Flypub Per studiare l'etanolo indotto disinibie comportamentali e sensibilitazione
18 maggio 2020
Il saggio Flypub misura i comportamenti che il volo della frutta che drosophila melanogaster mostra sotto l'influenza dell'etanolo. Il saggio può essere facilmente padroneggiato dagli sperimentatori a tutti i livelli e applicato a vari stimoli vaporizzati, facilitando l'abuso di sostanze e gli studi sulle dipendenze.
Il saggio Flypub misura comportamenti disinibiti sotto l'influenza dell'alcol. Facilitando così lo studio meccanicistico del disturbo da uso di alcol. L'alcol è una delle droghe più facilmente disponibili e ampiamente abusate al mondo.
Il meccanismo neurobiologico alla base del disturbo da uso di alcol, tuttavia, è incompleto compreso. La mosca della frutta, Drosophila melanogaster, è stata ampiamente utilizzata per studiare gli effetti dell'etanolo sull'euforia, la locomozione, la disinibizione e la sedazione. È anche usato per studiare i suoi cambiamenti lunghi e duraturi nel comportamento rilevanti per la dipendenza come tolleranza, sensibilizzazione e ricerca di etanolo.
Molti studi sulla Drosophila e su altri modelli animali si concentrano sugli effetti attivatori locomotori dell'etanolo. L'effetto distinto dell'etanolo è la disinibizione comportamentale. Tuttavia, il suo studio è piuttosto sottorappresentato.
Per affrontare questo problema chiave, abbiamo sviluppato il saggio Flypub per misurare il comportamento disinibito sotto l'influenza dell'etanolo. Per assemblare la camera Flypub, prendere una bottiglia rotonda e tagliare la parte inferiore di un segno da 25 millilitri con una lama di rasoio. Creare un foro al segno di 50 millilitri utilizzando un ferro da saldare a caldo.
Questo è il punto di accesso in cui verranno introdotte le mosche. Posizionare una rete rotonda di 54 millimetri di diametro al segno di 75 millilitri e fissarla utilizzando colla a caldo. Posizionare un foglio di plastica trasparente di 70 millimetri di diametro all'estremità inferiore aperta e fissarlo utilizzando la colla a caldo.
Per assicurarsi che il tondo di plastica sia saldamente attaccato al fondo, pressione verso il basso utilizzando pesi. Raccogli mosche maschili in un gruppo di 33. Posizionarli sul lato di una fiala alimentare.
Metterli in un incubatore di 25 gradi Celsius con almeno il 50% di umidità relativa e un ciclo buio di 12 ore, 12 ore per 2 giorni prima dell'esposizione all'etanolo. Preparare la stazione di dosaggio Flypub accendendo luci, un computer e una videocamera per la registrazione video. Prepara sei pub per una serie di esperimenti.
Etichettali con un numero da uno a sei. Introdurre delicatamente le mosche nel pub usando un piccolo imbuto. Chiudere il pub usando un nastro adesivo.
Acclimata le mosche per 10 minuti. Durante l'acclimatazione, regolare la messa a fuoco della fotocamera e registrare gli ultimi cinque minuti di acclimatazione. Durante l'acclimatazione preparare batuffoli di cotone per la consegna dell'etanolo.
Tagliare un batuffolo di cotone in quattro quadranti uguali e quindi tagliare gli angoli per adattarlo a una piastra di Petri. Aggiungere un batuffolo di cotone a una piastra di Petri. Aggiungere un millilitro di 95% di etanolo al batuffolo di cotone.
Assicurarsi che la soluzione di etanolo sia distribuita uniformemente su tutta l'area del pad. Coprire rapidamente la piastra di Petri con salviette da laboratorio. Posizionare con cura una piastra di Petri contenente etanolo sotto ogni pub.
Allineare i pub sul palco. Iniziare la registrazione e avviare contemporaneamente un timer. Registra fino a quando le mosche non smettono di corteggiare o muoversi.
Rimuovere l'etanolo contenente la piastra di Petri quando oltre il 90% delle mosche viene sedato. Trasferire delicatamente le mosche sedate di nuovo in fiale alimentari. Rimetterli nell'incubatrice.
Ripetere i passaggi precedenti ogni 24 ore per sei giorni consecutivi. Aprire il video utilizzando un lettore multimediale. Quindi segna il numero di maschi impegnati in attività di corteggiamento ogni 10 secondi.
Le attività di corteggiamento da segnare includono: estensione unilaterale dell'ala, catena di corteggiamento, cerchio di corteggiamento, piegatura addominale e montaggio. Sono mostrate registrazioni rappresentative del comportamento della mosca. Durante l'acclimatazione in cui i maschi non mostrano molta attività.
Durante la prima esposizione in cui i maschi mostrano un corteggiamento sporadico. E durante la sesta esposizione in cui i maschi mostrano corteggiamento di attività. Immettere il numero di maschi che visualizzano il corteggiamento in un blocco di dieci secondi.
Usa il numero massimo di maschi corteggiati in tre blocchi di tempo consecutivi di 10 secondi come punto dati rappresentativo. La media di 10 punti dati consecutivi con il valore più alto rappresenta la percentuale di corteggiamento intermale per pub. Il tipo selvatico Canton-S mostra un progressivo aumento delle attività di corteggiamento disinibito in caso di ripetuta esposizione all'etanolo.
Questo rappresenta la sensibilizzazione comportamentale all'effetto di disinibizione dell'etanolo. Abbiamo esaminato il ruolo dell'octopamina nella sensibilizzazione testando le mosche che mancano di tirammina beta-idrossilasi, T beta H, quindi carente di octopamina. Come canton-S, i mutanti T beta H mostrarono risposte crescenti alla ripetuta esposizione all'etanolo, ma ad un livello ridotto.
Quando abbiamo confrontato T beta H e Canton-S, abbiamo osservato che i maschi mutanti T beta H mostravano un corteggiamento meno disinibito rispetto ai maschi cantone-S in ogni esposizione indicando che l'octopamina può essere importante per la sensibilizzazione. Ora è possibile impostare, condurre e analizzare i comportamenti indotti dall'etanolo utilizzando il saggio Flypub. I punti chiave da tenere a mente includono, uno, un corretto assemblaggio del pub.
Due, consistente erogazione di etanolo, e tre, punteggio comportamentale preciso e imparziale. Il saggio Flypub ha molti vantaggi. È semplice, economico da configurare e facile da imparare.
Inoltre, più gruppi di mosche possono essere saggiati contemporaneamente, facilitando questo studio per identificare gli effetti delle manipolazioni genetiche o sperimentali. Il saggio Flypub è altamente attraebile dagli sperimentatori a tutti i livelli, comprese le scuole elementari, gli studenti universitari e laureati, i post-doc e la facoltà. In sintesi, il test Flypub ti permetterà di identificare giocatori molecolari, percorsi cellulari, circuiti cerebrali e fattori di rischio che contribuiscono al disturbo da uso di alcol.
Panoramica
L'assay Flypub misura comportamenti disinibiti nella mosca della frutta Drosophila melanogaster sotto l'effetto dell'etanolo. Questo assay è stato ideato per facilitare lo studio del disturbo da uso dell'alcol e può essere facilmente appreso da ricercatori di ogni livello.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia del Comportamento
- Ricerca sul Disturbo da Uso di Alcol
Sfondo
- L'alcol è ampiamente abusato, ma i suoi meccanismi neurobiologici non sono ancora completamente compresi.
- Drosophila melanogaster si serve come organismo modello per lo studio degli effetti dell'etanolo.
- Il saggio Flypub affronta specificamente lo studio poco rappresentato della disinibizione comportamentale causata dall'etanolo.
- Studi precedenti si sono concentrati principalmente sugli effetti locomotori piuttosto che sulla disinibizione.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per misurare il comportamento disinibito in risposta all'etanolo.
- Esplorare il ruolo dell'octopamina nella sensibilizzazione comportamentale legata all'esposizione all'alcol.
- Fornire un saggio semplice ed efficace per consentire ai ricercatori di studiare i meccanismi dell'addiction.
Metodi Utilizzati
- Assemblaggio della camera Flypub utilizzando una bottiglia modificata.
- Preparazione dei maschi di Drosophila per l'esposizione all'etanolo.
- Registrazione video del comportamento delle mosche durante le attività di corteggiamento.
- Valutazione dei comportamenti di corteggiamento per analizzare gli effetti di disinibizione.
Risultati principali
- I moscerini di tipo selvatico Canton-S hanno mostrato un aumento del corteggiamento disinibito con esposizioni ripetute all'etanolo.
- I mutanti T beta H hanno mostrato una riduzione della disinibizione rispetto a Canton-S, indicando il ruolo dell'octopamina.
- Il saggio permette il test simultaneo di più gruppi di moscerini.
- Una somministrazione costante di etanolo e una valutazione precisa sono fondamentali per ottenere risultati affidabili.
Conclusioni
- Il saggio Flypub è uno strumento prezioso per lo studio degli effetti dell'etanolo sul comportamento.
- Permette di identificare i meccanismi molecolari e cellulari coinvolti nel disturbo da uso di alcol.
- Il saggio è accessibile a ricercatori con diversi livelli di formazione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'assay Flypub colma una lacuna fondamentale nella ricerca sui disturbi da uso di alcol concentrandosi sull'instabilità comportamentale indotta dall'etanolo, un cambiamento adattativo chiave alla base della dipendenza. Permettendo la misurazione di un'accresciuta attività corteggiatrice disinibita in Drosophila melanogaster, questo assay supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nella fase iniziale della scoperta. La sua semplicità, scalabilità e compatibilità con gli strumenti genetici aumentano l'affidabilità predittiva nell'analisi dei percorsi e dei circuiti coinvolti nei meccanismi della dipendenza.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche misurando un comportamento disinibito aumentato come indicatore della sensibilizzazione all'etanolo.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale di bersagli genetici, come componenti della via dell'octopamina, attraverso fenotipi di ridotta disinibizione.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio quantificando la sensibilizzazione comportamentale tra diversi genotipi, facilitando la priorizzazione dei bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive, stabilendo risposte di base e risposte di disinibizione sensibilizzate.
- Valore operativo: Standardizza la somministrazione di etanolo e la valutazione del comportamento, garantendo la riproducibilità tra serie sperimentali e laboratori.
- Valore di scalabilità: Consente il test simultaneo di più gruppi di moscerini, facilitando la valutazione parallela di manipolazioni genetiche o farmacologiche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Collega la sensibilizzazione alla disinibizione nei moscerini ai modelli mammiferi di dipendenza, sostenendo la validazione incrociata delle specie per i bersagli.
- De-risking meccanicistico: Permette l'analisi dei fattori molecolari, dei percorsi cellulari e dei circuiti cerebrali coinvolti nei cambiamenti comportamentali indotti dall'etanolo.
- Continuità predittiva: Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio collegando la modulazione del bersaglio a fenotipi di disinibizione in seguito a esposizioni ripetute.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio Flypub si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto attivo, in particolare per bersagli correlati alla dipendenza che influenzano la regolazione del comportamento.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su geni e vie metaboliche coinvolti nella risposta all'etanolo, come la tirosina beta-idrossilasi e il segnale dell'octopamina.
- Screening: Garantisce prontezza per saggi grazie a camere standardizzate, preparazione costante dell'etanolo e valutazione quantificabile del corteggiamento ogni 10 secondi.
- Analisi: Produce misurazioni quantitative di variabili dipendenti—percentuale di corteggiamento intermaschile per pub—consentendo il confronto tra diverse condizioni e genotipi.
- Ricerca Translazionale: Collega la sensibilizzazione alla disinibizione a rilevanza preclinica modellando risposte amplificate simili a comportamenti da dipendenza.
- Riutilizzo Aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per valutare modificatori genetici, farmacologici o ambientali della risposta all'etanolo in diversi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dell'obiettivo riducendo l'ambiguità meccanicistica intorno alla sensibilizzazione da disinibizione.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso un assemblaggio standardizzato delle camere, un'erogazione controllata di etanolo e una valutazione comportamentale in cieco.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto fornendo fenotipi quantitativi basati sull'escalation che riflettono adattamenti neurobiologici rilevanti per la dipendenza.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei bersagli aggiustata per il rischio, in base al loro effetto sulle traiettorie di sensibilizzazione comportamentale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'allestimento di Drosophila, nell'osservazione del comportamento e nella valutazione basata su video.
- Richiede strumentazione per la somministrazione di etanolo, la registrazione video e il controllo ambientale (25°C, 50% di umidità, ciclo luce/buio di 12 ore).
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di ricerca dei criteri di corteggiamento e degli intervalli di valutazione per garantire la comparabilità dei dati.
- Implica considerazioni di adattamento quando il saggio viene esteso per misurare altri comportamenti indotti dall'etanolo oltre all'inibizione del corteggiamento.
- Comprende limitazioni pratiche come il bias del valutatore e la variabilità nella motivazione delle mosche, ridotte utilizzando il corteggiamento massimo osservato in blocchi di tempo consecutivi.
