Saggio fluorometrico basato sulla chimica dei clic per l'apolipoproteina N-aciltransferasi dalla caratterizzazione enzimatica allo screening ad alta produttività

Questo protocollo affronta due aspetti importanti, la caratterizzazione di una membrana integrale essenziale, l'apolipoproteina aciltransferasi dei batteri e lo sviluppo del test in formato HDS per lo screening degli inibitori dell'enzima. Il metodo è molto sensibile e adatto per scopi di screening. Può contribuire allo sviluppo di potenziali nuovi antibiotici.

Questo video aiuterà a evidenziare le fasi critiche di questo protocollo, come la miscelazione, il vortex, la sonicazione, mentre si lavora con lipidi non omogenei e detergenti contenenti sospensioni. A dimostrare la procedura saranno Karine Nozeret, Aurelia Pernin, entrambe borsisti del mio gruppo. Iniziare preparando la miscela di reagenti per il test dell'apolipoproteina e dell'aciltransferasi o LNT.

Mescolare l'alchino POPE e l'FSL-1-biotina con il tampone di reazione LNT in provette da 1,5 millilitri a un volume finale di 18 microlitri. Preparare miscele di reagenti triplicati per tutte le condizioni testate. Sonicare le miscele di reagenti per tre minuti in un bagno d'acqua a ultrasuoni e incubarle a 37 gradi Celsius per cinque minuti.

Quindi aggiungere LNT attivo o inattivo a una concentrazione finale di un nanogrammo per microlitro e pipettare su e giù per mescolare. Incubare la reazione a 37 gradi Celsius per 16 ore in un mixer termico con coperchio riscaldato. Nel frattempo, preparare una soluzione madre di due milligrammi per millilitro di streptavidina.

E diluiscilo a 10 microgrammi per millilitro per creare una soluzione funzionante. Aggiungere 100 microlitri di soluzione a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Quindi asciugare i pozzetti all'aria durante la notte incubando la piastra a 37 gradi Celsius senza coperchio.

Il giorno successivo, preparare le soluzioni madre di cinque millimolari di Azido-FAM, 50 millimolari di TCEP, due millimolari di TBTA e 50 millimolari di solfato di rame pentaidrato. Esegui la chimica dei clic aggiungendo 0,2 microlitri di Azido-FAM di serie, 0,4 microlitri di TCEP di serie e 0,2 microlitri di TBTA di serie alle provette di reazione LNT da 1,5 millilitri. Agitare la soluzione per cinque secondi.

Quindi aggiungere 0,4 microlitri di solfato di rame grezzo. Agitare per altri cinque secondi e incubare la reazione per un'ora a temperatura ambiente al buio. Mentre la miscela chimica click è in incubazione, lavare tre volte i pozzetti delle piastre rivestite di streptavidina con 200 microlitri di PBST1.

Trasferire 18 microlitri della miscela click chemistry in un pozzetto rivestito di streptavidina e aggiungere 100 microlitri di PBST1 per legare il prodotto FAM N-acil-FSL-1-biotina alla piastra. Aggiungere la biotina fluoresceina alla piastra come controllo positivo per il legame della streptavidina e la lettura della fluorescenza. Quindi incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora al buio, agitando a 300 giri/min.

Dopo l'incubazione, utilizzare una pipetta elettronica multicanale per lavare manualmente la piastra sei volte con 200 microlitri di PBST2. Sciacquarlo tre volte con la pipetta. Lavalo tre volte con 200 microlitri di PBS e sciacqualo altre tre volte.

Aggiungere 200 microlitri di PBS a ciascun pozzetto e rilevare la fluorescenza a 520 nanometri in un lettore di micropiastre. Salva tutti i risultati in un foglio di calcolo, quindi calcola la deviazione standard per ogni reazione e i valori P per i controlli negativi e i campioni positivi con un test T non appaiato. Il test LNT in vitro qui descritto utilizza fosfolipidi contenenti un acido grasso alchino e FSL-1-biotina come substrati per formare l'alchino FSL-1-biotina.

Dopo una reazione chimica a scatto con Azido-FAM, questo prodotto diventa marcato in fluorescenza e rilevabile mediante spettrometria a fluorescenza. Le condizioni di reazione sono state ottimizzate per la lettura massima della fluorescenza a 520 nanometri. I controlli negativi includevano reazioni senza enzima, con una variante inattiva dell'enzima o con un inibitore specifico del tiolo, MTSES.

La biotina fluoresceina è stata utilizzata come controllo interno per il massimo segnale di fluorescenza. Al fine di sviluppare un saggio di screening ad alto rendimento, le reazioni sono state eseguite direttamente in piastre da 384 pozzetti. Le fasi di lavaggio sono state automatizzate e la quantità di reagenti è stata ridotta.

La reazione è stata sensibile e riproducibile con una differenza significativa nel segnale fluorescente tra il controllo negativo e l'enzima attivo. Per lo screening ad alto rendimento, il fattore primo Z determina se una risposta in un test è sufficientemente grande per scopi di screening. Il fattore primo Z medio era maggiore di 0,6 per il saggio LNT eseguito in un formato a 384 pozzetti, suggerendo che era eccezionale.

Il test in provetta in questo video è stato sviluppato in un formato multipiastra compatibile con HDS. Può essere utilizzato per studiare altre aciltransferasi da una varietà di organismi.