Analisi di competenza vettoriale sulle zanzare Aedes aegypti utilizzando il virus Zika

In caso di focolai mediati da arbovirus, le contromisure sono in gran parte limitate alla riduzione delle popolazioni di zanzare. Pertanto, le analisi della competenza vettoriale rappresentano strategie di prevenzione fondamentali, poiché determinano quali popolazioni e specie di zanzare possono agire da vettori per un determinato arbovirus e, di conseguenza, dovrebbero essere bersaglio degli interventi. Uno dei componenti più importanti del nostro arsenale per valutare il ruolo delle zanzare e di altri vettori nella trasmissione delle malattie infettive è quindi lo studio della competenza vettoriale. Si tratta di esperimenti in cui è possibile controllare con grande precisione non soltanto la specie di zanzara o di zecca, ad esempio, ma anche ceppi geografici, nonché ceppi molto specifici di un diverso virus o altro organismo infettivo, al fine di ottenere dati precisi e ben controllati sul rischio rappresentato da diverse specie nella trasmissione di diversi agenti in aree molto specifiche del mondo. Il lavoro con zanzare infette richiede strutture dedicate, formazione, esperienza e una pianificazione accurata per minimizzare i rischi per l’operatore, oltre al pericolo di rilascio accidentale di zanzare infette. È pertanto estremamente importante che i nuovi operatori che accedono a tali strutture impieghino del tempo lavorando con zanzare alimentate con sangue non infetto, per familiarizzare con le tecniche e il flusso di lavoro.

Nel giorno dell'esposizione, accendere la fonte di alimentazione in un impianto di contenimento per artropodi per preriscaldare le unità di alimentazione. Combinare sangue umano appena raccolto citrato o eparinizzato con un ceppo virale in rapporto volumetrico uno a uno, e ricoprire un'unità standard di riserva da tre millilitri con la pelle di un topo naïve non infetto. Posizionare il serbatoio coperto su tovaglioli di carta bianca, e aggiungere circa due millilitri di sangue infetto al serbatoio, un millilitro alla volta.

Quindi, ispezionare con tovaglioli di carta per verificare che non ci siano perdite. 24 ore prima di eseguire il saggio infettivo, preparare piastre per colture cellulari a 24 pozzetti con cellule Vero e contrassegnare ogni pozzetto con l'identità della zanzara e del campione. Al mattino in cui le zanzare verranno esposte al pasto ematico infetto, rimuovere le palline di cotone sature di acqua e fissare i serbatoi con i pasti ematici artificiali ai collegamenti dell'unità di alimentazione mediante una scatola guanto in plastica trasparente.

Posizionare il cartone con le zanzare a digiuno nella cappa a flusso laminare sotto l'unità di alimentazione. Al termine dell'alimentazione, rimuovere il serbatoio e immergerlo in una soluzione di candeggina al 10% appena preparata. All'interno della cappa, versare le zanzare anestetizzate a freddo in una piastra di Petri su ghiaccio e separare le zanzare sazie da quelle non sazie.

Versare le zanzare sazie nuovamente nel contenitore di cartone, coprendolo rapidamente con una rete e un coperchio. Tagliare l'eccesso di rete dal cartone e fissare il coperchio con del nastro adesivo. Aggiungere una pallina di cotone saturata con saccarosio sterile filtrato al 10% sulla rete e posizionare il cartone in un contenitore secondario di plastica di grandi dimensioni con una spugna umida per mantenere l'umidità.

Incubare il contenitore secondario a 27 gradi Celsius, consentendo alle zanzare un accesso libitum al saccarosio fino al completamento degli esperimenti. Utilizzare un aspiratore meccanico per ottenere un numero predeterminato di zanzare incubate dal cartone, chiudendo il tubo di raccolta con un batuffolo di cotone al termine. Lavorando all'interno della cappa a flusso laminare, versare le zanzare anestetizzate a freddo in una piastra di Petri posta sul ghiaccio.

Rimuovere tutte e sei le zampe di ciascun moscerino e posizionarle in un tubo microcentrifugato da due millilitri pre-etichettato, contenente un cuscinetto di acciaio inox sterilizzato e 500 microlitri di mezzo di raccolta per zanzare, o MCM. Posizionare delicatamente il moscerino su una goccia di olio minerale, avendo cura che l'olio non entri in contatto con la testa o il proboiscide. Inserire il proboiscide in una punta di pipetta microliter contenente 10 microlitri di FBS inattivato termicamente e lasciare che il moscerino salivi per 30 minuti.

Espellere il puntale della pipetta con la saliva in una provetta da microcentrifuga contenente 100 microlitri di MCM e posizionare la carcassa in una provetta separata da due millimetri con la sfera di acciaio sterilizzata e 500 microlitri di MCM. Trasportare le provette in un omogeneizzatore tissutale a perle all'interno di una cappa a sicurezza biologica e triturare tutti i campioni di corpo e zampe a 26 hertz per cinque minuti per liberare le particelle virali nel soprannatante. Clarificare tutti i campioni mediante centrifugazione a 200 ×g per cinque minuti per formare un pellet di detriti cellulari.

Immediatamente prima dell'inoculazione con i campioni, rimuovere il terreno di coltura dalle cellule Vero precedentemente preparate. Aliquotare con attenzione 100 microlitri di supernatanti chiarificati dai corpi o dalle zampe in ciascun pozzetto, avendo cura di non disturbare il detrito cellulare di zanzara presente nel pellet. Successivamente, incubare le piastre per un'ora.

Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di soluzione di metilcellulosa in ogni pozzetto e reinserire le piastre nell'incubatore per tre-sette giorni. Rimuovere le piastre dalla cappa incubatrice e portarle in una cappa a sicurezza biologica. Smaltire la soluzione di metilcellulosa in un vassoio contenente candeggina al 10% e lavare ogni pozzetto due volte con PBS, smaltendo ogni lavaggio nel vassoio.

Rimuovere il PBS e aggiungere un millilitro di metanolo-acetone per pozzetto, lasciando le cellule fissare sulla piastra per 30 minuti. Successivamente, eliminare il fissativo e lasciare asciugare le piastre. Lavare ogni pozzetto tre volte con PBS non sterile su un agitatore orbitale per 15 minuti per ogni lavaggio, quindi aggiungere un millilitro di soluzione bloccante in ogni pozzetto e agitare la piastra per altri 15 minuti.

Aggiungere 100 microlitri di anticorpo primario anti-virus Zika o anti-flavivirus in ogni pozzetto e incubare la piastra con movimento oscillatorio durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere l'anticorpo primario e ripetere i lavaggi con PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 microlitri di anticorpi secondari e incubare la piastra con movimento oscillatorio per un'ora.

Ripetere i lavaggi con PBS, quindi aggiungere 100 microlitri di reagente di sviluppo del substrato per ogni pozzetto e agitare la piastra per 15 minuti. Quando si sviluppano i focolai o le placche, arrestare la reazione risciacquando la piastra con acqua del rubinetto. Svuotare l'acqua del rubinetto e lasciare asciugare le piastre all'aria, quindi quantificare i focolai virali per determinare il numero di unità formanti focolai presenti nel campione analizzato.

Tre popolazioni di zanzare sono state esposte a un ceppo epidemico del virus Zika con diverse concentrazioni nel pasto ematico. Nelle due settimane successive, sottogruppi di zanzare sono stati analizzati per determinare l'infezione, la disseminazione e il potenziale tasso di trasmissione. Alle concentrazioni più basse nel pasto ematico, le zanzare provenienti da Salvador, in Brasile, sono risultate infette dopo 4, 10 e 14 giorni di incubazione estrinseca, senza evidenza di infezione disseminata osservata nelle zampe analizzate.

All'altissimo titolo, il virus è stato rilevato nelle zampe delle zanzare, ma non nella saliva. Le zanzare della Repubblica Dominicana si sono rivelate le più suscettibili all'infezione e le più competenti nella trasmissione a tutti i titoli del pasto ematico testati. Le zanzare alimentate con tutte e tre le dosi hanno dimostrato una disseminazione entro sette giorni e una competenza trasmissiva a 14 giorni dall'infezione.

Zanzare della Valle del Rio Grande in Texas, esposte a titoli più bassi di pasto ematico, sono state infettate già a partire da quattro giorni post infezione, mentre infezioni disseminate sono state riscontrate dopo 14 giorni. Nel gruppo esposto al titolo più elevato, l'infezione è stata osservata a partire dal secondo giorno post infezione, raggiungendo picchi ai giorni 4, 10 e 14. Infezioni disseminate sono state osservate al settimo giorno, e soltanto una singola zanzara è risultata in grado di trasmettere il virus al giorno 10.

Quando si tenta questo protocollo, è importante lavorare in sicurezza, piuttosto che rapidamente. Pertanto, maneggiare sempre le zanzare infette o potenzialmente infette all'interno di una cappa a flusso laminare o di una cappa di sicurezza biologica, fino a quando non sono state loro rimosse le zampe o le ali. Il flusso di lavoro di base per la valutazione della capacità vettoriale può essere adattato per produrre zanzare infette destinate ad analisi successive, come studi sulla trasmissione, nonché per esaminare le interazioni tra zanzare, il virus e il microbioma.

La competenza vettoriale è stata uno strumento davvero importante per comprendere il ruolo dei moscerini nella trasmissione dei virus durante le epidemie di malattie virali, e questo è stato vero per molti decenni. Tuttavia, si tratta anche di un metodo che si è evoluto nel tempo per includere nuove informazioni, man mano che le acquisiamo, sulle interazioni tra questi virus e i vettori zanzarini. Solo per fare due esempi, la popolazione genetica del virus e la complessità della popolazione all'interno della zanzara si sono rivelate molto importanti per la sua capacità di trasmettere il virus, e ora possiamo includere questi aspetti negli studi sulla competenza vettoriale grazie a nuovi metodi per il sequenziamento della popolazione virale.

Ora sappiamo anche che la popolazione di batteri e altri organismi che vivono nel tratto gastrointestinale della zanzara può avere un impatto significativo sulla loro capacità di trasmettere patogeni, e possiamo valutare tale popolazione grazie a nuovi metodi di sequenziamento. Pertanto, la competenza vettoriale è un metodo che si è evoluto e continua a evolversi man mano che approfondiamo la conoscenza di queste interazioni complesse.