Isolamento dei tessuti del sistema nervoso centrale e delle meningi associate per l'analisi a valle delle cellule immunitarie

Il rapido isolamento dei tessuti del SNC, comprese le meningi, consente un'analisi completa del fenotipo, della funzione e della localizzazione delle cellule immunitarie in condizioni omeostatiche e patogene. I due metodi dimostrati consentono l'estrazione rapida dei tessuti del SNC con le meningi, ideale per l'analisi a valle utilizzando tecniche a singola cellula e metodi istologici. Sebbene i risultati rappresentativi si concentrino sull'analisi delle cellule immunitarie, questi due metodi possono essere utilizzati per analizzare le cellule residenti nel SNC, tra cui microglia, astrociti, periciti, cellule endoteliali, cellule stromali e neuroni.

Inizia isolando campioni di cervello e midollo spinale da topi soppressi. Dopo aver rimosso la testa, praticare un'incisione sulla linea mediana nella pelle e capovolgerla sugli occhi per liberare il cranio. Tagliare l'osso nasale per liberare la mandibola dal cranio.

Quindi rimuovere la mandibola, la lingua e gli occhi. Tagliare lungo le parti laterali del cranio per rilasciare il tessuto lungo il meato uditivo esterno e tagliarlo. Per raccogliere il campione di midollo spinale, separare la gabbia toracica dalla colonna vertebrale tagliandola parallelamente alla colonna vertebrale con forbici affilate.

Fai un piccolo taglio nella regione lombare inferiore per isolare la colonna vertebrale, quindi taglia e rimuovi il muscolo rimanente lungo la colonna vertebrale per esporre le vertebre. Quando si esegue la decalcificazione, controllare quotidianamente l'osso per determinare se è morbido e flessibile. Rimuovere il tessuto dalla soluzione EDTA con una pinza, posizionarlo su una piastra di Petri e testare delicatamente la morbidezza dell'osso con un ago calibro 25.

Se l'ago penetra facilmente nell'osso, il processo di decalcificazione è completo. Per estrarre la calotta cranica nel cervello, praticare un'incisione sulla linea mediana della pelle e capovolgere la pelle sugli occhi. Posiziona le forbici all'interno del forame magna e inizia a tagliare il cranio lateralmente lungo le cortecce verso il bulbo olfattivo, mantenendo le incisioni sopra il meato uditivo esterno e la mandibola.

Eseguire gli stessi tagli sul lato opposto con tagli che si incontrano al bulbo olfattivo per liberare la calotta cranica dal cervello. Usando una pinza, staccare la calotta cranica e metterla in un tubo conico da 15 millilitri contenente cinque millilitri di terreno RPMI freddo integrato con HEPES da 25 millimolari. Posiziona le pinze curve sotto la base del cervello e sollevale per liberare il cervello dalla calotta cranica.

Estrarre la colonna vertebrale e il tessuto del midollo spinale tagliando parallelamente alla colonna vertebrale per separare la gabbia toracica dalla colonna vertebrale. Quindi praticare un piccolo taglio nella regione lombare inferiore per isolare la colonna vertebrale. Taglia e rimuovi qualsiasi muscolo rimanente lungo la colonna vertebrale per esporre le vertebre.

Quindi, posizionare le forbici chirurgiche extra sottili all'interno della colonna vertebrale e tagliare lungo il bordo laterale della colonna. Tagliare completamente il bordo laterale opposto per dividere la colonna vertebrale in una porzione anteriore e una posteriore. Usa una pinza per staccare il midollo spinale lentamente e con attenzione dalla colonna vertebrale e mettilo in un tubo conico da 15 millilitri contenente cinque millilitri di RPMI freddo con HEPES da 25 millimolari.

Quindi trasferire le porzioni anteriore e posteriore della colonna vertebrale in un altro tubo. Per rimuovere le meningi dalla calotta cranica, estrarre la calotta cranica dal supporto RPMI e utilizzare una pinza affilata per incidere attorno al bordo esterno. Staccare le meningi dal bordo della calotta cranica, raschiando per rimuovere le meningi durali e aracnoidee e posizionare le meningi su una capsula di Petri.

Per rimuovere le meningi dalla colonna vertebrale, estrarre la colonna dal mezzo e incidere attorno ai bordi della colonna vertebrale con una pinza affilata per liberare le meningi. Usa una pinza curva per staccare le meningi dal bordo delle vertebre e posiziona le meningi su una capsula di Petri. Metti un colino a rete di nylon in un tubo conico da 50 millilitri.

Per creare una sospensione cellulare, spostare le meningi in un colino e aggiungere tre millilitri di RPMI integrato con HEPES, quindi utilizzare uno stantuffo da una siringa da cinque millilitri per macinare il tessuto e il terreno attraverso il colino. Versare il tessuto cerebrale o del midollo spinale con il terreno in una piastra di Petri da 100 millimetri e utilizzare una pinza per spostare il tessuto sul fondo. Tritare il tessuto cerebrale con una lama di rasoio sterile e raccogliere il tessuto sul fondo della piastra.

Aggiungere tre millilitri di RPMI integrati con il 10% di FCS alla piastra di Petri, quindi utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per risospendere il tessuto nel terreno e trasferirlo in una provetta conica da 15 millilitri. Aggiungere collagenasi di tipo 1 e DNasi 1 al tessuto e incubare le provette in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 40 minuti. Capovolgere le provette ogni 15 minuti per mescolare accuratamente il tessuto con gli enzimi.

Dopo l'incubazione, aggiungere EDTA a ciascuna provetta per una concentrazione finale di 0,01 molari e incubare le provette per altri cinque minuti per inattivare la collagenasi. Aggiungere nove millilitri di RPMI integrati con il 10% di FCS a ciascuna provetta, quindi centrifugare le provette a 450 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzare una pipetta Pasteur con vuoto per aspirare il surnatante, facendo attenzione a non toccare il pellet cellulare.

Aggiungere tre millilitri di soluzione stock di gradiente di densità isotonica al 100% al pellet cellulare, quindi aggiungere ulteriori terreni RPMI 10%FCS per portare il volume finale a 10 millilitri e risospendere il pellet cellulare. Capovolgere e mescolare bene la provetta, quindi inserire una pipetta sierologica con un millilitro di soluzione stock a gradiente di densità isotonica al 70% sul fondo della provetta. Stendere lentamente la soluzione, facendo attenzione a non formare bolle.

Rimuovere la pipetta sierologica dalla provetta, facendo attenzione a non disturbare la sfumatura. Centrifugare la provetta a 800 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius, quindi aspirare il surnatante, compreso lo strato di detriti di mielina, fino a quando rimangono due o tre millilitri nella provetta. Utilizzare una pipetta da un millilitro per raccogliere lo strato cellulare compreso tra il gradiente di densità del 30% e il 70% e trasferirlo in una nuova provetta da 15 millilitri.

Aggiungere il terreno RPMI 10%FCS per portare il volume finale a 15 millilitri, quindi centrifugare le celle a 450 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Questo protocollo è stato utilizzato per valutare le cellule B e T nelle meningi, nel cervello e nel midollo spinale durante la sclerosi multipla progressiva. Il gating è stato condotto per distinguere le cellule immunitarie infiltranti CD45 ad alta derivazione periferica dalle microglia CD45 basse e dai neuroni, astrociti e oligodendrociti CD45 negativi.

Poche cellule CD45 erano presenti nel midollo spinale e nel tessuto cerebrale dei topi trattati con sham. Lo stesso cutoff di gating per l'alta espressione di CD45 è stato utilizzato nelle meningi per identificare le cellule immunitarie CD45 ad alto numero di cellule ed escludere le cellule non immunitarie. In tutti i tessuti TMEV-IDD CNS, sono state osservate percentuali aumentate di cellule immunitarie CD45 elevate rispetto ai topi trattati con sham.

Durante la TMEV-IDD cronica, la percentuale di cellule B tra le cellule immunitarie CD45 alte nel cervello e nel midollo spinale era più alta rispetto al compartimento meningeo. I cervelli decalcificati e il midollo spinale sono stati sottoposti a imaging per identificare la localizzazione delle cellule B e T all'interno del compartimento del SNC. L'estrazione convenzionale del cervello dalla calotta cranica ha portato a uno strato di pia intatto, ma i restanti strati meningei sono stati esclusi.

Sia nel cervello decalcificato che nel midollo spinale, tutti gli strati meningei erano intatti. Le cellule B e le cellule T sono state localizzate con espressione di IgG e CD3, rispettivamente. La cocolorazione delle IgG con ER-TR7 ha rivelato che le cellule B erano presenti nel parenchima del SNC e nelle meningi, mentre gli aggregati cellulari all'interno delle meningi ER-TR7 positive contenevano più cellule B IgG positive e cellule T CD3 positive.

Un passaggio critico di questi protocolli è l'attenta estrazione dei tessuti del SNC, essenziale per migliorare la purezza delle sospensioni di singole cellule e per ottenere tessuti istologici con morfologia di alta qualità. Le tecniche descritte consentono l'analisi completa delle cellule che occupano il compartimento del SNC, ideale per esaminare il fenotipo, la funzione e la localizzazione cellulare in omeostasi e durante la patogenesi della malattia.