Ricostruzione delle firme di fluorescenza innata unicellulare mediante microscopia confocale

Questa tecnica offre una ricerca unica per dimostrare l'identità o le caratteristiche fisiologiche della cellula a livello di singola cellula senza la necessità di marcature invasive. I principali vantaggi di questa tecnica sono che facilita la risoluzione spaziale a livello di singola cella per l'analisi e che consente la distinzione tra un processo di fondo. Quindi questa tecnica può potenzialmente contribuire all'identificazione e all'analisi fenotipica dei microbi patogeni.

Questa tecnica può essere applicata anche allo studio dell'eterogeneità fenotipica, o al monitoraggio dello stato fisiologico di popolazioni microbiche di interesse. A dimostrare la procedura sarà Kyosuke Takabe, un assistente professore del mio laboratorio. La microscopia a riflessione confocale e la configurazione della microspettroscopia confocale multicanale.

Collegare il microscopio confocale con i canali spettrali descansionati a un tubo fotomoltiplicatore. Dotare il microscopio di un obiettivo ad alta apertura numerica, con un ingrandimento adeguato. Inoltre, è possibile dotare il microscopio di uno specchio a semiriflessione per la microscopia a riflessione confocale, che si basa sulla dispersione cellulare della luce incidente per visualizzare la morfologia cellulare.

Per la microspettroscopia confocale multicanale, dotare il microscopio di specchi dicroici e utilizzare un misuratore di potenza laser per regolare l'intensità dell'illuminazione per ciascuna lunghezza d'onda di eccitazione. Quindi impostare l'uscita al microscopio in modo che sia costante attraverso le lunghezze d'onda di eccitazione. Per visualizzare i batteri attraverso il microscopio, impostare la dimensione del foro stenopeico su 1,0 unità di area nel software del microscopio e impostare il tempo di permanenza dei pixel per ciascuna lunghezza d'onda di eccitazione.

Impostare la risoluzione di scansione. Per le piccole cellule come i batteri, utilizzare un'area di scansione di 1024 per 1024. Impostare l'intervallo di scansione Z in modo che la regione di interesse sia coperta.

E utilizzando una finestra spettrale da 8 a 10 nanometri, impostare il rivelatore D-Scan per catturare la gamma di lunghezze d'onda visibili. Quindi acquisisci immagini di microspettroscopia confocale multicanale in una sequenza che va dalle lunghezze d'onda di eccitazione più lunghe a quelle più corte per creare Z-Stack di immagini a fluorescenza e immagini di microscopia a riflessione confocale e salva le immagini in formato tiff a 16 bit. Per eseguire la segmentazione cellulare e la ricostruzione di firme fluorescenti innate di singole cellule, aprire un programma software di analisi delle immagini appropriato e fare doppio clic per aprire uno degli script forniti.

Nella scheda dell'editor, fai clic su Esegui. Apparirà una finestra di selezione della cartella. Selezionare la directory in cui sono state salvate le immagini Z-Stack e fare clic su Apri.

Apparirà automaticamente una finestra di dialogo che richiede l'inserimento del parametro di segmentazione. Impostare la soglia di binarizzazione delle immagini su 0-1, la binarizzazione delle immagini su 0,45, la soglia superiore per una regione di cella su 200, la soglia inferiore per una regione di cella su 10 e il numero di rilevatori su 32. Apparirà una finestra di dialogo che richiede l'input per il numero di lunghezze d'onda di eccitazione.

Inserire il numero di lunghezze d'onda utilizzate per l'acquisizione dell'immagine e fare clic su OK. Apparirà una finestra di dialogo che richiede l'input per le lunghezze d'onda di eccitazione. Immettere le lunghezze d'onda di eccitazione in sequenza dalla più corta alla più lunga e fare clic su OK.

Apparirà una nuova finestra dell'immagine che presenta un'immagine di microscopia a riflessione confocale. Selezionare una regione di sfondo arbitraria da utilizzare per la sottrazione dello sfondo e disegnare un rettangolo all'interno dell'immagine di microscopia a riflessione confocale. Fare doppio clic all'interno della regione selezionata per confermare la selezione e individuare una nuova directory denominata firma.

Per eseguire le tecniche di riduzione dimensionale, create una directory vuota e denominatela parent_directory. Memorizza le firme fluorescenti di ciascuna delle due popolazioni di celle in due directory separate e apri l'interfaccia della riga di comando della workstation. Immettere il comando.

Quando viene visualizzata la sezione Seleziona directory di destinazione, selezionare l'parent_directory. Quindi, nella cartella parent_directory, individua il PCA. png, che conterrà il grafico di analisi dei componenti principali risultante.

Qui, viene mostrata una tipica firma fluorescente a singola cellula di una cellula batterica presentata come un tradizionale grafico dello spettro e come una mappa di calore. In questa figura, si può osservare una segmentazione cellulare 2D imprecisa sovrapposta all'immagine originale al microscopio a riflessione confocale di una popolazione di batteri del suolo. Con le firme fluorescenti innate risultanti per la popolazione presentate come una mappa di calore.

Si noti che la variabilità all'interno della popolazione era relativamente minore dopo una segmentazione cellulare di successo. Qui, viene mostrato un esempio di segmentazione cellulare imprecisa sovrapposta alla stessa popolazione di P.putida come mostrato in precedenza. L'impatto dell'imprecisa segmentazione cellulare sulle firme fluorescenti innate della popolazione è immediatamente evidente dal numero considerevole di valori anomali osservati nella corrispondente mappa di calore.

Una segmentazione cellulare imprecisa si traduce in un cluster più sciolto dopo l'analisi dei componenti principali, rispetto al cluster di tipo ottenuto dopo un'accurata segmentazione cellulare. Nonostante le piccole variabilità della firma fluorescente innata osservate all'interno dei singoli ceppi batterici, ogni popolazione forma un cluster distinto sul grafico di analisi dei componenti principali. In questa figura, si può osservare una segmentazione cellulare 3D imprecisa sovrapposta all'immagine originale al microscopio a riflessione confocale di una popolazione di lievito in gemmazione Saccharomyces cerevisiae YM4271.

Si noti la mancanza di valori anomali e le conseguenti firme fluorescenti innate per la popolazione. È essenziale acquisire un'immagine il più pulita possibile mediante microscopia confocale ed evitare una saturazione dell'intensità del segnale in quanto il rumore può rovinare l'accuratezza delle analisi successive. È possibile addestrare modelli di machine learning con il set di dati di firma occidentale innato da utilizzare in attività di classificazione o previsione, offrendo un'analisi della popolazione senza tag e una previsione fenotipica.