Un sistema gnotobiotico per studiare l'assemblaggio del microbioma nella Phyllosphere e nella fermentazione vegetale

Usando questo protocollo, possiamo affrontare le domande chiave su come i microbi si assemblano e interagiscono nella fillosfera. Ha l'ulteriore vantaggio che utilizzando l'estratto vegetale sterile, possiamo collegare la struttura delle comunità di phyllo sphere alla loro funzione durante la fermentazione vegetale. Queste tecniche consentono agli scienziati di testare come i microbi interagiscono nella sfera del fillo e quindi tracciare come queste comunità di sfere di fillo possono influire sulla fermentazione.

Per sterilizzare in superficie i semi di cavolo, iniziare posizionando 100 semi in un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere un millilitro di 70% di etanolo al tubo e vortice per cinque minuti. Quindi utilizzare una pipetta per scartare l'etanolo.

Aggiungere un millilitro di candeggina al 50% e vortice il tubo per cinque minuti, quindi scartare la candeggina. Risciacquare i semi quattro volte, aggiungendo un millilitro di acqua deionizzata autoclavata che gira il tubo, quindi scartando l'acqua. Dopo l'ultimo risciacquo, immergere i semi in acqua deionizzata sterilizzata per due o otto ore per ammorbidire il mantello del seme prima di piantare.

Pesa 10 grammi di argilla di calcio pulita in un tubo di vetro da 15 per 2,5 centimetri. Aggiungere circa nove millilitri di brodo MS preparato ad ogni tubo per coprire l'argilla calcizzata. Cappuccio liberamente le provette di vetro con tappi per provette a due modi da 22 millimetri.

Autoclavare i tubi a 121 gradi Celsius per 60 minuti. Quando si rimuovono i tubi dall'autoclave, spingere i tappi sui tubi di vetro per sigillarli, quindi raffreddare i tubi a temperatura ambiente prima dell'uso. Quando i tubi si sono raffreddati, utilizzare forcette extra lunghe per posizionare delicatamente un seme di cavolo sterile al centro di ogni tubo.

Allaga i tubi in un vassoio a sette modi e posiziona il vassoio sotto rack leggeri con un ciclo di luce di 16 ore a 24 gradi Celsius. I semi svilupperanno la loro prima vera foglia dopo cinque giorni, che è la prima foglia vascolare dopo che i cotyledons si sono formati. Ha un bordo rugoso ed è coperto di tricomb.

Per testare il cavolo privo di germi per la sterilità, afferrare delicatamente la base della pianta con pinze sterilizzate ed estrarlo. Prima di rimuovere completamente il cavolo dal tubo, tagliare accuratamente le radici con forbici sterilizzate per la dissezione. Quindi, compattare le foglie di cavolo in un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri.

Aggiungere 400 microlitri di PBS a ciascun tubo di micro centrifuga e utilizzare un micro pestello sterile per omogeneizzare il cavolo. Lama 100 microlitri del cavolo omogeneizzano su piastre di agar, assicurandosi di utilizzare un'ampia punta di pipetta orifizio. Per fare scorte di glicerolo di ceppi inoculati, striare delicatamente le singole colonie su due o tre nuove piastre dello stesso supporto.

Remare le colonie per due o cinque giorni, quindi raschiarle dalle piastre in un tubo conico da 15 millilitri con 15 millilitri di glicerolo al 15%. Vortice il tubo accuratamente da mescolare. Aliquot un millilitro del materiale glicerolo misto in un tubo di micro centrifuga e conservarlo di 80 gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'uso insieme ai restanti 14 millilitri di materiale glicerolo.

Una settimana prima dell'uso, scongelare l'aliquota di un millilitro sul ghiaccio e posizionarla in diverse diluizioni per determinare la concentrazione dello stock di inoculazione. Quando sei pronto a inoculare il cavolo, scongelare lo stock di glicerolo sul ghiaccio e diluirlo alla concentrazione desiderata. Aggiungere 10 millilitri del materiale diluito al flacone della pompa sterile e pompare cinque spruzzi in un grande becher per la raccolta dei rifiuti.

Rimuovere il coperchio dal tubo del cavolo e inclinare il cavolo verso la bottiglia spray. Spruzzare ogni cavolo con tre pompe della soluzione di inoculazione, quindi raccogliere un sottoinsieme dei cavoli per valutare l'effettiva concentrazione di inoculazione di input. Per raccogliere il cavolo, rimuoverlo dal tubo con forcel sterilizzate.

Tagliare le radici con forbici sterili di dissezione e posizionarla con cura in un tubo di micro centrifuga sterile pre pesato. Registrare il peso del cavolo per i calcoli futuri. Aggiungere 400 microlitri di PBS ad ogni tubo con il cavolo e macinarlo 30 volte con un micro pestello, quindi placcare l'omogeneato di cavolo usando ampie punte di pipetta orifizio.

Rimuovere e scartare le foglie più erva del cavolo e tritare tutti i cavoli rimanenti per inserirsi in un frullatore. Frullarlo in una polpa fine e pesare l'omogeneato di cavolo. Aggiungere due millilitri di acqua distillata per grammo di cavolo.

Quindi filtrare i liquami di cavolo attraverso due strati di filtri per caffè a cesto. Erogare il liquame in tubi di centrifuga e centrifugarlo a 20.000 volte G per 20 minuti o fino a quando particelle di grandi dimensioni non si depositano fuori soluzione. Rimuovere il supernatante, facendo attenzione a non disturbare i detriti di cavolo pelletato.

Per ricreare le condizioni di fermentazione con concentrazioni standard di sale, aggiungere il 2% di peso al cloruro di sodio volume all'estratto. Bilder l'estratto vegetale con un filtro da 0,2 micrometri attaccato al vuoto, erogarlo in tubi sterili e congelarlo a meno 80 gradi Celsius. Il metodo di sterilizzazione dei semi è stato testato con diversi cavoli Napa e tutti hanno dimostrato tassi di crescita simili.

Tuttavia, altre specie di brassica hanno dato un successo limitato perché le piante avevano bassi tassi di germinazione dopo la sterilizzazione o il gambo si è allungato rapidamente per fare una pianta spinosamente malsana. Gli isolati microbici sono stati inoculati come isolati di deformazione singola o in combinazione con un altro isolato. Un totale di 15 cavoli senza germi sono stati testati per ogni trattamento e raccolti immediatamente, a quattro giorni o a 10 giorni dall'inoculazione.

Gli isolati hanno dimostrato una rapida crescita nella fillosfera del cavolo Napa. Due lieviti e tre batteri sono stati inoculati in tre diversi tipi di estratto vegetale sterile o SVE a base di cavolo rosso, verde e napa. La crescita degli inoculati è stata registrata nell'corso di 14 giorni placcando cinque microlitri di ciascun trattamento su piastre di agar MRS o YPD.

Le misurazioni del pH durante la fermentazione hanno dimostrato che i batteri dell'acido lattico erano in grado di acidificare lo SVE a livelli inferiori al pH quattro, indicando un fermento sicuro per il consumo. Questi metodi si sono applicati specificamente al microbioma di cavolo, ma potrebbero essere utili in altri sistemi vegetali. Può essere difficile mantenere sterile il sistema, i nostri protocolli di struttura sono dettagliati, ma abbiamo trovato ogni passaggio importante.