Tracciamento del lignaggio e analisi clonale nello sviluppo della Corteccia cerebrale utilizzando l'analisi mosaica con doppi marcatori (MADM)
May 8th, 2020
Viene presentato un protocollo per eseguire il tracciamento del lignaggio e l'analisi genetica funzionale dei geni candidati a livello di singola cellula utilizzando l'analisi del mosaico con doppi marcatori (MADM). L'analisi clonale MADM fornisce un quadro quantitativo per misurare il comportamento proliferativo, l'output cellulare e la relazione di lignaggio dei singoli progenitori e delle loro cellule figlie.
L'analisi del mosaico con tecnologia Double Markers è un metodo potente in grado di fornire informazioni altamente quantitative sul comportamento di proliferazione e sui risultati delle cantine delle cellule staminali degli individui. Una caratteristica unica di questa tecnica, è che consente il tracciamento del lignaggio e l'analisi genetica funzionale dei geni candidati a livello di cellula singola.demontrating alla procedura sarà, Carmen Streicher, la tua tecnica, Nicole Amberge, post-doc, Gisselle Cheung, post-doc e Andy Hansen, una dottoranda del mio laboratorio. Per indurre eventi di ricombinazione MADM in topi sperimentali, utilizzare una siringa da 1 ml dotata di un ago calibro 25 per fornire una singola iniezione di Tamoxifen Intraperitoneal in una diga a tempo in gravidanza. Dall'analisi clonale MADM ai punti di tempo postnatali. Nei giorni embrionali da 18 a 19, mettere un topo incinta in posizione supina e disinfettare la pelliccia con il 70% di etanolo. Fai una piccola incisione nella pelle nell'addome inferiore sopra l'utero e fai una seconda incisione attraverso i muscoli e la parete muscolare addominale per rivelare il peritoneo. Utilizzare le forbici per separare l'utero dai tessuti circostanti e posizionare l'utero intatto in un guanto con acqua tiepida. Quindi utilizzare forbici e dita a punta fine per aprire attentamente le pareti uterine per rilasciare gli embrioni. Pulire i cuccioli premendo delicatamente i forzieri di tanto in tanto per iniziare a respirare prima di trasferire gli animali prenatali a una madre adottiva. Per raccogliere il tessuto clone MADM neurale posizionare un animale anestetizzato in posizione supina su un vassoio di chirurgia perfusione e disinfettare la pelliccia con il 70% di etanolo. Usa forbici e forcep per fare un'incisione attraverso la pelle e un'incisione attraverso lo strato muscolare. Quando la cavità toracica è visibile, annusare e sollevare il diaframma per rivelare il cuore e tagliare e fissare con cura la gabbia toracica al vassoio chirurgico.inserire un ago collegato a un tubo di pompazione peristaltico riempito con PBS nel ventricolo in basso a sinistra del cuore e utilizzare piccole forbici Iris per fare un'incisione nell'estremità posteriore dell'atrio destro. Perfondere il sistema cardiovascolare con il PBS seguito immediatamente da perfusione con ghiaccio freddo appena preparato 4% paraformaldeide in PBS. Quando la perfusione è completa, rimuovere il cervello attraverso un'attenta dissezione e posizionare l'organo raccolto in almeno cinque volte il volume cerebrale di paraformaldeide fresca al 4% durante la notte alle 4
Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per il tracciamento di origine e l'analisi genetica funzionale di geni candidati a livello di singola cellula utilizzando l'Analisi Mosaica con Doppi Marcatori (MADM). L'analisi clonale MADM consente la misurazione quantitativa del comportamento proliferativo e dell'output cellulare dei singoli progenitori e delle loro cellule discendenti.
Componenti chiave dello studio
Area di ricerca
- Tracciamento di origine
- Analisi genetica
- Biologia delle cellule staminali
Contesto
- La tecnologia MADM è fondamentale per comprendere la proliferazione cellulare.
- Il metodo consente il tracciamento a livello di singola cellula.
- Le applicazioni includono la valutazione degli output cellulari e delle relazioni di origine.
Metodi utilizzati
- Analisi Mosaica con Doppi Marcatori (MADM)
- Modello sperimentale: Topi
- Le tecniche includono iniezioni intraperitoneali e perfusione dei tessuti.
Risultati principali
- Ha consentito un esame dettagliato del comportamento dei progenitori.
- Ha fornito informazioni sulle relazioni di origine delle cellule figlie.
- Ha dimostrato un metodo affidabile per l'analisi genetica funzionale.
Conclusioni
- Questo studio fornisce un protocollo completo per l'utilizzo di MADM nell'analisi genetica.
- I risultati contribuiscono in modo significativo al campo della biologia dello sviluppo.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) enables unprecedented single-cell resolution lineage tracing and clonal analysis in the developing cerebral cortex, directly addressing the challenge of mapping neural stem cell fate and division patterns. This capability enhances predictive confidence in early neurodevelopmental target validation and supports mechanistic de-risking for CNS portfolio decisions. MADM's quantitative and qualitative outputs position it as a critical tool for functional genetic interrogation in neurobiology-focused R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of neural stem cell lineage transitions and division modes.
- Supports functional validation of candidate genes in neurodevelopmental pathways.
- Provides mechanistic de-risking by distinguishing control and mutant subclones in vivo.
- Facilitates high-confidence target selection for CNS therapeutic programs.
Screening & Assay Development
- Generates validated single-cell lineage maps for downstream phenotypic screening.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of progenitor proliferation and fate specification.
- Supports assay standardization by enabling comparative analysis within the same tissue environment.
- Prepares robust biological systems for compound evaluation in neurodevelopmental contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lineage tracing outputs with disease-relevant neural circuit formation.
- Enables continuity from discovery-stage genetic manipulation to preclinical model validation.
- Supports risk-adjusted advancement of CNS targets based on in vivo functional evidence.
- Provides translational biomarker insights through clonal analysis of neural progenitors.
Pipeline & Workflow Integration
MADM-based lineage tracing integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation in CNS-focused pipelines.
- Discovery Biology: Delivers high-resolution hypothesis testing of neural stem cell fate and division patterns.
- Screening: Supplies quantitative, reproducible lineage data for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides optical and statistical outputs for comparing control and mutant progenitor behaviors.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by mapping lineage outcomes in vivo.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any murine stem cell niche with appropriate CreERT2 drivers, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural lineage studies.
- Operational Value: Standardizes lineage tracing and clonal analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in CNS portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets based on in vivo functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic manipulation, in vivo lineage tracing, and neuroanatomical dissection.
- Demands access to murine models with CreERT2 drivers and advanced imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible clonal analysis and data interpretation.
- Adaptable to various stem cell niches with appropriate genetic drivers and tissue handling protocols.
- Limited to murine systems where genetic tools and tissue access are feasible.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Tamoxifen (TM) Induction in Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) Mice
2:00
MADM Clone Brain Tissue Harvest
3:12
MADM Brain Tissue Sectioning
4:30
Adult Tissue Mounting
5:29
Confocal Image Acquisition and MADM Clone Quantification
6:29
Serial 3D Clone Reconstruction
7:30
Results: Representative Lineage Tracing and Clonal Analysis
8:41
Conclusion
