Valutazione dello stress ossidativo in campioni biologici utilizzando il test delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico

Pertanto, il test TBARS è utilizzato al meglio per la valutazione generale intra-laboratorio dello stress ossidativo nei campioni biologici, in cui i livelli relativi di TBARS vengono confrontati direttamente tra campioni che sono stati conservati ed elaborati insieme. Questi test hanno un costo estremamente basso di circa 3 per testare 96 campioni rispetto ai kit disponibili in commercio, che costano circa 400, e consentono di analizzare un solo lotto di campioni. Il metodo qui descritto può essere ulteriormente adattato per applicazioni specifiche, tra cui campioni biologici, studi di stabilità e quelle per le quali l'aggiunta di antiossidanti o altri tipi di conservanti per campioni prima dell'analisi è appropriata o obbligatoria.

Per evitare risultati molto variabili, preparare reagenti freschi, assicurandosi che il pH non sia superiore a quattro per i reagenti colorati e rimuovere eventuali bolle nella piastra di rigonfiamento nidese prima di misurare l'assorbanza. Iniziare preparando una soluzione acquosa allo 0,8% di acido tiobarbiturico. Preparare una soluzione di idrossido di sodio a cinque molari sciogliendo quattro grammi di perle di idrossido di sodio in 20 millilitri di acqua.

Conservare la soluzione in un contenitore di plastica. Dovrebbe essere preparato al momento per ogni lotto. Aggiungere quattro grammi di acido tiobarbiturico a 450 millilitri di acqua deionizzata e utilizzare un'ancoretta magnetica per scioglierlo delicatamente.

Aggiungere lentamente circa quattro millilitri di soluzione di idrossido di sodio con incrementi di 100 microlitri, controllando il pH man mano che le particelle di acido tiobarbiturico si dissolvono. Continuare ad aggiungere l'idrossido di sodio fino a quando tutte le particelle si dissolvono. Verificare che il pH della soluzione non sia superiore a quattro con una striscia di pH, quindi portare il volume finale a 500 millilitri con acqua deionizzata e conservare la soluzione acquosa di acido barbaro tiobarbiturico a temperatura ambiente.

Preparare soluzioni di curva standard MDA bis dimetil acetale in provette di polipropilene con tappo a scatto da due millilitri. Diluendo la soluzione madre da 200 micromolari in acqua come descritto nel manoscritto del testo. Vortice i campioni.

Etichettare le provette di vetro per i campioni da analizzare, quindi aggiungere 100 microlitri del campione preparato a ciascuna provetta. Aggiungere 200 microlitri di SDS all'8,1% a ciascun campione e far roteare delicatamente il tubo di vetro con un movimento circolare per mescolare. Aggiungere 1,5 millilitri di tampone molare di acetato di sodio da 3,5 molari a ciascun campione, quindi aggiungere 1,5 millilitri della soluzione acquosa di acido tiobarbiturico allo 0,8%.

Portare il finale in ogni provetta a quattro millilitri aggiungendo 700 microlitri di acqua deionizzata. Tappare bene i tubi di vetro e incubarli in un blocco riscaldante impostato a 95 gradi Celsius per un'ora. Coprire le provette con un foglio di alluminio per evitare la formazione di condensa, quindi rimuovere le provette dal blocco e incubarle sul ghiaccio per 30 minuti.

Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni e gli standard a 1.500 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire 150 microlitri di surnatante da ciascuna provetta in un pozzetto in una piastra da 96 pozzetti, rimuovendo eventuali bolle d'aria con il puntale della pipetta. Misurare l'assorbanza dei campioni a 532 nanometri, quindi sottrarre la lettura media dell'assorbente dei campioni bianchi da tutte le altre letture degli assorbenti.

Crea una curva standard e usala per calcolare le concentrazioni di campioni sconosciute. Le curve standard MDA bis dimetil acetolo sono state generate per determinare i limiti di rilevabilità e la sensibilità del test e i livelli di ossidazione in tre diversi campioni biologici. Un totale di 9 test TBARS sono stati eseguiti sui tre campioni in giorni diversi.

Per determinare i limiti di rilevamento, l'assorbanza dei campioni bianchi è stata misurata in tre giorni diversi. La concentrazione minima di sostanza TBARS necessaria per fornire un segnale rilevabile non assorbente del rumore è 1,1 micromolare. E la sensibilità del test è di circa 0,0016 unità assorbenti per aumento micromolare della concentrazione.

Il test TBARS può essere utilizzato per rilevare i cambiamenti nella perossidazione lipidica di varie matrici biologiche. Per dimostrare ciò, è stato utilizzato due cloruro di rame per indurre l'ossidazione in vitro dei lisati cellulari HEPG2 del siero umano e delle lipoproteine a bassa densità. È stato eseguito un test TBARS su campioni di LDL contenenti EDTA e i livelli di TBARS non sono cambiati tra i due campioni di rame trattati e non trattati.

Tuttavia, dopo che l'EDTA è stato rimosso mediante filtrazione a rotazione, l'LDL ha subito un'ossidazione mediata dal rame due. Per illustrare la gamma dinamica del test TBARS nel siero umano, è stata aggiunta ai campioni una concentrazione di due ioni millimolari di rame e due ioni, che ha portato a un aumento da sei a sette volte dei TBARS. Quando si tenta questo protocollo, non lasciare i campioni in ghiaccio per più di 10 minuti e lasciarli a temperatura ambiente dopo la centrifugazione.

Per lotti o sottoinsiemi di campioni biologici che non sono stati originariamente raccolti, elaborati e conservati insieme, è necessario valutare statisticamente i dati per gli effetti dei lotti per garantire che l'ossidazione artefattuale non abbia contribuito ai risultati. L'ossidazione in vitro quantificabile intenzionale delle lipoproteine a bassa densità consente di capire come l'ossidazione influisce sulla sua biologia funzionante.