Imaging in tempo reale della migrazione indotta da CCL5 di cellule staminali scheletriche periosteali nei topi

Questo protocollo descrive il rilevamento della migrazione delle cellule staminali scheletriche periosteali mediate da CCL5 in tempo reale utilizzando la microscopia intravitale animale vivo.

Il protocollo standardizzato può essere utilizzato per valutare la migrazione cellulare endogena e può essere applicato a diversi tipi di cellule e fenotipi scheletrici. Il vantaggio di questa tecnica è che consente di tracciare la migrazione cellulare in vivo per singole cellule piuttosto che per una popolazione di cellule in risposta a lesioni e/o trattamento con citochine. Prima di iniziare la procedura, confermare la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi nel topo anestetizzato e applicare un unguento sugli occhi dell'animale.

Successivamente, praticare un'incisione trasversale di meno di un centimetro dall'orecchio immediatamente mediale all'orecchio destro verso l'orecchio sinistro e praticare una seconda incisione dall'incisione iniziale, a circa due o tre millimetri oltre l'occhio destro verso il naso. Usa una pinza per separare la pelle dal periostio e usa le forbici per tagliare delicatamente il tessuto connettivo per separare la pelle dal periostio calvaria. Utilizzando un batuffolo di cotone sterile, applicare un unguento oftalmico sulla parte superiore del lembo cutaneo e piegare delicatamente il lembo sull'occhio sinistro.

L'intersezione delle suture sagittale e coronale deve essere chiaramente esposta. Sciacquare la superficie aperta con PBS sterile per pulire l'area da sangue e peli residui e posizionare la punta di uno o due aghi smussati verso il naso dalla sutura coronale e da uno a due aghi a destra della sutura sagittale. Esercitando una pressione molto piccola verso il basso, ruotare con cautela la siringa in senso orario una volta e in senso antiorario più volte.

Quindi utilizzare un ago calibro 27 per allargare la microfrattura a circa 40 micrometri. Se rimangono frammenti ossei, lavare la microfrattura con PBS. Se rimangono ancora frammenti ossei, utilizzare un ago calibro 29 per estrarre delicatamente i frammenti.

Per il trattamento CCL5, utilizzare una soluzione madre di CCL5 da 100 nanogrammi per millilitro e una matrice di membrana basale per ottenere una soluzione chemiotattica funzionante da 10 nanogrammi per millilitro. Per trattare la lesione, caricare una pipetta da 220 microlitri con cinque microlitri di soluzione e applicare due microlitri di chemochina sulla sutura. Quindi lasciare solidificare la matrice e coprire delicatamente la calvaria con il lembo cutaneo per garantire che il tessuto non si disidrati durante il trattamento chemochinale di un'ora.

Per l'imaging intravitale della migrazione delle cellule staminali periostali in tempo reale, prima di spostare il topo al microscopio, applicare una leggera pressione sulla parte posteriore della testa del topo per controllare il piano visivo della calvaria. Se il piano non è in piano, ruotare delicatamente il sistema di ritenuta del mouse a sinistra o a destra per regolare la posizione. Quindi, coprire l'intera calvaria in un lembo cutaneo con metilcellulosa sterile al 2% in acqua e posizionare il mouse sul tavolino del microscopio motorizzato dell'asse XYZ.

Utilizzando la luce epifluorescente, allineare il mouse in modo che sia rivolto verso il microscopio e che l'intersezione delle suture coronale e sagittale sia il punto di riferimento centrato del tavolino. Quindi posizionare una copertura di vetro sull'area di imaging e ricontrollare l'allineamento. Per l'imaging time-lapse della migrazione dentro e fuori dalla sutura, selezionare una lente a immersione in acqua a basso ingrandimento per scansionare la calvaria.

Acquisire un'immagine di riferimento dell'intersezione della sutura sagittale e coronale e, utilizzando l'SHG e i segnali fluorescenti delle cellule, localizzare ogni sito di lesione e registrare le coordinate XYZ e le distanze dalle suture sagittale e coronale. Selezionare una posizione sulle suture coronali o sagittali per l'imaging a lungo termine e ottenere un'immagine ZStack dettagliata di quest'area come riferimento durante l'imaging. Utilizzare le impostazioni del software time-lapse per registrare un'immagine ogni minuto per almeno un'ora, confrontando il campo visivo corrente con il campo visivo iniziale nel tempo tra le istantanee.

Se i campi visivi sono diversi, utilizzare l'immagine ZStack per determinare in quale direzione è necessario regolare il campo visivo. Recentemente, sono stati generati topi reporter GFP alfa-SMA di pomodoro Mx1 in cui le cellule staminali scheletriche periostali sono marcate da doppia marcatura Mx1 positiva alfa-SMA. Si osserva una migrazione minima o assente delle cellule staminali scheletriche periostali Mx1 positive alfa-SMA positive nell'arco di un periodo di un'ora di imaging, 24 ore dopo il posizionamento della sutura.

Il trattamento con chemochine CCL5 di un difetto della calvaria 24 ore dopo la lesione induce una migrazione direzionalmente distinta dalla sutura coronale verso il sito della lesione. In questa analisi rappresentativa, entro un'ora dall'imaging, una delle cellule staminali scheletriche periostali Mx1 positive alfa-SMA positive è migrata di circa 50 micrometri verso la lesione. L'aspetto più importante di questo protocollo da ricordare è quello di limitare il trattamento con CCL5 al sito della lesione al fine di stimolare la migrazione cellulo-specifica.

Una volta completata questa procedura, il trattamento localizzato può essere continuato per una settimana. Una micro TC può essere utilizzata per valutare la guarigione delle lesioni calvari e la deposizione di minerali.