Produzione di polli da carne a crescita rapida privi di germi da una linea commerciale per studi sul microbiota
18 giugno 2020
Qui descriviamo un metodo per la generazione di pulcini privi di germi dalle uova di una linea di polli da carne commerciale, il Ross PM3. Questo metodo può essere adattato per la generazione di animali privi di germi da altre specie di pollame.
Fino ad ora, la produzione di uccelli privi di germi era limitata alla razza animale per la ricerca. Mostriamo qui che è possibile farlo con animali commerciali. Questa tecnica consente di effettuare studi sull'influenza del microbiota utilizzando il background genetico degli uccelli da allevamento.
Quando si tenta questo protocollo, è importante controllare l'allevamento delle specie scelte nelle condizioni standard e possedere una forte conoscenza del lavoro negli isolatori. Iniziate installando provette da 50 millilitri, pipette di plastica, mangime irradiato, acqua sterilizzata in autoclave e contenitori di plastica sigillati sterili in un isolante rigido a pressione positiva. Riempire la trappola germicida di trasferimento con una soluzione di ammonio quaternario al 2% e sterilizzare l'isolatore tre volte con vapore di formaldeide, spostando i materiali all'interno dell'isolatore tra ogni sterilizzazione per garantire la disinfezione di tutte le superfici di contatto.
Almeno due giorni prima di introdurre le uova, impostare la temperatura dell'isolatore a 37 gradi Celsius. Il giorno dell'introduzione, impostare l'idrometro al 65-70% di umidità relativa. Dopo aver selezionato uova pulite e impeccabili, decontaminare immediatamente la superficie delle uova immergendole in una soluzione di acido peracetico all'1,5% per cinque minuti, quindi trasportare le uova alla struttura sperimentale utilizzando una scatola decontaminata con vapore di formaldeide.
Conservare le uova per 24 ore a 14 gradi Celsius, quindi ripetere la sterilizzazione con acido peracetico all'1,5% e mettere le uova in un'incubatrice da cova per 19 giorni. Il giorno 19, verificare la fertilità, la vitalità e lo sviluppo dell'embrione utilizzando un candelabro per uova leggero in condizioni sterili. Selezionare gli ovuli vivi ed embrionati e decontaminarli spruzzandoli con una soluzione di acido peracetico all'1,5% per 30 secondi o fino a coprire l'intera superficie di ciascun uovo.
Trasferire le uova negli isolatori sterili da cova e sciacquarle con acqua demineralizzata sterile prima di metterle nello spazio di schiusa. Dopo la schiusa, gli animali vengono tenuti negli isolatori sterili, alimentati ad libitum con una dieta commerciale sterilizzata mediante irradiazione gamma e annaffiati con acqua di rubinetto autoclavata. Un giorno dopo la schiusa, prelevare un campione fecale direttamente dal retto di diversi pulcini e raccoglierli in una provetta di vetro sterilizzata.
Aggiungere un millilitro di feci a nove millilitri di brodo di tioglicolato con resazurina e aggiungere il campione rimanente a nove millilitri di Brain Heart Infusion o brodo BHI. Incubare le provette a 37 gradi Celsius senza agitare per 18-48 ore. A 18 ore, esaminare visivamente le provette per verificare la presenza di eventuali modifiche nel terreno di coltura.
Dopo 48 ore, prelevare una goccia dal terreno di brodo fecale BHI, posizionarla su un vetrino e osservarla al microscopio. Se si sospetta la presenza di batteri, prelevare un campione dalla coltura BHI e seminarlo su una piastra di agar BHI, quindi incubare la piastra a 37 gradi per 18-48 ore. Se compaiono colonie, identificare i batteri utilizzando una tecnica ad alto rendimento come la spettrometria di massa MOLDI-TOF.
Sono state condotte sei serie di generazione di pulcini privi di germi con uova di ROSS PM3 provenienti da due diversi allevamenti francesi. Sono state raccolte un totale di 853 uova e dopo due fasi di decontaminazione e 19 giorni di incubazione, l'86,40% era vitale. Delle uova vitali, 490 sono state sottoposte a una terza fase di decontaminazione e sono state introdotte in vari isolatori da cova per un tasso medio di schiusa del 79,80%Ciò rappresenta un tasso di schiusa del 68,94% rispetto al numero iniziale di uova raccolte.
I risultati della schiusa variano sostanzialmente dal 41,67% all'88,16% dei pulcini vitali rispetto al numero di uova raccolte. Questo effetto era direttamente correlato con l'età delle galline ovaiole, dove le uova provenienti da galline più anziane erano meno vitali. Le sei corse sono state effettuate utilizzando quattro diversi isolatori di schiusa.
Dopo il controllo batteriologico, gli animali di 14 dei 16 isolatori sono stati confermati privi di germi, il che corrisponde a un tasso di successo dell'86,5%. Il punto chiave di questa procedura è mantenere la sterilità dell'isolatore. Ciò richiede il rispetto delle procedure di disinfezione e, soprattutto, il controllo dell'introduzione degli elementi attraverso la camera stagna del liquido. Questa procedura consente agli animali di misurare l'impatto del microbiota sulla fisiologia e sulla salute degli uccelli.
Può essere adattato e utilizzato per studiare il microbiota di altri uccelli d'allevamento o della fauna selvatica se le uova sono accessibili.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per generare pulcini aspecifici da uova da allevamento commerciali, in particolare dalla linea Ross PM3. La tecnica consente studi sul microbiota utilizzando il patrimonio genetico di uccelli da allevamento.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Scienze animali
- Medicina veterinaria
Sfondo
- I metodi precedenti per uccelli privi di germi erano limitati a ceppi di ricerca.
- Questo studio dimostra la fattibilità dell'uso di pollame commerciale.
- Comprendere l'influenza della microbiota sulla salute è fondamentale per la gestione del pollame.
- Il mantenimento della sterilità durante il processo è essenziale per il successo.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per produrre pulcini liberi da germi.
- Facilitare la ricerca sul microbiota nel pollame commerciale.
- Valutare l'impatto del microbiota sulla fisiologia e sulla salute degli uccelli.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di isolatori con protocolli di sterilizzazione.
- Decontaminazione delle uova mediante acido peracetico.
- Incubazione e monitoraggio dello sviluppo dell'embrione.
- Controllo batteriologico dei pulcini dopo la schiusa.
Risultati principali
- Dei 853 uova, l'86,40% erano vitalizzate dopo la decontaminazione.
- Il tasso medio di schiusa è stato del 79,80% per le uova vitalizzate.
- Il tasso di successo dei pulcini germ-free è stato dell'86,5% negli isolatori.
- La vitalità era correlata all'età delle galline ovaiole.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un approccio per lo studio del microbiota nei volatili da allevamento.
- Può essere adattato ad altri uccelli allevati o alla fauna selvatica.
- Il mantenimento della sterilità è fondamentale per la generazione con successo di animali privi di germi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente studi sul microbiota in linee avicole commerciali, affrontando una lacuna fondamentale nella traslazione dei risultati ottenuti con ceppi di ricerca verso genetici rilevanti per l'industria. Producendo uccelli privi di germi a partire da polli da ingrasso a crescita rapida, il metodo supporta la modellizzazione predittiva delle interazioni ospite-microbiota in specie di importanza economica. L'approccio migliora la fiducia traslazionale riguardo interventi nutrizionali, immunologici e fisiologici nella produzione avicola.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente la verifica di ipotesi sull'influenza della microflora nello sviluppo e nella fisiologia del sistema immunitario, utilizzando contesti genetici di rilevanza commerciale.
- Valore operativo: Fornisce un sistema asettico e privo di germi per isolare le variabili microbiche negli studi sulle risposte dell'ospite.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera sistemi biologici standardizzati e privi di microbiota per prestazioni costanti nei saggi durante lo screening di additivi per mangimi o probiotici.
- Valore operativo: Fornisce misurazioni di base riproducibili, fondamentali per valutare gli effetti dei composti sulla salute intestinale e sull'immunità.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico consentendo la riconstituzione controllata del microbiota per valutare gli effetti specifici dei ceppi sulla salute degli uccelli.
- Valore operativo: Permette studi longitudinali dalla schiusa fino alle fasi di crescita in condizioni microbiche definite, migliorando la fiducia predittiva per i candidati preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica fornendo un modello validato per testare interventi sulla microflora in stadi precoci, prima di passare a prove su animali vivi.
- Biologia della scoperta: Supporta la validazione funzionale di target e vie metaboliche microbiche che influenzano la crescita, l'immunità e l'utilizzo dei nutrienti.
- Screening: Fornisce pulcini asettici come piattaforma riproducibile per la valutazione di additivi per mangimi, vaccini o modulatori del microbioma.
- Analisi: Permette un monitoraggio batteriologico quantitativo mediante campionamento fecale e coltura, per confermare lo stato asettico e tracciare gli esiti delle sfide microbiche.
- Ricerca traslazionale: Collega le scoperte della ricerca di base alla validazione preclinica, utilizzando un modello con rilevanza genetica commerciale.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una procedura scalabile e adattabile, applicabile a diverse specie avicole e unità isolatore per programmi R&D sostenuti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce il rumore biologico negli studi sulla microbiota eliminando variabili confondenti derivanti dall'esposizione microbica non controllata.
- Valore operativo: Garantisce la sterilità dell'isolatore attraverso protocolli di disinfezione validati, favorendo risultati sperimentali costanti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione nello sviluppo di alimenti e prodotti per la salute fornendo precoci indicazioni di efficacia e sicurezza in un modello fisiologicamente rilevante.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione basata sul rischio dei candidati modulatori della microbiota, fondata su risposte dell'ospite validate in linee genetiche commerciali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'uso della tecnica asettica e nella gestione degli isolatori per mantenere la sterilità durante la manipolazione delle uova e l'allevamento dei pulcini.
- Presuppone l'accesso a attrezzature per la sterilizzazione, tra cui sistemi a vapore di formaldeide, acido peracetico e alimenti sterilizzati mediante irraggiamento gamma.
- Necessita di procedure operative standardizzate per la raccolta, il trasporto e la decontaminazione delle uova, al fine di prevenire la compromissione dell'isolatore.
- Comprende il controllo ambientale di temperatura (37°C) e umidità (65–70% RH) durante le fasi di incubazione e schiusa.
- Si basa sulla validazione batteriologica mediante brodi tioglicolato e BHI, con conferma microscopica e basata su colture per verificare lo stato axenico.
