Un approccio da banco all'apertura della barriera ematica specifica della posizione utilizzando ultrasuoni focalizzati in un modello di ratto

Gli ultrasuoni focalizzati con agenti microbolli possono aprire la barriera ematica in modo focale e transitorio. Questa tecnica è stata utilizzata per fornire una vasta gamma di agenti attraverso la barriera eencefalica. Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la consegna localizzata al cervello del roditore con o senza guida per la risonanza prima.

Gli ultrasuoni focalizzati in combinazione con microbolle circolanti possono essere utilizzati per fornire aperture temporanee di dimensioni millimetriche nella barriera emato-encefalica. Ciò consente la somministrazione non invasiva di agenti circolanti sistemicamente alle regioni cerebrali bersaglio. Per iniziare, riempi il tappo del catetere con soluzione fisiologica e riscalda la coda del topo con una lampada, facendo attenzione a non surriscaldare l'animale.

Inserire un catetere della vena caudale da 24 gauge che verrà utilizzato per erogare microbolle, colorante blu Evans, contrasto MRI con gadobutrolo se si utilizza la risonanza magnetica e l'agente sperimentale di interesse. Il sangue riempirà la guaina quando la vena viene colpita. Lentamente, rimuovere l'ago interno mentre si spinge la guaina più in profondità nella vena.

Avvitare il tappo del catetere all'estremità della porta del catetere, non appena la porta si è riempita di sangue. Avvolgere con cura il nastro adesivo da laboratorio attorno al catetere e alla coda per tenerlo in posizione, iniziando con un piccolo pezzo in alto e lavorando in direzione caudale. Lasciare esposta l'estremità del tappo del catetere.

Collegare la linea di anestesia al connettore per anestesia sul telaio stereotassico. Quindi fissa la testa dell'animale nel telaio posizionando la bocca sulla barra del morso e guidando le barre auricolari in entrambi i canali uditivi e stringendo le viti di fermo. Sposta l'animale sul letto della risonanza magnetica.

Utilizzando i parametri descritti nel manoscritto del testo, raccogli immagini pesate in T2 coronale e assiale che catturano l'intero cervello e il fiduciale MRI per le misurazioni delle coordinate. Sulle immagini coronali, trova l'immagine in cui il fiduciale è il più grande, indicando il centro del fiduciale. Registrare la distanza dalla parte superiore del fiduciale alla regione cerebrale di interesse in millimetri, sia in direzione mediale-laterale che in direzione dorsale-ventrale.

Sulle immagini assiali, trova l'immagine che mostra la parte superiore del fiduciale e registra le coordinate X e Y per il centro del fiduciale e le coordinate X e Y della regione cerebrale di interesse. Calcolare la distanza dal centro del fiduciale alla regione del cervello bersaglio sia nella direzione rostrale-caudale che in quella mediale-laterale. Dopo aver raccolto le coordinate, raccogliere le immagini pre-scansione.

Mantenendo l'animale in questa cornice stereotassica, trasportalo rapidamente dal letto MRI all'allestimento FUS da banco. Assicurarsi che l'animale rimanga addormentato sotto l'effetto dell'anestesia. Far scorrere il telaio nel supporto del telaio e farlo scattare saldamente in posizione.

Usa il tagliacapelli per radere la testa dell'animale, quindi spazzola via i peli in eccesso e applica la crema depilatoria sul cuoio capelluto. Lascialo riposare per tre minuti e asciugalo con acqua e garza. Se si utilizza la guida MRI, collegare il puntatore e spostarlo nella posizione del fiduciale MRI.

Posizionare il puntatore nella parte superiore e centrale del fiduciale MRI, che è il punto da cui sono state calcolate tutte le distanze nell'immagine MRI. Rimuovere il puntatore e spostare il posizionatore sulle coordinate mediale-laterale e sulle coordinate rostrale-caudali. Leccare il pulsante della posizione nulla e sollevare il posizionatore premendo il pulsante su 50, per consentire il posizionamento del bagnomaria e del gel per ultrasuoni.

Applicare il gel per ultrasuoni sul cuoio capelluto dell'animale e posizionare il bagnomaria sull'animale, con la finestra del nastro di poliimmide premuta sul gel, assicurandosi che non ci siano bolle d'aria nel gel. Riempire il bagnomaria con acqua degassata. Se si utilizza il trasduttore ad alta potenza, abbassare il posizionatore in modo che il magnete sia appena sopra l'acqua.

Fissare il trasduttore al posizionatore abbassandolo con cautela nell'acqua ad angolo e collegando i magneti. Abbassare il posizionatore alla coordinata dorso-ventrale e accendere l'amplificatore di potenza RF. Iniettare un millilitro per chilogrammo di colorante blu Evans al 3% inserendo la punta di un ago nel tappo del catetere e iniettando.

L'intero animale dovrebbe diventare blu in pochi secondi, indicando che il catetere è posizionato correttamente nella vena caudale. Lasciare circolare il colorante per cinque minuti, quindi attivare le microbolle agitandole violentemente con lo scuotibolle. Capovolgere questa siringa più volte per ottenere una distribuzione uniforme delle microbolle, quindi collegare e riempire il set per infusione alato.

Posizionare la siringa sulla pompa di infusione e impostare la pompa di infusione in modo che eroghi 0,2 millilitri a una velocità di sei millilitri all'ora, fornendo un'infusione lenta delle microbolle nell'arco dei due minuti di esposizione FUS. Inserire l'ago alato nel tappo del catetere. Per prima cosa azionare la pompa di infusione, attendere tre secondi, quindi avviare il trattamento FUS premendo il pulsante di accensione e il generatore di funzioni.

Ripeti l'operazione due volte per regione con cinque minuti di intervallo per consentire alle microbolle di schiarirsi. Premere nuovamente il pulsante di accensione sul generatore di funzioni per interrompere il trattamento FUS quando la pompa di infusione si ferma dopo due minuti. Attendere cinque minuti affinché le microbolle si liberino, quindi iniziare l'infusione e il secondo trattamento FUS.

Immediatamente dopo il secondo trattamento FUS, iniettare gadobutrolo con mezzo di contrasto e l'agente di interesse. Il volume totale consegnato di tutti gli agenti non deve superare i cinque millilitri per chilogrammo. Per confermare l'apertura della BBB, riposizionare l'animale sul letto MRI nella stessa identica posizione e collegare la linea di anestesia.

Raccogliere le scansioni post-risonanza magnetica con gli stessi parametri di imaging delle immagini pre-scansione per confermare il miglioramento della risonanza magnetica con gadobutrolo nella regione di apertura della BEE. Questo protocollo è stato utilizzato per indurre l'apertura localizzata della barriera emato-encefalica sia con il trasduttore a immersione a bassa potenza che con il trasduttore a ultrasuoni focalizzati ad alta potenza. In primo luogo, il trasduttore a immersione a bassa potenza è stato mirato all'emisfero cerebrale anteriore o mediale.

Gli animali sono stati sacrificati con o senza perfusione e l'apertura della BBB è stata visualizzata tramite l'autofluorescenza del colorante blu Evans. Negli esperimenti successivi, il trasduttore FUS è stato mirato all'ippocampo o alla corteccia cingolata anteriore. Oltre al colorante blu di Evans, è stato utilizzato il mezzo di contrasto per risonanza magnetica gadobutrolo per verificare l'apertura mirata della BBB in VIVO.

Dopo che gli animali sono stati sacrificati, l'autofluorescenza del colorante blu Evans ha confermato il luogo di apertura. Per valutare se questa tecnica potesse essere utilizzata per la somministrazione genica mirata, sono stati iniettati nove AAV che esprimono la proteina fluorescente verde e il contrasto gadobutrolo immediatamente dopo l'apertura della barriera ematoencefalica nell'ippocampo. L'animale è stato sottoposto a imaging per verificare l'apertura con contrasto di gadobutrolo.

Quindi, la consegna genica è stata confermata dall'espressione della GFP. Questo protocollo offre un approccio da banco all'apertura della barriera emato-encefalica mediata da ultrasuoni a fuoco guidata da risonanza magnetica, che può essere facilmente adattata da altri laboratori per fornire un'alternativa traslazionale non invasiva alla chirurgia stereotassica.