Name: Studiare gli effetti del fumo di sigaretta sullinfezione da pseudomona nelle cellule epiteliali polmonari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Scopri come valutare la colonizzazione batterica da Pseudomonas in cellule epiteliali polmonari esposte a estratto di fumo di sigaretta. Questo metodo riproducibile aiuta a studiare l'impatto del fumo sulle infezioni respiratorie.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un National Institutes of Health R01 concede HL125435 e HL142997 (a C.

1. Preparazione 100% CSE
<ol><li>Disegnare 10 mL di supporti di coltura cellulare senza siero (DMEM/F12 per le cellule BEAS-2B; supporto basale epiteliale delle vie aeree per le cellule HSAEC) in una siringa da 60 mL.</li>
	<li>Attaccare inversamente una punta di pipetta da 1 mL tagliata in modo appropriato all'ugello della siringa come adattatore per contenere la sigaretta (3R4F).</li>
	<li>Rimuovere il filtro della sigaretta. Fissare una sigaretta all'adattatore della punta e bruciare la sigaretta.</li>
	<li>Disegnare 40 mL di aria contenente fumo in 10 mL di supporti senza siero. Mescolare il fumo con il mezzo agitando vigorosamente (30 s per pareggio).</li>
	<li>Ripetere il passaggio 1.4 circa 11x in 7 min fino a quando la sigaretta è completamente bruciata.</li>
	<li>Filtrare i 10 mL di supporti affumicati con un filtro da 0,22 m per escludere eventuali microrganismi e particelle insolubili. Trasferire in un tubo sterile chiuso. Preparare il CSE al 100% non più di 30 minuti prima del successivo saggio.</li>
</ol>2. Cultura Pseudomonas
<ol><li>Inoculare il P. aeruginosa (ceppo PAO1) o P. fluorescens Migula (ceppo PAO143) in un brodo di soia provata (TSB) per la coltura notturna a 37 gradi centigradi. NOTA: Per ottenere abbastanza batteri per la tatura, diffondere quanti più batteri possibile sulla piastra di agar TSB.</li>
	<li>Raccogliere uno striscio batterico e incubare in 20 mL di TSB con 5% di glicerolo come fonte di carbonio.</li>
	<li>Agitare la sospensione batterica in un'incubatrice di 37 gradi centigradi a 200 giri/min per 1 h fino a quando il valore OD600 è 0,6. CAUTION: Non lasciare che la velocità di agitazione superi i 200 giri/min. Velocità di agitazione più elevate possono danneggiare la morfologia della flagella batterica e influenzare l'invasione batterica nell'epitelia polmonare. Allo stesso modo, limitare il tempo di agitazione a 1 h per ottenere batteri altamente invasivi. Misurare il valore OD600 per stimare il numero di batteri. Un OD600 - 1 corrisponde a 109 unità di formatura colonia (CFU)/mL.</li>
</ol>3. Coltura delle cellule epiteliali polmonari umane e trattamento CSE
<ol><li>Coltura cellule umane BEAS-2B in media HITES (500 mL di DMEM/F12, 2,5 mg di insulina, 2,5 mg di trasferina, 2,5 mg di selenite di sodio, 2,5 mg di transferrina, 10 idrocortisone da 10 M, 10 M β-estradiolo, 10 mM HEPES e 2 mM L-glutamine) integrato con siero bovino fetale (FBS) come descrittoin precedenza 24.</li>
	<li>Coltura umana primaria piccole cellule epiteliali delle vie aeree (HSAEC) nel mezzo di coltura delle cellule epiteliali delle vie aeree (500 mL di Airway Cell Basal Medium, 500 g/mL HSA, 0,6 M acido linoleico, 0,6 g/mL lecithin, 6 mM L-glutamina, 0,4% estratto P, 1,0 1,0 M epinefrina, 5 g/mL transferrin, 10 nM T3, 1 g/mL hydrocortisone, rh EGF 5 ng/mL e 5 g/mL di insulina). Incubare le cellule a 37 gradi centigradi in 5% CO2.</li>
	<li>Dissociare le cellule con 1 mL di 0,25% di metapsina per 5 min fino a quando le cellule si staccano completamente dal fondo della piastra.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di mezzo HITES completo per neutralizzare la trypsina e raccogliere le cellule in un tubo da 15 mL. Centrifuga a 4 gradi centigradi a 300 x g per 5 min. CAUTION: Monitorare attentamente il tempo per la digestione della trypsina tramite microscopia, perché l'overdigestion può causare la morte delle cellule.</li>
	<li>Scartare il supernata e risundere le cellule in 2 mL di media HITES con 10% FBS.</li>
	<li>Pipetta 10 L della sospensione cellulare di cui sopra sulla piastra e inserirla in un contatore di celle automatizzate per ottenere la concentrazione nelle cellule/mL.</li>
	<li>Piastra BEAS-2B cellule ad una concentrazione di 3 × 105 cellule/ mL in 6 piastre di pozzo in un volume totale di 2 mL in HITES medio integrato con 10% di FBS per la coltura notturna.</li>
	<li>Trattare le cellule con circa l'80% di confluenza, o 5 x 105 cellule/mL, con 4% CSE per 3 h. Prima del trattamento CSE, cambiare il mezzo con il supporto HITES con l'1% di FBS.</li>
</ol>4. Infezione batterica
<ol><li>Aggiungere P. aeruginosa o P. fluorescens Migula (n. 1 × 107 CFU/mL) a ciascuna delle cellule trattate con CSE e incubare per 1 h a 37 gradi centigradi nel 5% di CO2.</li>
	<li>Aspirare i supernatanti e sostituirli con 2 mL di mezzo HITES fresco da trattare con 4% di CSE e 100 g/mL di gentamicina. NOTA: La gentamicina viene utilizzata perché non è in grado di penetrare le membrane cellulari epiteliali del polmone umano. Così, può uccidere tutti i batteri nel mezzo, ma non quelli che hanno invaso le cellule epiteliali polmonari.</li>
	<li>Dopo 1 h di trattamento CSE/gentamicina a 37 gradi centigradi nel 5% CO2, aspirare i supernatanti e lavare le cellule 3x con PBS per la successiva determinazione della concentrazione batterica. NOTA: Per confermare i batteri internalizzati, le cellule infettate con P. fluorescens Migula etichettate GFP sono state osservate sotto microscopia fluorescente.</li>
</ol>5. Determinazione della concentrazione batterica utilizzando il metodo della piastra di caduta
<ol><li>Per determinare il carico batterico nelle cellule infette con il metodo della piastra di rilascio, lavare le cellule trattate con gentamicina 2x con 2 mL di PBS freddo.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di buffer di lysi cellulare (0,5% triton X-100 in PBS) a ciascun pozzo.</li>
	<li>Diluire i lisati cellulari contenenti i batteri interiorizzati in un gradiente (1:10, 1:100, 1:1,000 e 1:10.000) per la seguente inoculazione alla piastra di agar TSB.</li>
	<li>Dopo 16 h di incubazione, ottenere i risultati della CFU contando le colonie batteriche.</li>
</ol>6. Rilevamento RT-qPCR di rRNA batterico 16S
<ol><li>Trattare le cellule epitelialipolmonari infettate da Pseudomonas (1 x 106 cellule/mL) con la gentamicina come descritto sopra. Aspirare il mezzo e lavare le cellule 2x con 2 mL di PBS freddo.</li>
	<li>Aggiungere 0,35 mL del tampone di lisi di diocianiato di guanidio per pozzo di una piastra di 6 possi. Raccogliere le cellule con un raschietto cellulare. Pipetta il licosato in un tubo microcentrifuge e mescolare delicatamente con la pipetta.</li>
	<li>Aggiungere lo stesso volume (0,35 mL) di etanolo appena preparato 70% nel llito e mescolare bene. Trasferire tutti i campioni in una colonna di rotazione collocata in un tubo di raccolta di 2 mL. Centrifuga a 10.000 x g per 30 s a 20-25 gradi centigradi. Quindi, eliminare il buffer nel tubo di raccolta.</li>
	<li>Lavare la colonna con 0,7 mL di buffer di lavaggio 1. Centrifugare la colonna a 10.000 x g per 30 s. Lavare la colonna 2x con 0,5 mL di tampone per lavare l'RNA legato alla membrana. Ripetere la centrifugazione a 10.000 x g per 2 min.</li>
	<li>Posizionare la colonna in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 mL. Aggiungere 30-50 L RNase-free acqua. Centrifuga a 10.000 x g per 1 min. Raccogliere il flusso e misurare la concentrazione di RNA.</li>
	<li>Eseguire una reazione di trascrizione inversa in base al protocollo del produttore. Mescolare 1 g di RNA totale con 10 mL di buffer di reazione, 1 L di trascrizione inversa e acqua senza RNase per una reazione di 20 L. Condurre la reazione di trascrizione inversa a 37 gradi centigradi per 1 h e poi a 95 gradi centigradi per 5 minuti.</li>
	<li>Mescolare i modelli di cDNA (1 L di ogni reazione di trascrizione inversa di cui sopra), 5 L del Master Mix contenente colorante SYBR, 1 L di ogni primer specifico da 200 nM e acqua in una miscela di 20 L per la seguente analisi PCR, secondo le raccomandazioni del produttore. NOTA: I primi sono i primer che prendono di mira il 16S rRNA di P. aeruginosa: avanti 5 -CAAAACTGAGCTAGAGTACG-3; invertire 5-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3. GAPDH è stato utilizzato come controllo di carico con i seguenti primer: avanti: 5 -GGCATGGACTGGTCATGA-3; retromarcia: 5'-TTCACCATGGAGAGGC-3'.</li>
	<li>Utilizzare il metodo <a0></a0> per determinare l'espressione.</li>
</ol>7. Rilevamento di Pseudomonas fluorescenti con citometria di flusso
<ol><li>Trattare le cellule epiteliali polmonariinfetti sopra (1 x 106 cellule/mL) con la gentamicina come descritto in precedenza. Aspirare il mezzo e lavare le cellule 2x con 2 mL di PBS freddo.</li>
	<li>Analizzare i campioni con un citometro di flusso ad una lunghezza d'onda di 509 nm per il rilevamento di GFP. Terminare ogni lettura a 100.000 conteggi. Analizzare i dati acquisiti con il software correlato.</li>
</ol>

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<li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009(2018).</li>
<li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li>
<li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'invasione batterica nelle cellule epiteliali polmonari è un passo cruciale nella patogenesi delle infezioni batteriche. Il processo di invasione batterica nelle cellule può essere suddiviso nei seguenti tre passaggi: In primo luogo, i batteri contatto e aderire alla superficie della cellula epiteliale utilizzando il loro flagella. In secondo luogo, i batteri subiscono l'internalizzazione o penetrano nella membrana cellulare. Infine, i batteri replicano e colonizzano le cellule se esfuggono con successo ai meccanismi di...

Il fumo di sigaretta influisce sulla salute pubblica di milioni di persone in tutto il mondo. Molte malattie deleterie, tra cui il cancro ai polmoni e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), sono segnalate per essere correlate al fumo disigaretta 1,2. Il fumo di sigaretta aumenta la suscettibilità alle infezioni microbiche acute nel sistemarespiratorio 3,4,5. Inoltre, prove crescenti dimostrano che il fumo di sigaretta migliora la patogenesi di molti disturbicronici 6,7,8. Ad esempio, il fumo di sigaretta può aumentare le infezioni virali o batteriche che causano l'esacerbazione dellaBPCO 9. Tra i patogeni batterici che contribuiscono etiologicamente all'esacerbazione acuta della BPCO, un patogeno opportunistico del bacillo gram-negativo, Pseudomonas aeruginosa, provoca infezioni che correlano con cattive prognosi e superiori morti10,11. L'esacerbazione della BPCO peggiora la malattia accelerando la progressione patologica. Non esistono terapie efficaci contro l'esacerbazione della BPCO ad eccezione della gestione antinfmatica12. L'esacerbazione della BPCO favorisce la mortalità dei pazienti, diminuisce la qualità della vita e aumenta l'onere economico per lasocietà 13.
Le vie respiratorie sono un sistema aperto, continuamente sottoposto a vari patogeni microbici presenti esternamente. I patogeni batterici opportunistici sono di solito rilevati nelle vie aeree superiori, ma a volte sono osservati nelle vieaeree inferiori 14,15. Nei modelli animali P. aeruginosa può essere rilevato nelle sacche di alveolar non appena 1 h dopo l'infezione16. Come principale meccanismo di difesa, le cellule immunitarie come macrofagi o neutrofili eliminano i batteri nelle vie aeree. Le cellule epiteliali polmonari, come prima barriera fisiologica, svolgono un ruolo unico nella difesa ospite contro le infezioni microbiche. Le cellule epiteliali polmonari possono regolare l'invasione microbica, la colonizzazione o la replicazione indipendentemente dalle celluleimmunitarie 17. Alcune molecole presenti nelle cellule epiteliali, tra cui PPARg, esercitano funzioni antibatteriche, regolando così la colonizzazione batterica e la replicazione nelle cellule epiteliali polmonari18. Il fumo di sigaretta può alterare le molecole e compromettere la normale funzione di difesa nelle cellule epitelialipolmonari 19,20. Recenti studi hanno segnalato l'esposizione diretta del fumo di sigaretta alle cellule epiteliali polmonari utilizzando l'apparato di fumo robot21,22. L'esposizione al fumo può essere eseguita in altri modi, tuttavia, compresa l'applicazione di CSE. La preparazione della CSE è un approccio riproducibile con potenziali applicazioni in altri tipi di cellule, comprese le cellule endoteliali vascolari che sono indirettamente esposte al fumo di sigaretta.
Questo rapporto descrive un protocollo per generare l'estratto di fumo di sigaretta per alterare il carico batterico nelle cellule epiteliali polmonari. CSE aumenta il carico batterico di P. aeruginosa, e può contribuire alla ricorrenza di infezioni batteriche di solito visto in esacerbazione BPCO. Un metodo convenzionale viene utilizzato per la preparazione di CSE. Le cellule epiteliali polmonari, nella loro fase di crescita esponenziale, sono trattate con 4% CSE per 3 h. In alternativa, le cellule epiteliali polmonari monostrato possono essere direttamente esposte al fumo di sigaretta in un'interfaccia aria-liquido. Le cellule trattate con CSE vengono quindi sfidate con Pseudomonas a una molteplicità di infezione (MOI) di 10. I batteri vengono propagati ad una particolare velocità di agitazione per garantire che la morfologia dei loro flagelli rimanga intatta per mantenere la loro piena capacità invasiva. La gentamicina viene impiegata per uccidere i batteri lasciati nel mezzo di coltura, riducendo così la potenziale contaminazione durante la successiva determinazione del carico batterico. Il protocollo utilizza anche Pseudomonasetichettata GFP , che è stato utilizzato come potente strumento nello studio dell'infezione da Pseudomonas in diversi modelli. Un ceppo rappresentativo è P. fluorescens Migula23. Il grado di infezione o carico batterico dopo il trattamento della CSE è determinato in tre modi: il metodo della piastra di caduta con conteggio delle colonie, la PCR quantitativa che utilizza primer specifici di 16S o la citometria di flusso nelle cellule infettate da Pseudomonas fluorescenti. Questo protocollo è un approccio semplice e riproducibile per studiare l'effetto del fumo di sigaretta sulle infezioni batteriche nelle cellule epiteliali polmonari.

<table><tbody><tr><td>Siringa da 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Terreno basale delle cellule epiteliali delle vie aeree</td><td>ATCC</td><td>PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore di batteri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di crescita delle cellule epiteliali bronchiali</td><td>ATCC</td><td>PCS-300-040</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di cellule</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Sistema</td> <td>di PCR in tempo realeKIT RNA-DNA ad alta capacità Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific 4387406</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HITES medio</td><td>ATCC ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>cellule BEAS-2B UMANE</td><td>ATCC ATCC</td><td>CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>cellule epiteliali primarie umane delle piccole vie aeree</td><td>ATCC ATCC</td><td>PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale Nikkon</td> Lettore <td>OD Nikkon</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>USA Primer scientifici</td><td></td><td></td></tr><tr><td>per PCR</td><td>ITD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>ATCC ATCC</td><td>ATCC 47085</td><td>PAO1-LAC</td></tr><tr><td>Pseudomonas fluorescens Migula</td><td>ATCC ATCC</td><td>27853</td><td>P.aeruginosa GFP</td></tr><tr><td>Sigarette per la ricerca (3R4F)</td><td>Università del Kentucky</td><td>TP-7-VA</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Inserto Transwell in PET Transprent</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brodo di soia triptico</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

studiare gli effetti del fumo di sigaretta sull'infezione da pseudomona nelle cellule epiteliali polmonari

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Il fumo di sigaretta è la principale causa eziologica per l'enfisema polmonare e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO). Il fumo di sigaretta promuove anche la suscettibilità alle infezioni batteriche nel sistema respiratorio. Tuttavia, gli effetti del fumo di sigaretta sulle infezioni batteriche nelle cellule epiteliali polmonari umane devono ancora essere studiati a fondo. Descritto qui è un protocollo dettagliato per la preparazione di estratti di fumo di sigaretta (CSE), il trattamento delle cellule epiteliali polmonari umane con CSE, e l'infezione batterica e la determinazione dell'infezione. CSE è stato preparato con un metodo convenzionale. Le cellule epiteliali polmonari sono state trattate con 4% CSE per 3 cellule trattate con CSE sono state, quindi, infettate da Pseudomonas a una molteplicità di infezione (MOI) di 10. I carichi batterici delle cellule sono stati determinati da tre diversi metodi. I risultati hanno mostrato che la CSE ha aumentato il carico di Pseudomonas nelle cellule epiteliali polmonari. Questo protocollo, quindi, fornisce un approccio semplice e riproducibile per studiare l'effetto del fumo di sigaretta sulle infezioni batteriche nelle cellule epiteliali polmonari.

Un diagramma viene utilizzato per illustrare il protocollo nella Figura 1. Le cellule beAS-2B epiteliali polmonari sono state trattate con CSE e sfidate con Pseudomonas. Pseudomonas nel mezzo di coltura sono stati uccisi dalla gentamicina aggiunta e le cellule sono state sottoposte al test della piastra di caduta, rt-qPCR rilevamento di Pseudomonas ribosome 16S RNA, e citometria di flusso. Rispetto al controllo, il trattamento CSE ha notevolmente aumentato l'infezi...

Descritto qui è un protocollo per studiare come l'estratto di fumo di sigaretta influisce sulla colonizzazione batterica nelle cellule epiteliali polmonari.

Studiare gli effetti del fumo di sigaretta sull'infezione da pseudomona nelle cellule epiteliali polmonari

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Questo protocollo utilizza tre approcci per determinare se il fumo di sigaretta influisce sulla carica batterica pseudomonas nelle cellule epiteliali polmonari. Questo metodo può essere espanso in celle endoteliali o altri rubinetti cellulari. La preparazione dell'estrazione del fumo di sigaretta, l'infezione batterica e la determinazione con una carica batterica sono ben descritte in dettaglio in questo video.Questa procedura è molto facile da seguire per i nuovi utenti. Disegnare 10 millilitri di mezzo di coltura cellulare privo di siero in una siringa da 60 millilitri. Attaccare l'estremità stretta di un rivestimento a una punta della pipetta millilitro all'ugello della siringa, come adattatore per tenere la sigaretta.Rimuovere il filtro dalla sigaretta e attaccare la sigaretta all'adattatore. Non più di 30 minuti prima di eseguire il saggio bruciano la sigaretta e disegnano 40 millilitri di fumo contenenti aria nella siringa. Mescolare il fumo con il mezzo scuotendo vigorosamente la siringa.Ripeti il processo di disegno fino a quando la sigaretta non viene completamente bruciata, il che richiederà circa 11 estrazioni in circa sette minuti. Per rimuovere microrganismi e particelle insolubili dal mezzo, filtrarlo attraverso un filtro da 0,22 micron. Quindi, trasferire il mezzo in un tubo sterile chiuso.Inoculare un brodo di soia triptico o una piastra di coclea TSB con un ceppo di pseudomonas selezionato. Incubare il piatto durante la notte a 37 gradi Celsius. Preparare un tubo contenente 20 millilitri di TSB con il 5% di glicerolo come fonte di carbonio.Raccogliere uno striscio dalla piastra della coclea e inoculare il TSB. Incubare la sospensione pseudomonas in uno shaker di 37 gradi Celsius a 200 RPM, per circa un'ora, fino a quando la densità ottica a 600 nanometri è 0,6. Dopo aver coltivato le cellule epiteliali polmonari come descritto nel manoscritto, aggiungere un millilitro dello 0,25% di tripside alle cellule.Dopo circa cinque minuti, quando le celle si sono completamente staccate dal fondo della piastra, aggiungere 10 millilitri di mezzo Heights completo per neutralizzare la tripina. Trasferire le celle in un tubo da 15 millilitri. Quindi, centrifugare le cellule per cinque minuti a quattro gradi Celsius e 300 volte G.Rimuovere e scartare il supernatante.Quindi, sospendere di nuovo le celle in millilitri di heights medium con 10%FBS. Pipetta 10 microlitri della sospensione cellulare epiteliale su una nuova piastra. Utilizzare un contatore di celle automatizzato per ottenere la concentrazione cellulare.Placcare le cellule epiteliali polmonari ad una concentrazione di tre volte 10 alla quinta cellule per millilitro, in un volume totale di due millilitri di mezzo per pozzo. Incubare i piatti durante la notte. Quando le celle raggiungono circa l'80% di confluenza, sostituire il mezzo con il mezzo Heights, più 1%FBS.Quindi, aggiungere il 4%CSE ai pozzi e incubare le piastre per tre ore. Aggiungere una pseudomonas ad ogni pozzo di cellule epiteliali polmonari trattate con CSE. Quindi, incubare le piastre per un'ora a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.Successivamente, sostituire il mezzo nelle sei piastre del pozzo con due millilitri di mezzo heights fresco, contenente 4%CSE e 100 microgrammi per millilitro di gentamicina. Dopo aver incubato le piastre per un'ora a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%, aspirare il mezzo dai pozzi. Lavare le cellule trattate con gentamicina, due volte, con due millilitri di PBS freddo.Il carico batterico nelle cellule epiteliali polmonari può quindi essere rilevato con il metodo della piastra di caduta, qRT-PCR o citometria del flusso. Aggiungere un millilitro di tampone dilisi cellulare ad ogni pozzo delle cellule epiteliali polmonari. Riparare le diluizioni seriali del lysate cellulare, che vanno da uno a 10 a uno a 10.000.Quindi inoculare la piastra della coclea TSB. Dopo 16 ore di incubazione, determinare quante unità di formazione della colonia erano presenti nelle cellule epiteliali polmonari, contando il numero di colonie batteriche. Aggiungere 0,35 millilitri del tampone di tiocianato di guanidinio ad ogni pozzo delle cellule epiteliali polmonari.Raccogliere le celle con un raschietto per celle. Pipettare il lysate in un tubo di micro-centrifuga e mescolare delicatamente con la pipetta. Aggiungere 0,35 millilitri di etanolo appena preparato al 70% di etanolo per il lysate e mescolare bene.Trasferire tutti i campioni in una colonna di rotazione posizionata in un tubo di raccolta da due millilitri. Centrifuga il tubo di raccolta per 30 secondi a 10.000 volte G e da 20 a 25 gradi Celsius. Scartare il tampone nel tubo di raccolta e lavare la colonna con 0,7 millilitri di tampone di lavaggio.Centrifugare la colonna a 10.000 volte G per 30 secondi. Lavare la colonna due volte con 0,5 millilitri di tampone. Ripetere la centrifugazione a 10.000 volte G per due minuti.Posizionare la colonna in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 millilitri e aggiungere da 30 a 50 microlitri di acqua priva di RNasi. Dopo aver centrifugato il tubo a 10.000 volte G per un minuto, raccogliere il flusso attraverso e misurare la concentrazione di RNA. Per prepararsi a una reazione di trascrizione inversa di 20 microlitri rende un microgrammo di RNA totale con 10 microlitri di buffer di reazione, un microlitro di transcriptasi inversa e acqua priva di RNasi.Condurre la reazione di trascrizione inversa a 37 gradi Celsius per un'ora e poi a 95 gradi Celsius per cinque minuti, secondo il protocollo del produttore. Quindi mescolare un microlitro di ogni campione di cDNA con cinque microlitri del mix master contenente colorante cibernetico e un microlitro di ogni primer specifico nanomolare 200. Aggiungere acqua per un volume totale di 20 microlitri.Eseguire l'analisi PCR, in base alle raccomandazioni del produttore. E poi usare il metodo CT comparativo per determinare l'espressione. Nelle cellule BEAS-2B, la vitalità non è aumentata considerevolmente quando le cellule sono state trattate con il 4%CSE per tre ore.Un'ora come infezione da pseudomonas inoltre non ha influenzato sostanzialmente la vitalità. Infine, usano la gentamicina per uccidere gli pseudomoni nel mezzo di coltura non hanno avuto un effetto statisticamente significativo sulla vitalità cellulare. Come misurato con il metodo della piastra di caduta, l'infezione batterica nelle cellule BEAS-2B è stata notevolmente aumentata dal trattamento con CSE.Lo stesso valeva per il trattamento CSE dell'HSAEC. L'infezione batterica delle cellule BEAS-2B trattate con CSE è stata valutata anche utilizzando RT-PCR per quantificare la quantità di 16S rRNA presente, che indicava un aumento di Pseudomonas aeruginosa. Le cellule BEAS-2B trattate con CSE e infettate da Pseudomonas fluorescens Migula sono state analizzate dalla citometria a flusso a 509 nanometri.Il risultato ha anche indicato che il trattamento CSE aumenta l'infezione batterica. I risultati della microscopia fluorescente hanno mostrato che i batteri etichettati GFP co-localizzati con cellule BEAS-2B in un esperimento di infezione da Pseudomonas fluorescens Migula. Le cellule potrebbero essere esposte al fumo di sigaretta con robot che fumano, il che può imitare il comportamento umano e consentire di studiare direttamente gli effetti del fumo di sigaretta sulle cellule epiteliali polmonari.Questa tecnica potrebbe essere utilizzata per esplorare un fumo di sigaretta su altri rubinetti cellulari nel contesto di un'infezione polmonare. L'approccio descritto è la base per lo sviluppo di terapie efficaci contro una lesione polmonare dorsale fumante di sigarette e c0PD extra

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Le cellule epiteliali polmonari può essere isolato dal tratto respiratorio dei topi e colto in aria-liquido come un modello di differenziazione dell'epitelio respiratorio. Un protocollo è descritto per l'isolamento, la coltura e l'esposizione di queste cellule al fumo di sigaretta tradizionale, al fine di studiare le risposte molecolari di questa tossina ambientale.

Isolamento di mouse cellule epiteliali delle vie respiratorie ed esposizione al fumo di sigaretta Sperimentale interfaccia Air Liquid

Source: Li, T., et al. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates how cigarette smoke extract weakens antimicrobial defense in lung epithelial cells by reducing AMP production, leading to increased bacterial invasion. The procedure measures intracellular bacterial load to assess the impact of smoke exposure on host-pathogen interactions.

Analyzing the Effects of Cigarette Smoke on Antimicrobial Defense in Lung Epithelial Cells

Descriviamo il metodo di agar-perle di stabilire persistente a lungo termine infezione delle vie respiratorie Pseudomonas aeruginosa cronica nel modello di topo.

Long Term cronica<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infezione delle vie aeree nei topi

L'obiettivo di questo protocollo è fornire metodi automatizzati per quantificare le patologie polmonari croniche in un modello murino di BPCO. Il protocollo include l'esposizione dei topi al fumo di sigaretta (CS), la misurazione della funzione polmonare, il gonfiaggio dei polmoni e l'utilizzo di metodi morfometrici per misurare l'enfisema e il rimodellamento delle piccole vie aeree nei topi.

Misurazione automatica di enfisema polmonare e piccole vie aeree ritocca in sigaretta Mice-fumo esposti

Lo scopo di questo protocollo è quello di esporre modelli organotipici di tessuto bronchiale e nasale 3D umano al fumo di sigaretta (CS) tradizionale all'interfaccia aria-liquido. L'impatto della CS sui tessuti viene quindi studiato utilizzando un saggio di attività del citocromo P450, una misurazione del battito delle ciglia e un approccio di biologia dei sistemi.

Valutazione dell&#39;impatto di esposizione ripetuta di organotipica 3D bronchiali e nasali coltura tissutale modelli di Whole fumo di sigaretta

Utilizzando saggi ottimizzati di cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) ex vivo, abbiamo dimostrato che una preparazione di prodotti del tabacco combustibile sopprime marcatamente le citochine secrete intracellulari mediate dal recettore e la capacità citolitica delle PBMC effettrici. Questi saggi rapidi possono essere utili nella valutazione del prodotto e nella comprensione dei potenziali effetti a lungo termine dell'esposizione al tabacco.

Metodi per valutare citotossicità e immunosoppressione di combustibile di tabacco preparati prodotti

Mentre lo studio in vitro delle interazioni ospite-patogeno consente la caratterizzazione di specifiche risposte immunitarie, sono necessari modelli in vivo per osservare gli effetti di risposte complesse. Utilizzando l'esposizione a Candida albicans seguita da un'infezione polmonare mediata da Pseudomonas aeruginosa, abbiamo stabilito un modello murino di interazioni microbiche coinvolte nella patogenicità della polmonite associata al ventilatore.

Studiare comunità microbiche<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di interazione ospite-mediata tra<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nei Airways

Presentato qui è un protocollo utile per la fissazione polmonare che crea una condizione stabile per la valutazione istologica di campioni polmonari da un modello murino di enfisema. Il vantaggio principale di questo modello è che può fissare molti polmoni con la stessa pressione costante senza collasso polmonare o deflazione.

Fissazione polmonare sotto pressione costante per la valutazione dell'enfisema nei topi

Questo protocollo dimostra lo studio degli effetti fisiopatologici del fumo di sigaretta (CS) con un sistema di esposizione all'inalazione di tutto il corpo (WBI) (WBIS) costruito internamente. Questo sistema può esporre gli animali a CS in condizioni ripetibili controllate per la ricerca di effetti mediati dalla CS sull'enfisema polmonare e sull'ematopoiesi.

Esposizione al fumo di sigaretta nei topi con un sistema di inalazione per tutto il corpo

Presentato qui è un metodo riproducibile, economico e robusto per l'isolamento e l'espansione delle cellule epiteliali bronchiali primarie per il biobanking a lungo termine e la generazione di cellule epiteliali differenziate mediante coltura all'interfaccia aria-liquido.

Isolare le cellule epiteliali bronchiali dal tessuto polmonare resecato per il biobanking e stabilire colture di interfaccia aria-liquido ben differenziate

Qui, descriviamo un modello in vitro per isolare e differenziare le cellule epiteliali delle vie aeree murine, concentrandosi sulla loro acclimatazione all'estratto di fumo di sigaretta cronico (CSE). Il modello potrebbe essere utilizzato per caratterizzare in modo completo l'impatto multi-omico della CSE, che potrebbe fornire informazioni sulle risposte cellulari in condizioni di esposizione cronica al fumo.

Modello in vitro per lo studio del differenziamento e dei cambiamenti di multi-omiche su cellule epiteliali delle vie aeree murine stimolate con estratto di fumo di sigaretta

Scopri come valutare la colonizzazione batterica da Pseudomonas in cellule epiteliali polmonari esposte a estratto di fumo di sigaretta. Questo metodo riproducibile aiuta a studiare l'impatto del fumo sulle infezioni respiratorie.

Studiare gli effetti del fumo di sigaretta sull'infezione da pseudomona nelle cellule epiteliali polmonari

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