Isolamento delle cellule endocartali e coronarie dal muro libero ventricolare del cuore di ratto

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per isolare le cellule endocardiali e le cellule endoteliali coronarie separatamente dal cuore per aiutare le persone a comprendere l'espressione e la funzione genica specifica del tipo cellulare. I principali vantaggi di questo metodo sono l'elevata purezza e vitalità della CEE isolata e dei PEC e il fatto che le cellule mantengono le loro proprietà fisiologiche al momento dell'isolamento. I PEC e gli EEC differiscono sotto molti aspetti, quindi la capacità di indagare in modo indipendente queste popolazioni cellulari consente l'esplorazione di meccanismi specifici del tipo cellulare in varie malattie cardiache.

Questo metodo potrebbe facilitare lo studio di fattori trascrinomi ed epigenetici responsabili di numerose malattie cardiache in modo specifico del tipo cellulare. Le parti più difficili di questo metodo sono determinare le diverse porzioni cardiache e cronometrare correttamente la digestione per evitare la contaminazione del tipo di cellula. A dimostrare la procedura sarà Yifei Miao, un ricercatore del mio laboratorio.

Dopo aver raccolto i cuori da sei ratti Sprague Dawley da 50 a 100 grammi, lavare gli organi con 50 millilitri di HBSS freddo tre volte per rimuovere il sangue in eccesso e posizionare un cuore al microscopio sezionato. Posizionare il cuore sul suo viso posteriore più piatto per identificare i lati sinistro e destro del tessuto e localizzare l'arteria polmonare. Utilizzare le forbici per tagliare l'arteria polmonare fino alla camera ventricolare destra e tagliare lungo il setto fino a raggiungere l'apice.

Continuare a tagliare dall'apice sul lato posteriore del cuore lungo il setto fino a raggiungere la giunzione dell'arteria polmonare e la camera ventricolare destra. Partendo da questo punto, tagliare sia i lati anteriore che posteriore del cuore perpendicolarmente al punto di dissezione precedente e lontano dal setto fino a liberare la parete libera ventricolare destra dal resto del cuore. Quindi posizionare la parete libera ventricolare destra in un tubo da cinque millilitri di DMEM e localizzare nuovamente l'aorta per facilitare la raccolta della parete libera ventricolare sinistra nello stesso modo appena dimostrato.

Quando tutte le pareti libere ventricolari sono state raccolte, trasferire i campioni di tessuto in un piatto di coltura di 60 centimetri con le loro superfici interne sdraiate a faccia in giù nel piatto. Utilizzando una punta di pipetta da un millilitro, aggiungere 0,5 a un millilitro di tampone di digestione al piatto direttamente sotto i pezzi di tessuto fino a quando non vengono immerse solo le superfici interne dei tessuti. Per evitare la contaminazione cellulare indesiderata, è importante che solo la superficie interna del ventricolo sia immersa nel tampone di digestione e sia digerita per esattamente cinque minuti.

Dopo cinque minuti nell'incubatore di coltura cellulare, interrompere la digestione con cinque volte il volume del mezzo cellulare endoteliale. Quindi utilizzare una pipetta da un millilitro per sciacquare la superficie interna di ogni ventricolo con un mezzo fresco che trasferisce il deflusso attraverso un colino di 40 micrometri in un tubo di raccolta da 50 millilitri su ghiaccio. Per la digestione coronarica delle cellule endoteliali, tagliare lungo la superficie esterna del ventricolo sinistro senza contaminazione dallo strato interno e posizionare ogni frammento di tubo in un tubo separato da cinque millilitri contenente un millilitro di tampone di digestione.

Per evitare la contaminazione da EEC, è importante tagliare solo dalla superficie esterna del ventricolo. Usando le forbici di dissezione, tritare la parete ventricolare in piccoli pezzi di un millimetro cubico e posizionare i tubi in un bagno d'acqua celsius di 37 gradi per 15-20 minuti con vortice ogni due o tre minuti. Quando i pezzi tritati sono piccoli ma visibili, aggiungere quattro millilitri di mezzo cellulare endoteliale al tubo e utilizzare una pipetta sierologica a cinque millilitri per trasferire l'intero volume della soluzione attraverso un colino di 40 micrometri in un tubo di raccolta da 50 millilitri sul ghiaccio.

Per isolare le popolazioni di cellule positive cd31 dopo la loro digestione, pellet le cellule per centrifugazione e aspirare i supernatanti. Se i pellet sono rossi, rimescolare le cellule in uno o due millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi per tubo per un'incubazione di cinque minuti in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, interrompere la lisi con 10 millilitri di PBS e raccogliere le cellule con una seconda centrifugazione.

Successivamente, aggiungere 90 microlitri di tampone di cernita e 10 microlitri di anticorpi anti-CD31 PE a ciascun tubo di cellule. Dopo il vortice, incubare le cellule per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aggiungere 10 millilitri di tampone di cernita ai tubi con miscelazione accurata e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

Risostimato il pellet in 80 microlitri di tampone di cernita per tubo, seguito dall'aggiunta di 20 microlitri di microperline anti-PE. Dopo il vortice, posizionare i tubi a quattro gradi Celsius per 15 minuti, seguito dal lavaggio in 10 millilitri di tampone di cernita per centrifugazione come appena dimostrato. Risostimato i pellet in 500 microlitri di tampone di cernita sul ghiaccio e posizionare una colonna contenente sfere super paramagnetiche in un separatore magnetico.

Risciacquare la colonna con tre millilitri di tampone di smistamento. Quando la colonna si è svuotata, aggiungere alla colonna 500 microlitri della sospensione cellulare endocardiale endocardiale, seguiti da quattro lavaggi con tre millilitri di tampone di cernita per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire la colonna in un nuovo tubo di raccolta da 15 millilitri e utilizzare lo stantuffo a colonna e cinque millilitri di mezzo cellulare endoteliale fresco per sciacquare le cellule positive CD31 dalla colonna nel tubo di raccolta.

Quindi raccogliere le cellule endoteliali isolate del tallone mediante centrifugazione. Come previsto, la PCR quantitativa rivela che rispetto all'actina beta, le cellule endoteliali endocardiali espressero livelli più elevati dei marcatori endocardiali Npr3, Hapln1 e Cdn11 rispetto alle cellule endoteliali coronarie. Allo stesso modo, le cellule endoteliali coronarie esprimerono livelli più elevati dei marcatori coronarico Fabp4, Mgll e Cd36 rispetto alle cellule endoteliali endocardiali.

Inoltre, entrambi i tipi di cellule hanno espresso il gene del marcatore cellulare pan-endoteliale Cdh5 con livelli leggermente più alti osservati nelle cellule endoteliali coronarie. Possiamo purificare ulteriormente le cellule usando FACS e anticorpi specifici per le popolazioni cellulari. Ad esempio, possiamo usare anti-Npr3 per ordinare EEC e anti-Cd36 per ordinare i PEC.

Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per esplorare il ruolo della CEE e dei PEC nello sviluppo cardiaco e nelle malattie in modo specifico per tipo di cellula.