Name: Uninstallazione su piccola scala per il test della tossicità delle alghe di nanomateriali e altre sostanze difficili (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Scopri la piattaforma LEVITATT per il test di tossicità delle alghe su nanomateriali e sostanze colorate. Utilizza illuminazione LED per garantire campo luminoso uniforme e minimizzare il surriscaldamento durante l'esposizione.

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Questa ricerca è stata finanziata da PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, Grant agreement 760813 nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020.

1. Descrizione dell'impostazione LEVITATT
<ol><li>Utilizzare fiale di vetro scintillante da 20 mL(Figura 1, inserto 1) che consente la penetrazione della luce. In alternativa, è possibile utilizzare fiale di plastica penetrabili leggere. Quantificare l'intensità della luce utilizzando un fotometro.</li>
	<li>Utilizzare almeno una sospensione di prova di 4 mL all'inizio del test per consentire la quantificazione della biomassa e per la caratterizzazione/quantificazione dei nanomateriali durante e dopo l'incubazione (Figura 1, inserire 2).</li>
	<li>Montare le fiale di scintillazione di 20 mL con un tappo(Figura 1, inserto 3) dove viene forato un piccolo foro (circa 1 mm di diametro) per consentire lo scambio di CO2 con l'atmosfera. Questo scambio è fondamentale per garantire livelli stabili di pH e CO2 durante i test.</li>
	<li>Per le sostanze volatili, utilizzare un tappo rivestito in Teflon a tenuta d'aria per consentire l'arricchimento di CO2 dello spazio della testautilizzando una siringa 9 o flaconi completamente chiusi senza fase di gas in cui la CO2 viene mantenuta in soluzione da un sistema di tampone di sodio arricchito (NaHCO3)10.</li>
	<li>Fissare le fiale con morsetti montati sull'involucro esterno (Figura 1, inserire 4).</li>
	<li>Utilizzare una sorgente luminosa a LED situata sotto le fiale di prova(Figura 1, inserto 5) che fornisca un'illuminazione fluorescente uniforme di tipo "cool-white" o "daylight" e un'intensità di luce nell'intervallo 60-120-E∙m -2∙s-1 misurato nell'intervallo di lunghezza d∙ onda fotosinteticamente efficace di 400 nm a 700 nm. L'installazione impiega un'intensità di luce regolabile nell'intervallo 5∙-E∙m-2∙-1 montando un dimmer leggero alla sorgente. Ciò consente di testare intensità di luce sempre più elevate.</li>
	<li>Montare l'installazione su uno shaker orbitale per agitare i campioni per tutta la durata del test. Ciò mantiene le celle in sospensione libera e facilita il trasferimento di massa di CO2 dall'aria all'acqua(Figura 1, inserto 6).</li>
	<li>Posizionare l'installazione in una stanza a temperatura controllata o in un armadio termostatico per mantenere temperature stabili durante i test(Figura 1, inserire 7).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61209/61209fig1v2.jpg"> Figura 1: Immagine della tabella di illuminazione verticale a LED per i test di tossicità delle alghe (LEVITATT). 1) 20 mL di vetro per l'incubazione, 2) campione da 4 mL per l'analisi, 3) coperchio con foro forato per lo scambio di CO2, 4) involucro per condizioni di luce definite, 5) sorgente luminosa a LED situata al centro dell'involucro, 6) agitatore orbitale per l'agitazione durante l'esperimento e 7) un armadio termostatico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61209/61209fig1v2large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
2. Preparazione del mezzo di crescita delle alghe
<ol><li>Il mezzo di crescita delle alghe ISO 8692 è costituito da quattro diverse soluzioni azionarie. Pesare la quantità appropriata di sali e diluire in acqua ultrapura secondo la tabella 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Soluzioni stock</td>
			<td>Nutriente</td>
			<td>Concentrazione nella soluzione stock</td>
			<td>Concentrazione nella soluzione di test</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">1: Macronutrienti</td>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>1,5 g/L</td>
			<td>15 mg/L (N: 3,9 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2∙6H2O</td>
			<td>1,2 g/L</td>
			<td>12 mg/L (Mg: 2,9 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2∙2H2O</td>
			<td>1,8 g/L</td>
			<td>18 mg/L (Ca: 4,9 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4∙7H2O</td>
			<td>1,5 g/L</td>
			<td>15 mg/L (S: 1,95 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>0,16 g/L</td>
			<td>1,6 mg/L (P: 0,36 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">2: Fe-EDTA</td>
			<td>FeCl3∙6H2O</td>
			<td>64 mg/L</td>
			<td>64 g/L (Fe: 13 g/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2EDTA∙2H2O</td>
			<td>100 mg/L</td>
			<td>100 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">3: Traccia elementi</td>
			<td>H3BO3a
</td>
			<td>185 mg/L</td>
			<td>185 g/L (B: 32 g/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnCl2∙4H2O</td>
			<td>415 mg/L</td>
			<td>415 g/L (Mn: 115 g/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cl2
</td>
			<td>3 mg/L</td>
			<td>3 g/L (n: 1,4 g/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CoCl2∙6H2O</td>
			<td>1,5 mg/L</td>
			<td>1,5 g/L (Co: 0,37 g/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CuCl2∙2H2O</td>
			<td>0,01 mg/L</td>
			<td>0,01 g/L (Cu: 3,7 ng/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2MoO4∙2H2O</td>
			<td>7 mg/L</td>
			<td>7 g/L (Mo: 2,8 g/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4: NaHCO3</td>
			<td>NaHCO3
</td>
			<td>50 g/L</td>
			<td>50 mg/L (C: 7,14 mg/L)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Concentrazioni di sostanze nutritive nelle soluzioni di stock per il mezzo di crescita delle alghe
NOTA: H3BO3 può essere disciolto aggiungendo 0,1 M NaOH. L'EDTA deve essere rimosso durante la prova dei metalli, per evitare la complessità con gli ioni metallici. Sterilizzare le soluzioni di stock per filtrazione a membrana (diametro dei pori medio 0,2 m) o mediante autoclaving (120 gradi centigradi, 15 min). Non fare soluzioni di stock autoclave 2 e 4, ma sterilizzarli mediante filtrazione della membrana. Conservare le soluzioni al buio a 4 gradi centigradi.
<ol start="2"><li>Per produrre 1 L di mezzo di crescita algale, trasferire 500 mL di acqua ultrapura sterilizzata in una fiaschetta volumetrica sterilizzata da 1 L e aggiungere 10 mL di soluzione di stock 1: Macronutrienti, 1 mL di soluzione di stock 2: Fe-EDTA, 1 mL di soluzione di stock 3: elementi di traccia e 1 mL di soluzione di stock 4: NaHCO3.</li>
	<li>Riempire fino a 1 L con acqua ultrapura sterilizzata, fermare il pallone e agitare accuratamente per omogeneizzare il mezzo di crescita delle alghe.</li>
	<li>Equilibrare la soluzione prima dell'uso lasciandola durante la notte a contatto con l'aria o gorgogliando con aria sterile e filtrata per 30 min. Dopo l'equilibrio, regolare il pH, se necessario, su pH 8,1 ± 0,2, con 1 M HCl o 1 M NaOH.</li>
</ol>3. Impostazione del test algale
NOTA: un diagramma di flusso della procedura di test algale è illustrato nella Figura 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61209/61209fig2v6.jpg"> Figura 2: diagramma di flusso della configurazione di test algale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61209/61209fig2v2large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol><li>Preparare una soluzione di stock del composto di prova alla concentrazione di prova più elevata desiderata nel mezzo di crescita delle alghe preparato secondo il punto 2. Per la preparazione di soluzioni/sospensioni azionarie, seguire OCSE 201 (per composti solubili) o OCSE 318 (per i nanomateriali).</li>
	<li>Misurare il pH nella soluzione stock. Se si discosta più di un'unità dal mezzo di crescita delle alghe, regolare il pH a 8 con 1 M HCl o 1 M NaOH.</li>
	<li>Calcolare il volume di inoculum necessario per raggiungere una concentrazione finale di cellule di 1 x 104 cellule/mL in una soluzione di prova a 25 mL. NOTA: L'inoculum dovrebbe provenire da una cultura di Raphidocelis subcapitata in crescita esponenziale incontaminata coltivata utilizzando l'impostazione LEVITATT.</li>
	<li>Calcolare la quantità di soluzione di stock da aggiungere a ogni pallone volumetrico da 25 mL per ottenere le concentrazioni di prova desiderate. Il fattore tra ciascuna concentrazione non deve superare il 3,2.</li>
	<li>Contrassegnare una fiaschetta volumetrica da 25 mL per ogni concentrazione scelta e un ulteriore controllo marcato di flacone volumetrico da 25 mL.</li>
	<li>Aggiungere la quantità di soluzione di stock del composto di prova necessaria per raggiungere le concentrazioni desiderate al pallone volumetrico da 25 mL. Non aggiungere la soluzione stock al controllo.</li>
	<li>Aggiungere il supporto ad ogni pallone volumetrico da 25 mL per raggiungere un volume di circa 20 mL.</li>
	<li>Aggiungere il volume di inoculum calcolato al punto 3.3 ad ogni pallone volumetrico da 25 mL. Aggiungere il supporto ad ogni pallone volumetrico da 25 mL ad un volume totale finale di 25 mL.</li>
	<li>Fermare i flaconi e mescolare accuratamente girando i flaconi due volte verticalmente.</li>
	<li>Trasferire 0,4 mL da ogni pallone in singole fiale a vite e aggiungere 1,6 mL di acetone (saturato con MgCO3):un campione per ogni concentrazione di prova e il controllo. Chiudere i coperchi e conservare al buio a temperatura ambiente fino a quando non vengono misurate la fluorescenza (sezione 4).</li>
	<li>Pipetto 4 mL di ogni soluzione di prova in fiale scintillante 20 mL (3 repliche per concentrazione e 5 repliche per il controllo). Coperchi a vite sulle fiale scintillanti. Ricordate che i coperchi devono avere un foro forato (circa 1 mm di diametro) per consentire lo scambio di CO2.</li>
	<li>Dopo 24 h, 48 h e 72 h, pipetto 0,4 mL da ogni fiala in fiale a vite e aggiungere 1,6 mL di acetone (saturo di MgCO3). Chiudere i coperchi e conservare al buio a temperatura ambiente fino a quando non vengono misurate la fluorescenza (sezione 4).</li>
	<li>Dopo che l'ultimo campione è stato prelevato a 72 h, mettere in comune delicatamente le tre repliche per una data concentrazione in una fiala e misurare il pH. Ripetere l'operazione per tutte le concentrazioni e il controllo. Il pH non deve deviare più di 1,5 unità dal pH iniziale per uno dei campioni misurati.</li>
	<li>Scaricare i liquidi rimanenti in un contenitore di rifiuti seguendo le norme e i regolamenti istituzionali.</li>
</ol>4. Analisi dei campioni di prova delle alghe
<ol><li>Utilizzare uno spettrofotometro a fluorescenza per misurare la biomassa algale (qui espressa come clorofilla A). L'emissione di picco per la clorofilla A è di 420 nm per la lunghezza d'onda di eccitazione e di 671 nm per la lunghezza d'onda delle emissioni.</li>
	<li>Misurare la fluorescenza di ogni singolo campione tre volte e calcolare il valore medio per ogni campione.</li>
	<li>Utilizzare l'equazione 1 per calcolare il tasso di crescita. La fluorescenza misurata (unità relative) può essere utilizzata direttamente come parametro della biomassa nell'equazione 1. Equazione 1: μ (ln Nt – ln N0) / t dove μ è il tasso di crescita (d-1), N0 è la biomassa iniziale, Nt è la biomassa al tempo t e t è la lunghezza del periodo di prova (d). Si noti che N0 e Nt devono essere espressi nella stessa unità.</li>
	<li>Utilizzare un software statistico per adattare una curva di regressione non lineare (ad esempio, una funzione log-logistica o Weibull) ai dati del tasso di crescita per ottenere valori di concentrazione effettivi al 10%, 20% e 50% di inibizione. Nelle informazioni supplementari è fornito un esempio di codice per l'adattamento del software statistico R utilizzando il pacchetto DRC11.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il fitoplancton converte l'energia solare e l'anidride carbonica in materia organica e detiene quindi un ruolo fondamentale nell'ecosistema acquatico. Per questo motivo, i test di inibizione del tasso di crescita delle alghe sono inclusi come uno dei tre test obbligatori di tossicità acquatica necessari per la valutazione del rischio regolamentare delle sostanze chimiche. La capacità di eseguire un test di tossicità algale affidabile e riproducibile è fondamentale a questo proposito. Le configurazioni di prova con flacon...

Il test di tossicità delle alghe è uno dei soli tre test obbligatori utilizzati per generare i dati di ecotossicità necessari per la registrazione pre e post-mercato di sostanze chimiche da parte delle normative europee e internazionali (ad esempio, REACH1 e TSCA (USA)). A tale scopo, le organizzazioni internazionali hanno sviluppato linee guida standardizzate per i test delle alghe (ad esempio, ISO e OCSE). Questi standard di test e linee guida prescrivono condizioni di prova ideali in termini di pH, temperatura, livelli di anidride carbonica e intensità della luce. Tuttavia, mantenere condizioni di prova stabili durante i test delle alghe è in pratica difficile e i risultati soffrono di problemi di riproducibilità e affidabilità per una serie di sostanze chimiche e nanomateriali (spesso indicati come "sostanze difficili")2. La maggior parte delle configurazioni di test di tossicità delle alghe esistenti operano con volumi relativamente grandi (100-250 mL) situati su uno shaker orbitale all'interno di un'incubatrice. Tale impostazione limita il numero di concentrazioni di prova e replica volumi raggiungibili e elevati di coltura algale e materiale di prova. Inoltre, queste configurazioni raramente hanno un campo di luce uniforme e condizioni di illuminazione affidabili sono inoltre difficili da ottenere in grandi flaconi, in parte come l'intensità della luce diminuisce esponenzialmente più la luce viaggia e in parte a causa della geometria del fiasche. Le configurazioni alternative comprendono microtiter di plastica3 piastre contenenti piccoli volumi di campioni che non consentono volumi di campionamento adeguati per misurare il pH, misurazioni aggiuntive della biomassa, estrazione di pigmenti o altre analisi che richiedono un campionamento distruttivo. Una sfida particolare utilizzando le configurazioni esistenti per il test di tossicità algale di nanomateriali e sostanze che formano sospensioni colorate è l'interferenza o il blocco della luce disponibile per le cellule algali, spesso indicato come "ombreggiatura"4,5. L'ombreggiatura può verificarsi all'interno delle fiale dal materiale di prova e/o dalle interazioni tra il materiale di prova e le cellule algali, o l'ombreggiatura può verificarsi tra le fiale, a causa del loro posizionamento rispetto all'altro e della fonte di luce.
Il metodo si basa sull'impostazione del test di tossicità delle alghe su piccola scala introdotto da Arensberg et al.6 che consente di testare in conformità con standard quali OCSE 2017e ISO 86928. Il metodo è ulteriormente ottimizzato per affrontare le limitazioni sopra indicate da: 1) utilizzando la tecnologia della luce a LED per garantire condizioni di luce uniformi con una generazione minima di calore, 2) fornendo un volume campione adeguato per l'analisi chimico-biologica mantenendo costante il pH, i livelli di CO2 e 3) consentendo l'uso di materiale contenitore di prova versatile per la sperimentazione di sostanze volatili o sostanze con un elevato potenziale di assorbimento.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V179124</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254134</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi BlueCap (1L)</td><td>Buch & Holm A/S</td><td>&nbsp; </td><td></td>9072335</tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0394</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208290</td><td></td></tr><tr><td>Lastra acrilica trasparente (40x40 cm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di cobalto(II) esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255599</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di rame(II) diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>307483</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico sale disodico diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td> E5134</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro a fluorescenza F-7000</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ferro (III) esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa a LED</td><td>Helmholt Elektronik A/S</td><td>H35161</td><td>Bianco neutro, 6500K</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di manganese (II) tetraidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>IKA</td><td>2980200</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Raphidocelis subcapitata</td><td>NORCCA</td><td></td><td>NIVA-CHL1 ceppo</td></tr><tr><td>Fiale di scintillazione (20 mL)</td><td>Fisherscientific</td><td>11526325</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato di sodio diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331058&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Morsetto a molla</td><td>Frederiksen Scientific A/S</td><td>472002</td><td></td></tr><tr><td>Armadio termostatico</td><td>VWR</td><td>WTWA208450</td><td>Alternativa: ambiente a temperatura controllata</td></tr><tr><td>Tubo di ventilazione (&Oslash; 125 mm)</td><td></td><td></td>Palloni tarati Silvan 22605630165 <td></td></tr><tr><td>(25 mL)</td><td>DWK Life Sciences</td><td>246781455</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di zinco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr></tbody></table>

un'installazione su piccola scala per il test della tossicità delle alghe di nanomateriali e altre sostanze difficili

A Small-Scale Setup for Algal Toxicity Testing of Nanomaterials and Other Difficult Substances

I dati sull'ecotossicità sono un requisito per la registrazione pre e post-mercato delle sostanze chimiche da parte delle normative europee e internazionali (ad esempio, REACH). Il test di tossicità delle alghe è spesso utilizzato nella valutazione del rischio normativo delle sostanze chimiche. Al fine di ottenere un'elevata affidabilità e riproducibilità, lo sviluppo di linee guida standardizzate è di vitale importanza. Per i test di tossicità delle alghe, le linee guida richiedono condizioni stabili e uniformi di parametri come pH, temperatura, livelli di anidride carbonica e intensità della luce. I nanomateriali e altre cosiddette sostanze difficili possono interferire con la luce causando una grande variazione nei risultati ottenuti ostacolando la loro accettazione normativa. Per affrontare queste sfide, abbiamo sviluppato LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). L'installazione utilizza l'illuminazione a LED dal basso, consentendo una distribuzione omogenea della luce e il controllo della temperatura, riducendo al minimo l'ombreggiatura intra-campione. L'installazione ottimizza il volume del campione per la quantificazione della biomassa e allo stesso tempo garantisce un afflusso sufficiente di CO2 per supportare la crescita esponenziale delle alghe. Inoltre, il materiale dei contenitori di prova può essere adattato per ridurre al minimo l'assorbimento e la volatilizzazione. Durante la sperimentazione di sostanze colorate o sospensioni di particelle, l'uso di luci a LED consente anche di aumentare l'intensità della luce senza ulteriore generazione di calore. Il design compatto e i requisiti minimi di equipaggiamento aumentano le possibilità di implementazione del LEVITATT in una vasta gamma di laboratori. Pur essendo conforme alle linee guida standardizzate ISO e OCSE per i test di tossicità delle alghe, LEVITATT ha anche mostrato una minore variabilità tra campioni per due sostanze di riferimento (3,5-Dicholorophenol e K2Cr2O7) e tre nanomateriali (nO, CeO2e BaSO4) rispetto ai flaconi di Erlenmeyer e alle piastre microtitero.

Viene effettuata una prova iniziale con una sostanza di riferimento per determinare la sensibilità del ceppo algale. Le sostanze di riferimento regolarmente utilizzate per R. subcapitata sono dicromate di potassio e 3,5-Dichlorphenol7,8. La figura 3 e la tabella 2 mostrano un risultato rappresentativo di una prova algale che include il raccordo a curva e i risultati statistici quando il pacchetto RDC in R vi...

Dimostriamo test di tossicità delle alghe per sostanze difficili (ad esempio, sostanze colorate o nanomateriali) utilizzando un setup illuminato verticalmente con un LED.

Un'installazione su piccola scala per il test della tossicità delle alghe di nanomateriali e altre sostanze difficili

Ecotoxicity data is a requirement for pre- and post-market registration of chemicals by European and international regulations (e.g., REACH). The algal ...

Quando un'azienda chimica vuole mettere sul mercato una nuova sostanza chimica o un altro materiale, deve fornire i dati di una serie di test di ecotossicità. Il test algale è uno dei tre test obbligatori che devono essere eseguiti. Il test delle alghe soffre del fatto che è piuttosto impegnativo da eseguire.Per questo motivo, abbiamo sviluppato la piattaforma di test LEVITATT. LeVITATT utilizza la luce a LED per evitare problemi con un'eccessiva generazione di calore. Inoltre, garantisce un campo luminoso uniforme.Ha una dimensione compatta, il che significa che non hai bisogno di molto spazio per eseguire il test delle alghe, ma allo stesso tempo, consente di utilizzare abbastanza volume del campione per eseguire analisi chimiche e caratterizzazione prima, durante e dopo il test. Questo è particolarmente importante quando si testano i nanomateriali. Questo video dimostrerà l'uso di LEVITATT per test di tossicità delle alghe di nanomateriali e altre sostanze difficili.La dimostrazione consiste nei quattro passaggi seguenti. In primo luogo, descrivere i componenti del LEVITATT. Il secondo passo è preparare la soluzione per i mezzi di crescita delle alghe.E il terzo passo è dare una panoramica della procedura su come eseguire un test di tossicità delle alghe. Il passo finale è misurare l'aumento della biomassa algale con il fluorometro. Il LEVITATT può essere collocato nell'armadio della stanza a temperatura controllata.Ciò consente una temperatura stabile durante l'esposizione. La configurazione viene posizionata su uno shaker orbitale per consentire la rotazione dei campioni durante la prova. Il test viene condotto in flaconcini a scintillazione da 20 millilitri contenenti quattro millilitri di esposizione.Un tappo a vite con foro forato consente lo scambio di CO2 con aria durante l'esposizione. La sorgente LED è inserita tra due fogli di plastica e situata al centro di ogni involucro. Il posizionamento crea un campo luminoso omogeneo e riduce al minimo l'ombreggiatura tra i campioni.Ogni involucro è montato con morsetti e può contenere fino a cinque campioni. La dimensione compatta riduce al minimo lo spazio necessario per eseguire l'esperimento. Per preparare le soluzioni stock, pesare la quantità appropriata di ogni composto.La soluzione stock è costituita da vari sali vitali per la crescita delle alghe. Quando la quantità appropriata di sali è stata pesata, vengono diluiti con acqua ultra pura. Le soluzioni stock vengono sterilizzate mediante filtrazione o autoclave.Dopo la sterilizzazione, le soluzioni stock possono essere conservate al buio a quattro gradi Celsius. Preparare una serie di concentrazioni di esposizione. Il fattore tra le concentrazioni di esposizione non deve superare 3,2.Il volume appropriato di alghe in crescita esponenziale viene aggiunto a ogni concentrazione di prova. La densità cellulare finale dovrebbe essere di circa 10.000 cellule algali per millilitro. È fondamentale che la precoltura sia in crescita esponenziale per soddisfare i criteri di validità del test.Le fiale di misura sono mescolate per consentire una distribuzione omogenea di alghe e composti prima del campionamento. I campioni vengono versati nei becher e quattro millilitri vengono pipettati in flaconcini a scintillazione da 20 millilitri. Le fiale scintillanti sono ora limitati.Pipetta 0,4 millilitro per ogni concentrazione. Aggiungere 1,6 millilitro acetone per interrompere la parete cellulare e rilasciare la clorofilla nella fase liquida. Ogni flaconcino di vetro è ora strettamente vicino per evitare l'evaporazione dell'acetone durante lo stoccaggio.Le fiale a scintillazione limitata sono ora distribuite casualmente nel LEVITATT e incubate per 72 ore. Misurare l'intensità della luce e la temperatura all'inizio e alla fine dell'incubazione per garantire il rispetto delle linee guida desiderate. Il sotto-campionamento viene effettuato a intervalli di 24 ore pipettando 0,4 millilitri da ogni flaconcini di scintillazione in flaconcini di vetro.Aggiungere 1,6 milioni di acetone per interrompere la parete cellulare e rilasciare la clorofilla nella fase liquida. Dopo l'aggiunta di acetone, avvitare saldamente i coperchi e lasciare i campioni al buio fino all'analisi. Utilizzare un fluorometro per quantificare la biomassa nel campione acquisito durante il periodo di prova.Le impostazioni sul fluorometro dovrebbero essere di 420 nanometri come lunghezza d'onda di eccitazione e una lunghezza d'onda di emissione di 671 nanometri. Ogni singolo campione viene misurato tre volte e vengono annotate i valori relativi. I valori relativi del fluorometro vengono utilizzati per calcolare il tasso di crescita che verrà utilizzato per un ulteriore trattamento dei dati.Utilizzare un software statistico per adattare una curva di regressione non lineare ai dati calcolati sul tasso di crescita. Un esempio di curva di regressione non lineare potrebbe essere un log-logistico di funzione praticabile. L'intervallo di confidenza associato al 95% viene visualizzato insieme all'adattamento del modello.Per segnalare il risultato di un test di ecotossicità vengono utilizzati valori di concentrazione regolarmente efficaci come 10, 20 e 50% inefficienti. In conclusione, leVITATT fornisce una piattaforma compatta per i test di tossicità delle alghe di sostanze chimiche regolari conformi alle linee guida standardizzate internazionali. Inoltre, la configurazione fornisce una solida piattaforma per il test di sostanze difficili che interferiscono con il passaggio della luce verso l'alghe, come nanomateriali o sostanze colorate.

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Questo studio riguarda lo sviluppo e la standardizzazione di un protocollo valido strumento metodologico per determinare a lungo termine (14 giorni) tossicità letale esercitata da sostanze chimiche, delle acque reflue industriali o acque di scarico e liquidi campioni ambientali sul crostaceo d'acqua...

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