Chiarificazione primaria del fluido di coltura cellulare raccolto da CHO utilizzando un separatore acustico
14 maggio 2020
Qui viene presentato un protocollo per la chiarificazione primaria della coltura cellulare CHO utilizzando un separatore acustico. Questo protocollo può essere utilizzato per la chiarificazione primaria di colture di pallone shake o raccolti di bioreattori e ha la potenziale applicazione per la chiarificazione continua del materiale di spurgo cellulare durante le operazioni del bioreattore di perfusione.
Il nostro protocollo dimostra come utilizzare un separatore di onde acustiche su scala di banco per la separazione primaria delle cellule CHO dal fluido di coltura raccolto contenente un modello di anticorpo monoclonale. La separazione con onde acustiche offre alcuni vantaggi rispetto ai tradizionali metodi di chiarificazione primaria, come la centrifugazione e la filtrazione, come l'ingombro ridotto, il basso rischio di contaminazione e la riduzione del rischio di incrostazioni dei filtri. Poiché la separazione ad onde acustiche fornisce un flusso continuo di materiale privo di cellule per i successivi processi di filtrazione e cromatografia, esiste il potenziale per la sua applicazione nel bioprocesso continuo.
Per preparare il separatore di onde acustiche, collegare i cavi di torbidità alle rispettive porte e collegare i cavi BNC di alimentazione della camera al retro del sistema di separazione delle onde acustiche. Inserire le sonde di torbidità nel torbidiometro e nell'alloggiamento del termometro e serrare le viti. Collegare il tubo di alimentazione all'ingresso della porta di torbidità di alimentazione tramite la pompa di alimentazione.
E collegare il tubo a Y dall'uscita della porta di torbidità di alimentazione alla porta di ingresso della camera acustoforetica. Collegare il tubo della fase 1 dalla porta di scarico della camera acustoforetica a un recipiente di raccolta delle cellule tramite la pompa della fase 1 e collegare il tubo dalla porta del permeato della camera acustoforetica all'ingresso della porta di torbidità della sonda 1. Quindi, collegare il tubo di raccolta dalla porta di torbidità della sonda 1 a un recipiente di raccolta del prodotto.
Per adescare il sistema con il fluido di coltura cellulare raccolto, attivare il separatore di onde acustiche e aprire il programma software associato. Nel pannello Letture, fare clic su Avvia test per avviare la registrazione dei dati. E collegare l'estremità del tubo di alimentazione al recipiente del fluido per colture cellulari raccolte che viene agitato.
Per avviare la pompa di alimentazione, immettere la velocità della pompa e premere Invio. Verificare che la freccia di direzione della pompa sia orientata correttamente per garantire che il fluido della cella venga pompato dal recipiente nella camera acustoforetica e fare clic sull'icona del triangolo per iniziare. Monitorare le misure di torbidità in alimentazione nel pannello di riduzione percentuale durante il riempimento della camera acustoforetica.
Se il fluido di coltura cellulare raccolto viene miscelato a sufficienza all'interno del recipiente del fluido cellulare, i valori di torbidità saranno coerenti durante il caricamento della camera. Una volta che il liquido si trova sopra il trasduttore piezoelettrico sul retro della camera acustoforetica, fare clic su Spegni per arrestare la pompa. E collegare l'altra estremità del cavo di alimentazione BNC alla camera acustoforetica.
Una volta riempita e accesa la camera acustoforetica, modificare la velocità della pompa di alimentazione alla velocità operativa desiderata. Per attivare l'alimentazione piezoelettrica di fase 1, far scorrere la barra nel modulo di alimentazione a 10 watt e fare clic su Accendi.Una volta che le celle iniziano a depositarsi sul fondo della camera acustoforetica, avviare la pompa di fase 1 con una velocità appropriata in base alla densità delle celle e alla velocità della pompa di alimentazione, osservando attentamente le camere di separazione delle onde acustiche e regolando le velocità della pompa secondo necessità. Per calcolare la massa della cella impaccata, tarare una bilancia con una provetta vuota da 15 millilitri e riempire la provetta con materiale di alimentazione.
Dopo aver registrato il peso totale della provetta con l'alimentazione, centrifugare la provetta e travasare il surnatante in un nuovo contenitore. Misurare il peso del tubo con il pellet della cella. Quindi, monitorare il profilo di torbidità della torbidità dello stadio 1 quando il trabocco dalla camera acustoforetica entra nella sonda di torbidità 1.
Al termine della corsa, arrestare l'alimentazione e la fase 1 delle pompe e spegnere la camera. Scollegare il cavo di alimentazione BNC e raccogliere il materiale di raccolta del prodotto per l'analisi a valle. Per drenare il fluido rimanente dalla camera acustoforetica, posizionare il tubo di scarico in un recipiente vuoto.
Scollegare il tubo dall'ingresso della camera acustoforetica e dalle porte di permeazione e rilasciare il tubo di scarico dalla testa della pompa. Quando la camera è vuota, ricollegare il tubo, riposizionare il tubo di scarico nella testa della pompa e utilizzare una velocità di alimentazione e di stadio 1 di 60 millilitri al minuto per lavare l'acqua deionizzata dall'estremità del tubo di alimentazione per 15-20 minuti. Al termine del risciacquo con acqua, pompare alcol isopropilico al 70% attraverso il tubo e la camera per 15-20 minuti, seguito da un ulteriore risciacquo con acqua deionizzata da 15 a 20 minuti.
In questa analisi rappresentativa, quando il fluido cellulare raccolto è entrato nella camera del separatore di onde acustiche, le misurazioni della torbidità dalla sonda di torbidità di alimentazione sono rimaste costanti, da circa 1000 a 1100 NTU. E le misurazioni della sonda 1 della torbidità sono rimaste intorno a 40-50 NTU. Mantenere il fluido cellulare raccolto all'interno della camera per periodi di tempo più lunghi provoca aumenti di temperatura, come in questo esempio di una differenza di temperatura superiore a sei gradi Celsius del fluido cellulare raccolto prima di entrare nella camera acustoforetica e dopo la separazione acustica.
Un'altra considerazione importante quando si eseguono raccolte ad alta densità di celle è la saturazione delle sonde di torbidità, poiché le misurazioni della torbidità per la sonda di torbidità di alimentazione diventano sature oltre 4600 NTU, con conseguente probabile sottostima nel calcolo dell'efficienza di rimozione delle celle. Inoltre, l'efficienza di rimozione delle celle diminuisce significativamente da circa il 100% al 57% all'aumentare della velocità della pompa di alimentazione, con una velocità della pompa di alimentazione più lenta in genere direttamente correlata a una migliore chiarificazione delle celle. Man mano che i produttori di prodotti biotecnologici si spostano verso la produzione continua, l'uso della tecnologia delle onde acustiche può avere ulteriori applicazioni per il bioprocesso continuo e le operazioni di bioreattore a profusione.
Panoramica
Questo protocollo descrive l'uso di un separatore a onde acustiche per la chiarificazione primaria di colture cellulari CHO. Vengono evidenziati i vantaggi di questo metodo rispetto alle tecniche tradizionali, inclusa la sua potenzialità per la biotransformazione continua.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Cultura cellulare
- Biotecnologie
- Tecnologie di separazione
Sfondo
- Le cellule CHO sono ampiamente utilizzate nella produzione di biopharmaceutici.
- I metodi tradizionali di chiarificazione possono essere inefficienti e comportare rischi di contaminazione.
- La separazione mediante onde acustiche offre un'alternativa compatta ed efficace.
- Questo metodo consente un flusso continuo, migliorando le fasi a valle del processo.
Scopo dello studio
- Illustrare l'allestimento e il funzionamento di un separatore a onde acustiche.
- Valutare l'efficienza della separazione delle cellule dal liquido di coltura.
- Esplorare il potenziale per una chiarificazione continua nei processi biotecnologici.
Metodi Utilizzati
- Configurazione del separatore a onde acustiche con collegamenti per torbidità e alimentazione.
- Monitoraggio dei livelli di torbidità durante il processo di separazione.
- Regolazione della velocità delle pompe in base alla densità cellulare e alle misurazioni di torbidità.
- Svuotamento e pulizia del sistema dopo l'uso.
Risultati principali
- Misurazioni di torbidità costanti indicano una separazione efficace.
- Aumenti di temperatura osservati durante processi prolungati.
- L'efficienza di rimozione delle cellule varia in base alla velocità della pompa di alimentazione.
- È evidenziato il potenziale di applicazione nei processi biotecnologici continui.
Conclusioni
- La separazione mediante onde acustiche è un'alternativa praticabile ai metodi tradizionali.
- Offre vantaggi in termini di efficienza e rischio di contaminazione.
- È giustificata un'ulteriore esplorazione della sua applicazione nella produzione continua.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La chiarificazione primaria rappresenta un collo di bottiglia critico nella bioraffinazione, dove metodi tradizionali come la centrifugazione e la filtrazione introducono rischi di contaminazione, richiedono ampi spazi e ostacolano l'elaborazione continua. La separazione mediante onde acustiche offre un'alternativa compatta e a basso rischio di contaminazione, che permette un flusso continuo del fluido chiarificato, facilitando l'integrazione in flussi di lavoro di bioraffinazione continua. Questo approccio aumenta l'affidabilità predittiva nelle fasi iniziali di purificazione fornendo una rimozione riproducibile delle cellule, riducendo al contempo la complessità operativa e i rischi di intasamento dei filtri.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente una rapida chiarificazione dei raccolti di cellule CHO per l'analisi a valle di proteine terapeutiche come l'IgG1 monoclonale.
- Valore operativo: Riduce il tempo di manipolazione manuale e il rischio di contaminazione rispetto alla centrifugazione, favorendo un più rapido ricambio dei campioni.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce un supernatante acellulare costante con bassa torbidezza (40–50 NTU), adatto per una rilevazione affidabile degli analiti nello sviluppo di saggi.
- Valore operativo: Riduce al minimo l'intasamento e l'occlusione del filtro, migliorando la riproducibilità del saggio e riducendo lo spreco di reagenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Permette una chiarificazione scalabile dei fluidi di coltura per la produzione di materiali preclinici senza alterarne l'integrità.
- Valore operativo: Facilita il passaggio da processi discontinui a processi continui, in linea con gli obiettivi di tecnologia di piattaforma nello sviluppo di farmaci biologici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La separazione mediante onde acustiche si inserisce nel primo tratto del processo di purificazione, posizionandosi dopo il raccolto e prima della filtrazione in profondità o della cromatografia, consentendo un'integrazione senza interruzioni nelle linee di produzione continua.
- Biologia della scoperta: Clarifica fluidi di coltura complessi per consentire una quantificazione e caratterizzazione accurata dei prodotti secreti.
- Screening: Fornisce un'uscita riproducibile con bassa torbidezza, fondamentale per prestazioni costanti dei saggi durante le campagne di screening.
- Analisi: Fornisce metriche quantificabili di riduzione della torbidezza che si correlano con l'efficienza di rimozione delle cellule e la coerenza del processo.
- Ricerca traslazionale: Mantiene resa e integrità del prodotto, supportando un approvvigionamento continuo di materiale per studi preclinici di tossicologia ed efficacia.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta un'operazione unitaria modulare e scalabile, adattabile a diverse linee cellulari e tipi di prodotto in impianti multiproduttivi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la fiducia predittiva nell'efficienza di chiarifica grazie al monitoraggio in tempo reale della torbidità e al recupero costante del prodotto.
- Valore operativo: Riduce l'ingombro, elimina i rischi associati alla centrifugazione e minimizza l'intasamento dei filtri, abbattendo i costi operativi.
- Valore strategico: Consente capacità di lavorazione continua, riducendo la variabilità tra un lotto e l'altro e accelerando il trasferimento tecnologico.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce decisioni basate su una valutazione avanzata del rischio, fornendo una chiarifica affidabile e scalabile che riduce i rischi nelle fasi iniziali della purificazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze tecniche in dinamica dei fluidi e configurazione e calibrazione di sistemi acustoforetici.
- Necessita dell'integrazione con sistemi di monitoraggio della torbidità, pompe peristaltiche e controllo della temperatura.
- Richiede la standardizzazione delle portate e delle impostazioni di potenza tra turni e operatori per garantire prestazioni riproducibili.
- Deve tenere conto della saturazione della sonda di torbidità a elevate densità cellulari (>4600 NTU), che può sottostimare l'efficienza di rimozione.
- Le prestazioni dipendono dalla portata: portate eccessive riducono l'efficienza di rimozione delle cellule, richiedendo un'ottimizzazione in base alla densità del raccolto.
