Fabbricazione di guide d'onda in modalità zero per microscopia ad alta concentrazione a singola molecola
12 maggio 2020
Qui è descritto un metodo di litografia a nanosfera per la fabbricazione parallela di guide d'onda in modalità zero, che sono array di nanoperture in una microscopia in vetro rivestita di metallo coverlip per l'imaging di singole molecole a concentrazioni nano-micromolari di fluorofori. Il metodo sfrutta l'autoassemicolo del cristallo colloidale per creare un modello di guida d'onda.
Il protocollo di litografia a nanosfere qui presentato per la fabbricazione di guide d'onda in modalità zero è un metodo accessibile e a basso costo che non richiede strumenti o strutture di fabbricazione specializzati. Questo metodo sarà utile per la biofisica di singole molecole e consentirà a un maggior numero di ricercatori di eseguire esperimenti su singole molecole a concentrazioni biologicamente rilevanti di reagenti fluorescenti. Per creare una superficie pulita per la deposizione evaporativa di particelle colloidali, posizionare i vetrini coprioggetti in vetro borosilicato ottico negli inserti scanalati di un barattolo di colorazione in vetro Coplin.
Riempi il barattolo di colorazione con abbastanza acetone da coprire i vetrini coprioggetti e coprire il barattolo. Sonicare il barattolo per 10 minuti a 40 gradi Celsius. Versare l'acetone e sciacquare i vetrini coprioggetti tre volte con acqua distillata.
Dopo aver ripetuto la sonicazione e l'acetone, riempi il barattolo con una quantità di idrossido di potassio sufficiente a coprire i vetrini. Sonicare nuovamente il barattolo, coperto, per 20 minuti a 40 gradi Celsius. Sciacquare i vetrini coprioggetti con acqua distillata sei volte, quindi sonicarli in etanolo per 10 minuti a 40 gradi Celsius.
Dopo aver lavato i vetrini coprioggetti tre volte con acqua distillata, raccogliere delicatamente ogni vetrino coprioggetti dal bordo usando una pinza. Asciugare ogni vetrino coprioggetti con azoto gassoso e posizionare ogni vetrino coprioggetti pulito e asciutto e la propria capsula di Petri. Centrifuga 50 microlitri di perle di polistirene non funzionalizzate da un micron.
Scartare il surnatante, lasciando meno acqua possibile. Risospendere le microsfere in 50 microlitri di solvente, quindi mescolare accuratamente pipettando. Per allestire una camera di umidità per la deposizione, disporre sei piastre di Petri in fila.
Posizionare un vetrino coprioggetti in ogni capsula di Petri e lasciare i coperchi leggermente socchiusi con i vetrini coprioggetti posizionati in modo da essere esposti all'ambiente. Centrare un igrometro e una piccola ventola elettrica dietro le piastre di Petri, quindi registrare l'umidità relativa in laboratorio. Riempi un becher da 200 millilitri con 150-200 millilitri di acqua a circa 75 gradi Celsius e posiziona il becher dietro la ventola.
Accendere la ventola e coprire le piastre di Petri, la ventola, il becher e l'igrometro con un contenitore di plastica trasparente capovolto. Quando l'umidità relativa raggiunge il 70-75%, sollevare leggermente il contenitore di plastica e chiudere rapidamente i coperchi delle piastre di Petri per evitare di bagnare eccessivamente i vetrini. Quando l'umidità relativa nella camera raggiunge l'85%, pipettare cinque microlitri della sospensione di perle al centro di ciascun vetrino coprioggetti.
Coprire ogni capsula di Petri subito dopo la deposizione e tenere tutto coperto nel contenitore di conservazione tra una deposizione e l'altra. Le deposizioni di perline devono essere completate il più rapidamente possibile per ridurre al minimo la perdita di umidità. Se le deposizioni sono troppo secche o umide, l'umidità della camera è la variabile più importante da ottimizzare.
Quando tutte e sei le deposizioni sono complete, registrare l'umidità relativa nella camera e lasciare che le goccioline di perlina si diffondano e si asciughino per cinque minuti. Per fornire una superficie a temperatura uniforme per la ricottura delle perle di polistirolo, posizionare una piastra di alluminio piatta e fresata sopra una piastra riscaldante in ceramica standard e impostare la temperatura della piastra riscaldante a 107 gradi Celsius, la temperatura di transizione vetrosa del polistirolo. Posizionare un vetrino coprioggetti contenente la sagoma di perline sulla piastra di alluminio calda.
Dopo averlo ricoottonato per 20 secondi, rimuovere il vetrino coprioggetti dalla piastra di alluminio e posizionarlo prontamente su una superficie di alluminio a temperatura ambiente per raffreddarlo. Utilizzando la deposizione evaporativa termica, depositare 300 nanometri di rame a due angstrom al secondo su vetrini coprioggetti contenenti i modelli di perline. Questo genererà dei pali negli interstizi tra le perline.
Per rimuovere il rame in eccesso dalle perline, premere delicatamente un pezzo di nastro adesivo sulla superficie e poi staccare lentamente il nastro. Sciogliere le perle di polistirolo mettendo i vetrini coprioggetti in toleune e lasciandoli riposare per una notte. Maneggiando con cura i vetrini di copertura, sciacquarli una volta con cloroformio e due volte con etanolo.
Asciugare le sagome con azoto. Mettili in un detergente al plasma di ossigeno per 30 minuti per rimuovere i residui di polimero e contaminanti. Utilizzando la deposizione evaporativa termica, depositare tre nanometri di uno strato di adesione in titanio a un angstrom al secondo, quindi depositare da 100 a 150 nanometri di alluminio a quattro angstrom al secondo intorno e sopra i pali di rame.
Assicurarsi che i campioni non ruotino durante la deposizione, come avviene automaticamente in alcune unità di deposizione. Per sciogliere i perni di rame, immergere i vetrini coprioggetti nel mordenzante al rame per due ore. Dopo aver risciacquato i vetrini coprioggetti in acqua distillata, asciugarli con azoto, quindi lucidare delicatamente la superficie con carta per lenti per esporre eventuali perni ancora ricoperti di rivestimento.
Immergere i vetrini coprioggetti nel mordenzante al rame per altre due ore, quindi sciacquarli nuovamente con acqua distillata e asciugarli con azoto. Dopo la passivazione superficiale, i vetrini coprioggetti a guida d'onda in modalità zero possono essere accoppiati con vetrini al quarzo utilizzando nastro biadesivo per creare camere di flusso microfluidiche per l'imaging di singole molecole. Il successo dell'autoassemblaggio del modello colloidale dipende in modo critico dall'umidità relativa.
In un modello ben formato, la regione delle perline è circolare con bordi definiti da un anello multistrato opaco. Nei modelli ben formati, la maggior parte dei modelli dovrebbe contenere perline esagonali e ravvicinate. Ci saranno alcuni difetti tra i grani a causa dell'inceppamento durante la sedimentazione evaporativa.
Dopo la deposizione del rame e la dissoluzione delle perle di polistirene, i perni di rame devono avere un diametro inferiore a 150 nanometri. Per una profondità di deposizione di rame di 300 nanometri, i pali sono alti circa 250 nanometri. Dopo la deposizione del rivestimento in alluminio e la successiva dissoluzione dei perni di rame, le guide d'onda dovrebbero essere visibili al microscopio a forza atomica ed essere distanziate di circa 550 nanometri l'una dall'altra.
La ricottura dei modelli di polistirene per 20 secondi ha prodotto guide d'onda in alluminio con un diametro di 118 nanometri, sufficientemente piccole da interrompere la propagazione della luce visibile. Un campo tipico di ZMW per l'imaging contiene 3.000 guide d'onda in un campo visivo di 40 x 80 micron. È stato eseguito FRET a singola molecola per testare la funzionalità ZMW.
Tracce di FRET di singole molecole erano rilevabili a tutte le concentrazioni di fluorforo Cy5 ambientale testato. In confronto, le singole molecole sarebbero rilevabili solo nell'illuminazione TERF con concentrazioni da picomolari a basse nanomolari. Dopo la fabbricazione della guida d'onda in modalità zero, i dispositivi possono essere passivati con polimeri per ridurre le interazioni non specifiche durante l'imaging di singole molecole.
I fondi in vetro delle guide d'onda in modalità zero possono anche essere leggermente incisi per migliorare l'emissione di singole molecole. Nel complesso, questo nuovo metodo di fabbricazione della guida d'onda in modalità zero consentirà ai ricercatori di studiare più facilmente i processi biochimici dinamici, come la trascrizione o la traduzione a concentrazioni e velocità più vicine a quelle della cellula.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo di litografia a nanosfere per la fabbricazione parallela di guide d'onda a modalità zero, che consente l'imaging di molecole singole a basse concentrazioni di fluorofori. Il metodo utilizza l'autoassemblaggio di cristalli colloidali per creare un modello di guida d'onda su un vetrino di copertura in vetro.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biofisica
- Nanotecnologia
- Imaging di molecole singole
Contesto
- Le guide d'onda a modalità zero sono essenziali per lo studio di molecole singole.
- I metodi di fabbricazione tradizionali possono essere costosi e richiedono strumenti specializzati.
- Questo metodo mira a semplificare il processo.
- L'autoassemblaggio colloidale è una tecnica promettente per la creazione di nanostrutture.
Obiettivo dello studio
- Presentare un metodo accessibile per la fabbricazione di guide d'onda a modalità zero.
- Consentire a più ricercatori di condurre esperimenti su molecole singole.
- Facilitare gli studi a concentrazioni biologicamente rilevanti di reagenti fluorescenti.
Metodi utilizzati
- Uso di vetrini di copertura in vetro borosilicato ottico.
- Sonicazione in acetone per la pulizia della superficie.
- Deposizione evaporativa di particelle colloidali.
- Creazione di un modello di guida d'onda per l'imaging.
Principali risultati
- Il metodo è a basso costo e non richiede strumenti specializzati.
- Produce guide d'onda efficaci per l'imaging di molecole singole.
- I ricercatori possono ottenere l'imaging a concentrazioni da nano a micromolare.
- Il protocollo è semplice e riproducibile.
Conclusioni
- Questo metodo di litografia a nanosfere democratizza l'accesso alle tecniche di imaging di molecole singole.
- Apre nuove strade per la ricerca nella biofisica delle molecole singole.
- Gli studi futuri possono sfruttare questo metodo per varie applicazioni in biologia.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables single molecule imaging at micromolar fluorophore concentrations, overcoming a key limitation in biochemical assays where background fluorescence restricts usable concentrations to pico- to nanomolar ranges. By facilitating the study of molecular processes at cellular-relevant concentrations and rates, it supports more physiologically relevant target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The accessibility of this low-cost fabrication approach expands the utility of zero mode waveguides beyond specialized core facilities to broader biopharma R&D laboratories.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses and pathway clarification by allowing single molecule observation at concentrations that reflect physiological ligand levels.
- Operational Value: Reduces reliance on expensive nanofabrication equipment, making single molecule enzymology accessible to more discovery teams.
- Predictive Confidence: Supports biological de-risking through direct visualization of single molecule interactions under near-native conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a platform for preparing validated biological systems that enable reliable compound evaluation at higher, more relevant fluorophore concentrations.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through parallel fabrication of thousands of zero mode waveguides using common lab equipment.
- Scalability: Supports platform reuse and scalability for downstream screening workflows by generating uniform waveguide arrays.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates the study of dynamic biochemical processes such as transcription or translation at concentrations and rates closer to those in the cell, improving relevance to disease models.
- Mechanistic De-risking: Enables observation of single molecule FRET signals at micromolar concentrations, which are unattainable with traditional total internal reflection fluorescence (TERF) illumination.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports data-driven decisions by providing quantitative, single molecule readouts that clarify mechanism and reduce ambiguity in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification, enabling biophysical characterization that informs compound selection and optimization prior to preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by allowing direct observation of single molecule behavior in complex environments.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible nanostructures with quantitative outputs that enable comparison of ligand binding or enzymatic activity across conditions.
- Analytics: Provides single molecule fluorescence and FRET readouts that offer high-resolution kinetic and mechanistic insights beyond ensemble averages.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical relevance by enabling studies at near-physiological concentrations and molecular crowding conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable fabrication capability that can be shared across departments, reducing dependency on external nanofabrication services.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct single molecule visualization.
- Operational Value: Improves standardization, reproducibility, and throughput via parallel fabrication using accessible equipment like thermal evaporators and hot plates.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency and enables better go/no-go decisions by generating reliable biophysical data earlier in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing mechanistic clarity that reduces late-stage attrition due to unexpected biological behavior.
Implementation Considerations
- Requires expertise in colloidal self-assembly, thermal evaporation, and surface cleaning protocols.
- Depends on access to a thermal evaporator, hot plate, sonicator, and basic chemistry lab equipment for metal deposition and etching.
- Necessitates standardization of humidity-controlled bead deposition to ensure consistent waveguide template formation.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different substrate materials or waveguide metals (e.g., aluminum vs. gold).
- Includes practical limitations such as sensitivity to relative humidity during bead self-assembly and the need for careful handling to avoid template defects.
