Differenziazione neuronale dalle cellule staminali embrionali del topo in vitro
2 giugno 2020
Qui, abbiamo stabilito un metodo a basso costo e facile da usare che indirizza una differenziazione rapida ed efficiente dalle cellule staminali embrionali ai neuroni. Questo metodo è adatto per la popolarità tra i laboratori e può essere uno strumento utile per la ricerca neurologica.
La differenziazione neuronale da saggi murini è un modello eccellente per illustrare i meccanismi chiave coinvolti nella neurogenesi. Dimostriamo un metodo ottimizzato per la neurogenesi embrioide utilizzando una strategia di screening toro aziendale. Questa tecnica presenta i vantaggi di alta efficienza, basso costo e facilità d'uso ed è adatta per la divulgazione tra i laboratori.
È un potente strumento per la ricerca nelle neuroscienze. Per eseguire la differenziazione utilizzando il primo protocollo, seminare 20.000 cellule staminali embrioidi di topo in due millilitri di terreno di differenziazione basale in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti rivestita di gelatina allo 0,1%. Dopo l'attacco delle cellule, lavare le cellule con due millilitri di PBS e aggiungere due millilitri di terreno di differenziazione basale a ciascun pozzetto, quindi rimettere le cellule nell'incubatore.
Lasciare che le cellule si differenzino per otto giorni, sostituendo il terreno ogni due giorni. Per eseguire il secondo protocollo, aggiungere 1,5 milioni di cellule staminali embrioidi di topo in una capsula batterica non adesiva in 10 millilitri di terreno di differenziazione basale e incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per consentire la formazione del corpo embrioide. Dopo due giorni trasferire gli aggregati cellulari in provette da centrifuga da 15 millilitri e lasciarli sedimentare per gravità.
Rimuovere il surnatante e aggiungere 10 millilitri di terreno di differenziazione basale fresco per risospendere i corpi embrioidi. Quindi ripiantali in un nuovo piatto non adesivo e incubali per altri due giorni. Raccogliere e seminare circa 50 corpi embrioidi in due millilitri di terreno di differenziazione basale per pozzetto su una piastra a sei pozzetti rivestita di gelatina.
Per l'induzione dell'acido retinoico, aggiungere due microlitri di brodo di AR in ciascun pozzetto fino a una concentrazione finale di un micromolare. Rimetti la piastra nell'incubatrice e differenzia le cellule per altri quattro giorni. Per eseguire la differenziazione utilizzando il protocollo tre, ripetere il protocollo due ma prevedere solo due giorni per la formazione del corpo embrionale e sei giorni per l'induzione dell'artrite reumatoide.
Il controllo di qualità della formazione dei corpi embrioidi deve essere effettuato mediante microscopia. Solo chi ha nuclei brillanti può differenziarsi con successo nel processo successivo. Per il protocollo quattro, seminare 20.000 cellule staminali embrionali di topo per pozzetto nelle piastre rivestite di gelatina e seguire il primo protocollo.
Dopo aver lasciato che le cellule si differenziassero per quattro giorni, aggiungere due microlitri di tutto il brodo trans RA in ciascun pozzetto e incubare la piastra per altri quattro giorni. Per eseguire il protocollo cinque, ripetere il protocollo quattro ma iniziare l'induzione dell'artrite reumatoide dopo soli due giorni di differenziazione. Per il protocollo sei, piantare 1,5 milioni di cellule staminali in una capsula batterica non adesiva in 10 millilitri di terreno N2B27 due e incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per consentire la formazione del corpo embrioide.
Dopo due giorni, raccogliere gli aggregati cellulari come descritto in precedenza e risospendere i corpi embrioidi con 10 millilitri di terreno 2 N2B27 fresco. Ripiantarli in una nuova capsula batterica non adesiva e lasciare la differenziazione per altri due giorni. Il quarto giorno, raccogliere e seminare circa 50 corpi embrioidi per pozzetto su piastre a sei pozzetti rivestite di gelatina con due millilitri di terreno N2B27 due.
Aggiungere due microlitri di tutto il brodo trans RA in ciascun pozzetto e indurre la differenziazione per altri quattro giorni. Per eseguire il protocollo sette, seminare circa 20.000 cellule in due millilitri di terreno di differenziazione basale per pozzetto sulle piastre rivestite di gelatina. Dopo l'attacco delle cellule e due lavaggi con PBS, aggiungere due millilitri di terreno N2B7, due per ciascun pozzetto, e lasciare che le cellule si differenzino per otto giorni a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Dopo aver eseguito la differenziazione della fase uno utilizzando il protocollo tre, seminare circa 500.000 derivati di cellule staminali embrionali di topo in due millilitri di terreno di differenziazione basale per pozzetto sulle piastre rivestite di gelatina allo 0,1%. Dividere casualmente le derivate in tre gruppi per testare i protocolli di differenziazione di tre fasi due. Incubare la piastra per sei ore, quindi lavare le cellule due volte con due millilitri di PBS e aggiungere due millilitri di terreno di differenziazione basale N2B27 uno o N2B27 due a ciascun pozzetto, a seconda del protocollo.
Posizionare le lame nell'incubatrice e lasciare che le cellule si differenzino per altri 10 giorni, cambiando il terreno corrispondente ogni due giorni. Sono stati testati sette protocolli per determinare il protocollo ottimale per la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in cellule precursori generali o NPC. I protocolli sono stati testati sia su blocchi A2lox che su 129 cellule e lo stato di differenziazione di ciascun gruppo è stato monitorato utilizzando un microscopio ottico.
La maggior parte dei derivati di A2lox e 129 hanno mostrato morfologie ben impilate e simili a neuriti secondo il protocollo tre, indicando la formazione di NPC. Tuttavia, le cellule differenziate utilizzando il protocollo due sono apparse apoptotiche, il che può essere dovuto alla mancanza di nutrienti all'interno dei corpi embrioidi. Per confermare ulteriormente la formazione di NPC, le cellule nestin-positive sono state rilevate utilizzando un test di immunofluorescenza.
Il terzo protocollo ha portato alla più alta percentuale di cellule nestin-positive, raggiungendo rispettivamente il 78 e il 69% nei derivati A2lox e 129. Sono stati testati tre protocolli per la differenziazione delle NPC in neuroni. È stato determinato che il protocollo tre induce più efficacemente la differenziazione.
La maggior parte dei derivati di A2lox e 129 nella fase due del protocollo tre presentavano strutture simili a neuroni prolungate con neuriti chiari ed estensioni del corpo cellulare. I saggi di immunofluorescenza hanno ulteriormente confermato la generazione di neuroni con la percentuale di beta tubulina tre cellule positive fino al 68 e al 59% rispettivamente in A2lox e 129 derivati utilizzando il protocollo tre. Quando si tenta questa procedura, è importante assicurarsi che i test sui topi siano sani e non differenziati prima della differenziazione.
Inoltre, un rigoroso controllo di qualità dovrebbe essere effettuato dopo la formazione nei corpi di trivellazione e prima della differenziazione della fase due. Questa tecnica fornisce un modello standard per i ricercatori di neurobiologia e biologia dello sviluppo e si prevede che sia un potente strumento per illustrare i meccanismi chiave coinvolti nella neurogenesi.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo ottimizzato ed economico per la differenziazione di cellule staminali embrionali in neuroni. Utilizzando saggi su cellule staminali embrionali di topo, la tecnica dimostra un'elevata efficienza e semplicità, risultando ideale per un uso diffuso nei laboratori impegnati nella ricerca neurologica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Differenziamento cellulare
- Biologia delle cellule staminali
Sfondo
- La differenziazione neuronale è fondamentale per comprendere la neurogenesi.
- I modelli di cellule staminali embrionali sono efficaci per lo studio dello sviluppo cellulare.
- I protocolli ottimali possono migliorare il rendimento e la vitalità delle cellule differenziate.
Scopo dello studio
- Stabilire un metodo standard ed efficiente per ottenere neuroni da cellule staminali embrionali.
- Facilitare l'utilizzo di questo metodo in diversi laboratori.
- Valutare diversi protocolli per ottenere i migliori risultati nella differenziazione cellulare.
Metodi Utilizzati
- Coltura cellulare in piastre rivestite con gelatina e in piatti batteriologici non adesivi.
- Cellule staminali embrionali murine come modello biologico per la differenziazione.
- Sette protocolli di differenziazione che prevedono condizioni variabili per la formazione di corpi embrionoidi e l'induzione con acido retinoico.
- Monitoraggio della differenziazione mediante microscopia e saggi di immunofluorescenza.
- Misure di controllo qualità per la vitalità dei corpi embrionoidi e il successo della differenziazione.
Risultati principali
- Il protocollo tre ha prodotto la percentuale più elevata di cellule precursori neurali positive per la nestina (78% in A2lox e 69% nei derivati 129).
- Neuroni positivi per la beta-tubulina III sono stati osservati con frequenze del 68% e del 59% rispettivamente per A2lox e derivati 129.
- Il controllo qualità ha indicato che corpi embrionoidi sani sono cruciali per una differenziazione riuscita.
Conclusioni
- Questo studio fornisce uno strumento solido per la differenziazione delle cellule staminali embrionali in neuroni, potenziando la ricerca in neurobiologia.
- Le metodologie descritte possono essere adattate per applicazioni più ampie in biologia dello sviluppo.
- Crea opportunità per una migliore comprensione dello sviluppo neuronale e dei disturbi correlati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La creazione di modelli in vitro affidabili di neurogenesi è fondamentale per la validazione degli obiettivi nei programmi sulle malattie neurodegenerative. Questo metodo fornisce un sistema scalabile ed economico per generare cellule precursori neurali e neuroni da cellule staminali embrionali di topo, supportando la riduzione del rischio meccanicistica nelle fasi iniziali. L'approccio consente screening fenotipici riproducibili e lo sviluppo di saggi per studi sulla modulazione delle vie di segnalazione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche nei percorsi di sviluppo neurologico mediante un sistema definito di differenziazione.
- Valore operativo: Fornisce una fonte rinnovabile di cellule precursori neurali positive per la nestina, utili in studi di interazione con il bersaglio.
- Valore predittivo: Favorisce l'allineamento dei biomarcatori attraverso parametri quantificabili, come la generazione di neuroni positivi per la beta-tubulina III.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera popolazioni neuronali standardizzate adatte a saggi di screening di composti e di modulazione di vie metaboliche.
- Valore operativo: Utilizza protocolli economici e di facile esecuzione, compatibili con formati a piastre multipozzetto per l'analisi ad alto rendimento.
- Valore di riproducibilità: La formazione definita di corpi embrioidali e i passaggi di induzione con acido retinoico garantiscono coerenza tra diversi lotti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Produce cellule neurali rilevanti per la patologia che modellano meccanismi chiave della neurogenesi per la validazione di bersagli.
- Valore operativo: Supporta la maturazione longitudinale nel mezzo N2B27 II per un mantenimento prolungato dei neuroni e saggi funzionali.
- Continuità traslazionale: Collega la differenziazione delle cellule staminali nella fase di scoperta ai flussi di lavoro della ricerca neurobiologica preclinica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, consentendo l'uso di modelli neurali derivati da cellule staminali per la verifica delle ipotesi sui bersagli e la preparazione dei saggi prima degli sforzi di identificazione del capostazione.
- Biologia della scoperta: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico fornendo un sistema controllato per lo studio delle vie neurogeniche e della dinamica della differenziazione.
- Screening: Fornisce letture quantificabili, basate su microscopia e immunofluorescenza, per la valutazione dell'effetto dei composti sulle popolazioni di precursori neurali e di neuroni.
- Analisi: Genera metriche percentuali di efficienza della differenziazione (nestina+, beta-tubulina III+) che supportano l'analisi comparativa delle condizioni e la selezione dei risultati positivi.
- Ricerca traslazionale: Permette una continuità dalla differenziazione delle cellule staminali alla maturazione neuronale, per la successiva validazione fenotipica e funzionale.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di differenziazione standardizzata e riutilizzabile, applicabile a diversi progetti di neurobiologia e biologia dello sviluppo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione degli obiettivi attraverso la generazione riproducibile di cellule precursori neurali e neuroni da mESCs.
- Valore operativo: Riduce la variabilità tecnica mediante un controllo di qualità definito degli embriocorpi e fasi temporizzate di induzione con acido retinoico.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza delle decisioni di avanzamento o interruzione fornendo letture biologiche precoci in un sistema fisiologicamente rilevante.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei target aggiustata per il rischio, consentendo la riduzione del rischio meccanicistica nei percorsi di neurogenesi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule staminali, nella manipolazione di corpi embrionidi e nelle tecniche di saggio di immunofluorescenza.
- È dipendente da piastre rivestite con gelatina, piatti batteriologici non adesivi e condizioni controllate di incubazione (37°C, 5% CO2).
- Necessita della standardizzazione della preparazione del stock di acido retinoico e della valutazione della qualità dei corpi embrionidi mediante microscopia.
- Comporta considerazioni di adattamento nel trasferire i protocolli tra linee di mESC (ad esempio, A2lox rispetto a derivati del ceppo 129).
- È limitato dalla necessità di un rigoroso controllo qualità dello stato di salute dei corpi embrionidi prima dell'induzione con acido retinoico, al fine di garantire il successo della differenziazione.
