Utilizzo di Caenorhabditis elegans per lo screening delle interazioni chaperone tessuto-specifiche

L'obiettivo generale del seguente esperimento in disegno geneticamente tracciabile Caenorhabditis elegans è quello di identificare interazioni chaperone tessuto-specifiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che combina saggi facili da usare, come l'adattamento dell'intelligenza artificiale del Golan e le letture comportamentali, per esporre nuove interazioni specifiche del tessuto. Per una sincronizzazione embrionale non stressante, utilizzare un plettro per spostare circa 100 uova da una piastra a verme non sincronizzata a una piastra NGM appena posizionata e allevare gli animali secondo il programma sperimentale appropriato.

Quando gli animali raggiungono il primo giorno di deposizione delle uova, aggiungere lentamente un millilitro di tampone M9 alla piastra, distante dal prato batterico, e ruotare la piastra in modo che il tampone copra completamente la piastra. Inclinare la piastra da un lato per rimuovere il liquido e lavare gli animali dalla piastra. Quando tutti i vermi sono stati lavati dalla piastra, usa una punta di pipetta di plastica standard per tagliare un quadrato di agar intorno al punto in cui sono concentrate le uova e posiziona il pezzo di agar su una piastra NGM appena posizionata.

Coltiva le uova nelle stesse condizioni di coltura. Al termine dell'incubazione, la piastra deve essere coperta con uova sincronizzate. Dopo aver lavato tutti gli animali dal piatto come appena dimostrato, aggiungere un millilitro di tampone M9 fresco e utilizzare un raschietto cellulare per rilasciare le uova dal piatto.

Quando tutti gli ovuli sono stati staccati, trasferire l'intero volume di tampone dalla piastra in una provetta conica per la centrifugazione. Centrifugare la provetta ed eliminare il surnatante. Dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere fino a un millilitro di tampone M9 fresco alla piastra e pipettare per risospendere le uova.

Lavate le uova altre cinque volte come appena dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, il pellet d'uovo dovrebbe apparire bianco e tutti i microlitri di surnatante tranne gli ultimi 200 possono essere rimossi. Per coltivare nematodi sincronizzati per un esperimento, posizionare una goccia di circa 30 uova vicino al prato batterico e ogni piastra di interferenza RNA posizionata e circa 30 uova su una piastra posizionata con un vettore vuoto contenente batteri.

Quindi allevare gli animali nelle condizioni di coltura appropriate secondo il protocollo sperimentale. Per valutare la letalità embrionale degli animali sincronizzati, quando gli animali iniziano a deporre le uova, trasferire circa 100 uova in un piatto vuoto e distribuire le uova in file per semplificare il conteggio. Dopo 24-48 ore, segna la percentuale di uova non schiuse.

Per riferimento, confrontare le uova di animali da esperimento con le uova di animali trattati con batteri di controllo a vettore vuoto. Per impostare un test di paralisi, coltivare animali sincronizzati per età su batteri di controllo vettoriali vuoti, fino a quando gli animali raggiungono l'età adulta, ma prima che inizi la deposizione delle uova. Usa un pennarello fine per tracciare una linea sul retro di una normale piastra NGM Agar e posiziona da cinque a dieci animali sulla linea segnata.

Imposta un timer per 10 minuti e segna la percentuale di animali che rimangono sulla linea come vermi paralizzati. Per riferimento, confrontare questi dati con la percentuale di animali mutanti cresciuti su batteri di controllo a vettore vuoto. Per la convalida del knockdown proteico, posizionare da 250 a 300 uova sincronizzate su una piastra di RNA di interferenza NGM da 60 millimetri posizionata con il relativo RNA a doppio filamento che esprime o il vettore vuoto contenente batteri e coltivare le uova per il periodo sperimentale appropriato.

Al termine dell'incubazione, trasferire un totale di 200 giovani animali adulti nel tappo di una provetta da 1,5 millilitri contenente 200 microlitri di PBST mantenuto alla temperatura di allevamento degli animali. Chiudere accuratamente il tappo e centrifugare gli animali a 1000 volte G per 1 minuto. Al termine della centrifugazione, aggiungere 800 microlitri di PBST fresco alla provetta e centrifugare nuovamente i vermi.

Rimuovere con cura i 900 microlitri superiori del surnatante e lavare i nematodi in PBST fresco altre 3 volte, come appena dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere tutti i microlitri di surnatante tranne gli ultimi 100 e aggiungere 25 microlitri di tampone campione 5X agli animali. Riscaldare i campioni per 10 minuti a 92 gradi Celsius e 1000 giri al minuto, prima di caricare 20 microlitri di ciascun campione su un gel per pagine SDS.

Quindi eseguire l'analisi Western blot utilizzando gli anticorpi appropriati per determinare la stabilità relativa della proteina di interesse e utilizzare il software densitometrico per determinare l'intensità dei divieti. L'HSP6 abbattuto durante lo sviluppo provoca un forte arresto dello sviluppo negli animali di tipo selvatico. Allo stesso tempo, HSP6 abbattuto in un ceppo di RNA di interferenza muscolo-specifico che esprime RDE1 wild-type nel tessuto muscolare non causa l'arresto dello sviluppo.

Mentre HSP6 ha abbattuto un ceppo RNAI specifico dell'intestino che esprime RDE1 wild type nelle cellule intestinali, si traduce in un forte arresto dello sviluppo e del fenotipo. Una mutazione in HSP6 MG585 che causa un lieve ritardo di crescita, può, quindi, essere utilizzata per lo screening delle interazioni chaperoniche aggravanti o attenuanti incrociando un ceppo portatore di quel gene mutato in un ceppo di RNA di interferenza intestinale specifico e lo screening della libreria di RNA di interferenza chaperone. L'organizzazione della miosina e gli animali mutanti UNC45 trattati con RNA di interferenza STI1, AHSA1 o DAF41, è simile a quella dei vermi wild type al quarto stadio larvale.

Sebbene i mutanti mostrino sarcomeri interrotti dopo aver raggiunto l'età adulta. Al contrario, rimangono inalterati sia gli animali mutanti UNC45 trattati con un controllo a vettore vuoto che gli animali di tipo selvatico. Le interazioni genetiche non sono indicative di interazione fisica.

Pertanto, devono essere eseguiti esperimenti di follow-up utilizzando lo screening delle interazioni genetiche per convalidare ed esaminare direttamente la natura delle interazioni identificate.