Mappatura ad alta risoluzione delle interazioni proteina-DNA nei neuroni derivati dalle cellule staminali del topo utilizzando l'immunoprecipitazione-esonucleasi della cromatina (ChIP-Exo)
August 14th, 2020
La determinazione precisa delle posizioni di legame proteico in tutto il genoma è importante per comprendere la regolazione genica. Qui descriviamo un metodo di mappatura genomica che tratta il DNA immunoprecipitato di cromatina con digestione dell'esonucleasi (ChIP-exo) seguito da sequenziamento ad alta produttività. Questo metodo rileva le interazioni proteina-DNA con una risoluzione di mappatura vicina alla coppia di basi e un elevato rapporto segnale-rumore nei neuroni dei mammiferi.
Il vantaggio principale del nostro metodo ChIP-exo è la migliore risoluzione della mappatura delle interazioni proteina-DNA nella cellula rispetto al metodo convenzionale di immunoprecipitazione della cromatina. Per preparare le microsfere magnetiche di proteina G per ChIP, mescolare le microsfere magnetiche fino a renderle omogenee. Quindi aggiungere 25 microlitri di microsfere magnetiche a un tubo a basso legame proteico da due millilitri.
Aggiungere un millilitro di soluzione bloccante alle perline. Mescolare bene pipettando, quindi posizionare la provetta su una griglia magnetica per un minuto. Una volta che il surnatante è limpido, rimuoverlo.
Quindi, aggiungi un millilitro di soluzione bloccante alle perline. Posizionare il tubo su una piattaforma oscillante a quattro gradi Celsius e farlo oscillare per 10 minuti, quindi far girare brevemente il tubo. Posizionare la provetta sulla rastrelliera magnetica e rimuovere il surnatante.
Aggiungere 500 microlitri di soluzione bloccante alle perle magnetiche. Far girare brevemente l'anticorpo contro l'isola-1, quindi aggiungere quattro microgrammi di anticorpo al tubo contenente le perle magnetiche. Posizionare il tubo contenente le perle magnetiche e l'anticorpo Islet-1 su una piattaforma oscillante a quattro gradi Celsius e farlo oscillare per sei-24 ore.
Per iniziare l'immunoprecipitazione della cromatina, lavare le perle rivestite di anticorpo in un millilitro di soluzione bloccante. Posizionare il tubo contenente le perle rivestite di anticorpo su una piattaforma oscillante a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo una breve centrifuga, posizionare la provetta su una rastrelliera magnetica e rimuovere il surnatante.
Risospendere le perle rivestite di anticorpo in 50 microlitri di soluzione bloccante. Aggiungere un millilitro di lisati sonicati alle perle rivestite di anticorpi, quindi incubare il campione su una piattaforma oscillante a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo aver lasciato incubare il campione per una notte, raccogliere il liquido dal tappo facendo girare brevemente la provetta, quindi posizionare la provetta su una rastrelliera magnetica.
E dopo un minuto, rimuovere con cura il surnatante con una pipetta. Successivamente, eseguire una serie di lavaggi come segue. Aggiungere al campione un millilitro di tampone di lavaggio a freddo contenente CPI.
Mescolare il campione su una piattaforma oscillante a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Far girare brevemente la provetta del campione, quindi posizionarla su una rastrelliera magnetica. Dopo un minuto, rimuovere il surnatante con una pipetta.
Per la prima reazione enzimatica e la riparazione e la coda DA, aggiungere 38 microlitri di acqua distillata doppia autoclavata al campione, quindi aggiungere la miscela di reazione di fine preparazione e la miscela di enzimi di fine preparazione. Miscelare il contenuto della provetta mediante pipettaggio, quindi incubare il campione a 20 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, lavare le perle del campione con un tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale, un tampone di lavaggio al cloruro di litio e un tampone di cloruro di idrogeno Tris da 10 millimolari come descritto in precedenza.
Per eseguire la legatura dell'adattatore indice, aggiungere al campione 27 microlitri di tampone freddo di cloruro di idrogeno Tris da 10 millimolari. Quindi aggiungere l'adattatore indice, l'enhancer di legatura e la miscela master ligasi. Incubare il campione a 20 gradi Celsius per 15 minuti.
Anche in questo caso, lavare le perle del campione con un tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale, un tampone di lavaggio al cloruro di litio e un tampone di cloruro di idrogeno Tris da 10 millimolari. Quindi aggiungere al campione 47 microlitri di tampone freddo di cloruro di idrogeno Tris da 10 millimolari. Per riparare l'intaccatura nel DNA risultante dal legame fosfodiestere mancante, aggiungere 11,1 microlitri della miscela di riempimento al campione.
Incubare il campione a 30 gradi Celsius per 20 minuti. Dopo una serie di lavaggi, aggiungere al campione 50 microlitri di acqua fredda autoclavata doppia distillata. Per digerire il DNA ChIP nella direzione da cinque a tre prime, aggiungere il tampone esonucleasi lambda e l'esonucleasi lambda e miscelare il campione mediante pipettaggio.
Incubare il campione a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Al termine della digestione, ripetere i tre lavaggi un'ultima volta. Per eluire il campione di ChIP dalle sfere, risospendere il campione in 75 microlitri di tampone di eluizione ChIP e incubatore a 65 gradi Celsius per 15 minuti a 130 volte G.Aggiungere 2,5 microlitri di 20 milligrammi per millilitro di proteinasi K al campione.
Agitare brevemente il campione, quindi incubare per una notte a 65 gradi Celsius. Far girare brevemente il campione e posizionarlo su una rastrelliera magnetica. Dopo un minuto, trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri.
Purifica ed eluisce il DNA. Dopo aver purificato il DNA eluito, trasferire 16 microlitri del campione di DNA estratto in una provetta per PCR. Aggiungere al campione 1,2 microlitri di miscela di denaturazione e ricottura di primer.
Utilizzando il programma descritto nella tabella sei del manoscritto, denaturare e ricuocere i primer al DNA stampo. Aggiungere tre microlitri di miscela di estensione del primer al campione ed eseguire il programma PCR descritto nella tabella sette del manoscritto. Aggiungere 4,1 microlitri di DA tailing mix al campione ed eseguire il campione utilizzando il programma PCR nella tabella otto del manoscritto.
Quindi aggiungere 21,5 microlitri di miscela di legatura con adattatore universale al campione e incubare per 15 minuti a 20 gradi Celsius. Aggiungere 29 microlitri di miscela LM-PCR al campione, quindi eseguire il campione utilizzando il programma della tabella 10 del manoscritto. Dopo 18 cicli di LM-PCR, i campioni di ChIP-exo provenienti da motoneuroni di topo sono stati elettroforesi su un gel di agarosio all'1,5%.
I risultati per ChIP-exo Islet-1 hanno mostrato librerie di DNA amplificate da 200 a 400 coppie di basi, indicando che le librerie ChIP-exo sono state amplificate con successo dalla LM-PCR. La banda di circa 100 paia di basi rappresenta artefatti da adattatori e primer PCR. Il controllo senza anticorpi dimostra che il DNA di fondo non specifico è stato digerito dal trattamento con esonucleasi lambda.
Utilizzando ChIP-exo e ChIP-seq, sono state identificate le posizioni legate all'Islet-1. Il segnale ChIP-exo era altamente focalizzato nei siti di legame dell'Islet-1, rilevando più pattern di legame del fattore di trascrizione dell'Islet-1 raggruppati. Il segnale ChIP-seq mostrava segnali più ampi, indicando che ChIP-exo aveva una risoluzione di mappatura più elevata rispetto a ChIP-seq per Islet-1.
Più fattori di trascrizione spesso legano il DNA uno accanto all'altro come un complesso proteina-DNA. ChIP-exo ci permette di studiare come più fattori di trascrizione riconoscono e regolano il DNA bersaglio.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo di mappatura genomica che migliora la risoluzione delle interazioni proteina-DNA nei neuroni dei mammiferi. Utilizzando il DNA immunoprecipitato dalla cromatina trattato con digestione esonucleasica seguita da sequenziamento ad alto rendimento, il metodo raggiunge una risoluzione di mappatura quasi a livello di base-paio.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Genomica
- Regolazione genica
Contesto
- Comprendere le interazioni proteina-DNA è cruciale per la regolazione genica.
- I metodi convenzionali hanno limitazioni nella risoluzione della mappatura.
- ChIP-exo offre migliori capacità di rilevamento.
- Questo metodo è particolarmente utile nello studio dei neuroni dei mammiferi.
Obiettivo dello studio
- Migliorare la risoluzione della mappatura delle interazioni proteina-DNA.
- Fornire un metodo affidabile per la mappatura genomica.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi di regolazione genica.
Metodi utilizzati
- Immunoprecipitazione della cromatina seguita da digestione esonucleasica.
- Sequenziamento ad alto rendimento per l'acquisizione dei dati.
- Preparazione di perline magnetiche di proteina G per ChIP.
- Soluzioni di miscelazione e bloccaggio per un legame ottimale.
Risultati principali
- Raggiunto una risoluzione quasi a livello di base-paio nella mappatura.
- Dimostrato un elevato rapporto segnale-rumore nei risultati.
- Validato il metodo in contesti neuronali dei mammiferi.
- Fornito approfondimenti sulle interazioni proteina-DNA.
Conclusioni
- Il metodo ChIP-exo migliora significativamente la risoluzione della mappatura.
- Questa tecnica è vantaggiosa per lo studio della regolazione genica.
- Le future applicazioni potrebbero migliorare la nostra comprensione delle funzioni neuronali.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
High-resolution mapping of protein-DNA interactions enables precise target validation in early discovery by clarifying transcription factor binding sites with near base-pair accuracy. This reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies and supports predictive confidence in lead identification for neurological disease models. The method enhances de-risking of therapeutic hypotheses by distinguishing specific from non-specific genomic signals.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulatory mechanisms in disease-relevant neuronal systems.
- Operational Value: Provides high-sensitivity detection of protein-DNA binding with reduced background noise.
- Predictive Value: Supports functional target validation by mapping clustered transcription factor binding patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, high-resolution binding profiles for assay standardization.
- Operational Value: Produces reproducible DNA libraries suitable for downstream sequencing workflows.
- Scalability Value: Enables platform reuse across multiple transcription factors in neuronal models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links discovery-stage binding data to disease-relevant gene regulation in stem cell-derived neurons.
- Operational Value: Ensures continuity from target identification to preclinical validation via consistent genomic readouts.
- Risk Mitigation: Supports de-risking of mechanistic models by eliminating false-positive binding signals.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by delivering precise genomic binding data that informs target selection and prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through high-resolution mapping of transcription factor occupancy.
- Screening: Enables assay readiness via standardized, exonuclease-digested DNA libraries with uniform fragment sizes.
- Analytics: Delivers quantitative binding signals that allow comparison of protein-DNA interactions across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating binding sites in disease-relevant neuronal systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable genomic mapping capability for multiple targets in neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through near base-pair mapping resolution.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled exonuclease digestion and library preparation.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing false positives in binding site identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on high-confidence genomic binding data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin immunoprecipitation and enzymatic DNA processing.
- Dependent on access to magnetic bead handling, exonuclease enzymes, and high-throughput sequencing.
- Needs cross-team standardization for antibody validation and wash stringency.
- Adaptation considerations include optimization for different transcription factors and neuronal subtypes.
- Practical limitations include input DNA quality and antibody specificity affecting signal clarity.
