'aria, quindi quantificare i focolai virali per determinare il numero di unità formanti focolai presenti nel campione analizzato.Tre popolazioni di zanzare sono state esposte a un ceppo epidemico del virus Zika con diverse concentrazioni nel pasto ematico. Nelle due settimane successive, sottogruppi di zanzare sono stati analizzati per determinare l'infezione, la disseminazione e il potenziale tasso di trasmissione. Alle concentrazioni più basse nel pasto ematico, le zanzare provenienti da Salvador, in Brasile, sono risultate infette dopo 4, 10 e 14 giorni di incubazione estrinseca, senza evidenza di infezione disseminata osservata nelle zampe analizzate.All'altissimo titolo, il virus &egrave; stato rilevato nelle zampe delle zanzare, ma non nella saliva. Le zanzare della Repubblica Dominicana si sono rivelate le pi&ugrave; suscettibili all'infezione e le pi&ugrave; competenti nella trasmissione a tutti i titoli del pasto ematico testati. Le zanzare alimentate con tutte e tre le dosi hanno dimostrato una disseminazione entro sette giorni e una competenza trasmissiva a 14 giorni dall'infezione.Zanzare della Valle del Rio Grande in Texas, esposte a titoli più bassi di pasto ematico, sono state infettate già a partire da quattro giorni post infezione, mentre infezioni disseminate sono state riscontrate dopo 14 giorni. Nel gruppo esposto al titolo più elevato, l'infezione è stata osservata a partire dal secondo giorno post infezione, raggiungendo picchi ai giorni 4, 10 e 14. Infezioni disseminate sono state osservate al settimo giorno, e soltanto una singola zanzara è risultata in grado di trasmettere il virus al giorno 10.Quando si tenta questo protocollo, è importante lavorare in sicurezza, piuttosto che rapidamente. Pertanto, maneggiare sempre le zanzare infette o potenzialmente infette all'interno di una cappa a flusso laminare o di una cappa di sicurezza biologica, fino a quando non sono state loro rimosse le zampe o le ali. Il flusso di lavoro di base per la valutazione della capacità vettoriale può essere adattato per produrre zanzare infette destinate ad analisi successive, come studi sulla trasmissione, nonché per esaminare le interazioni tra zanzare, il virus e il microbioma.La competenza vettoriale è stata uno strumento davvero importante per comprendere il ruolo dei moscerini nella trasmissione dei virus durante le epidemie di malattie virali, e questo è stato vero per molti decenni. Tuttavia, si tratta anche di un metodo che si è evoluto nel tempo per includere nuove informazioni, man mano che le acquisiamo, sulle interazioni tra questi virus e i vettori zanzarini. Solo per fare due esempi, la popolazione genetica del virus e la complessità della popolazione all'interno della zanzara si sono rivelate molto importanti per la sua capacità di trasmettere il virus, e ora possiamo includere questi aspetti negli studi sulla competenza vettoriale grazie a nuovi metodi per il sequenziamento della popolazione virale.Ora sappiamo anche che la popolazione di batteri e altri organismi che vivono nel tratto gastrointestinale della zanzara può avere un impatto significativo sulla loro capacità di trasmettere patogeni, e possiamo valutare tale popolazione grazie a nuovi metodi di sequenziamento. Pertanto, la competenza vettoriale è un metodo che si è evoluto e continua a evolversi man mano che approfondiamo la conoscenza di queste interazioni complesse.

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