Valutazione dell'ossidazione cellulare utilizzando una proteina fluorescente verde sensibile al comparto subcellulare
18 giugno 2020
Questo protocollo descrive la valutazione dello stato di redox subcellulare specifico del compartimento all'interno della cella. Una sonda fluorescente redox-sensibile consente una comoda analisi ratiometrica nelle cellule intatte.
Gli attuali valutatori del protocollo nel tessile, lo stato redox cambia in modo specifico del compartimento intracellulare. Il nostro protocollo consente una migliore comprensione e monitoraggio di tutti i meccanismi fisiologici o fisiopatologici dello stress ossidativo. Questa tecnica consente la quantificazione senza interruzioni del rapporto di solfuro oculare piastrellato nelle cellule intatte utilizzando un'uscita metrica di rapporto per controbilanciare le differenze tra i livelli di espressione del segnale, lo sbiancamento delle foto e le sensibilità di rilevamento.
Questo protocollo può essere applicato a vari organismi, compresi i batteri nelle piante. Il primo giorno dell'esperimento trattare le cellule da una linea confluente di cellule tumorali del seno per due minuti, con due millilitri di 0,2, 5% viaggi in EDTA. Quando le cellule iniziano a staccarsi arrestano la reazione con sei millilitri di mezzo completo e sedimentano le cellule per centrifugazione.
Sospendere il pellet in cinque millilitri di mezzo fresco e completo, contare le cellule e diluirle a 1,5 volte 10 alla quinta parte per un millilitro di mezzo completo. Quindi seminare 1,5 per 10 alla quinta cella per millilitro di cellule per pozzo in una piastra di 6 pozzetti e incubare le cellule nell'incubatrice di coltura cellulare durante la notte. Oppure non aggiungere alcuna trasduzione della GFP a riga virale.
La mattina seguente, aggiungere 12,5, 25 e 50 microlitri di uno a 100 diluiti sei volte 10 alla 10a unità di formatura della placca per millilitro di aggiungere nessuna soluzione di GFP di erode virale, in mezzo completo. Aggiungilo ai pozzi appropriati o alla piastra di 6 pozzetti per trasdurre le cellule rispettivamente con 50, 100 e 200 molteplicità di infezione. Quando tutti i pozzi campione sono stati trasdotti con virus, riportare le cellule nell'incubatrice di coltura cellulare per 16-24 ore.
Il giorno successivo, visualizzare le cellule con la microscopia a fluorescenza e sostituire il supernatante con mezzo, senza virus per consentire alle cellule di recuperare per altre 24 ore. Per determinare l'efficienza ottimale di trasduzione, valutare l'intensità della fluorescenza e la morfologia delle cellule per citometria del flusso. Assicurati di condurre tutte le procedure che possono causare infezioni da aerosol o schizzi all'interno di un armadietto di sicurezza biologica certificato di livello due di biosicurezza.
Per valutare lo stato redox delle cellule, la mattina successiva, incubare le cellule e i pozzi appropriati della piastra del pozzo 6 con 10 perossido di idrogeno micromolare per un'ora, prima di staccare le cellule con 750 microlitri dello 0,2 5% di gocciolamenti in EDTA per bene, come dimostrato. Interrompere la reazione con due millilitri di mezzo completo per pozzo e tirare i supernatanti per ogni condizione in singoli tubi conici da 15 millilitri. Sedimentare le cellule mediante centrifugazione e lavare i pellet in 500 microlitri di PBS per pozzo mediante centrifugazioni due volte.
Dopo il secondo lavaggio, filtrare le sospensioni cellulari attraverso maglie da 40 micrometri in tubi compatibili con la citometria a flusso sul ghiaccio, protetti dalla luce. Nel software citometrico Flow, eseguire la molteplicità zero del campione di controllo delle infezioni. Quindi analizzare il perossido di idrogeno e le cellule non trattate.
Consentirà il calcolo del rapporto di intensità fluorescente media tra le forme ossidate rispetto alle forme ridotte di GFP di riga, utilizzando la formula come indicato. Ecco la strategia di gating per selezionare un gran numero di cellule per citometria del flusso. La citometria del flusso può anche essere utilizzata per determinare la curva di risposta alla dose per l'analisi della GFP a riga e la molteplicità più efficiente dell'input di infezione.
Secondo la molteplicità dell'infezione, la curva di risposta alla dose in questa analisi rappresentativa, una molteplicità di infezione 200 ha dato la più alta espressione di GFP stradale, ma la morfologia cellulare è stata effettuata suggerendo citotossicità. Pertanto, l'efficienza ottimale di trasduzione è stata determinata come una molteplicità di infezione di 100. In questa analisi dello stato redox, le intensità di fluorescenza media GFP a riga ossidata e ridotta sono state ottenute dall'analisi della citometria del flusso per il veicolo e da quattro trattamenti perossidi di idrogeno a controllo positivo micromolare da 10 micromolare.
Gli istogrammi sovrapposti rappresentano gli spostamenti del numero di cellule nel perossido di idrogeno micromolare 10 e nei gruppi trattati con veicoli o nella GFP erosa ridotta e ossidata. Il calcolo del rapporto tra la GFP a fila ossidata e ridotta per questa analisi ha rivelato che il perossido di idrogeno micromolare 10 ha causato un triplice aumento dell'ossidazione della FPG a file rispetto al trattamento del veicolo. Avere numeri di cella accurati è importante per i calcoli mri e la riproducibilità.
Al fine di ottenere risultati riproducibili, i ricercatori dovrebbero mescolare accuratamente le soluzioni antivirali per ottenere sospensioni omogenee. Questo protocollo consente ai ricercatori di studiare rapidi cambiamenti redox come parte integrante dell'ampia gamma di normali processi cellulari e della progressione della malattia in tempo reale.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per valutare lo stato redox specifico dei compartimenti subcellulari nelle cellule utilizzando una sonda fluorescente sensibile al redox. Questa tecnica permette una quantificazione non distruttiva dello stato redox in cellule intatte.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Biologia cellulare
- Biologia redox
- Stress ossidativo
Sfondo
- Comprendere gli stati redox è cruciale per studiare lo stress ossidativo.
- Le sonde sensibili al redox forniscono informazioni sui meccanismi cellulari.
- I cambiamenti nello stato redox possono indicare condizioni fisiologiche o patofisiologiche.
- Questo metodo può essere applicato a vari organismi.
Obiettivo dello studio
- Permettere il monitoraggio dello stress ossidativo nelle cellule.
- Fornire un metodo non distruttivo per quantificare gli stati redox.
- Migliorare la comprensione delle risposte cellulari alle condizioni ossidative.
Metodi utilizzati
- Utilizzo di una sonda fluorescente sensibile al redox.
- Analisi ratiometrica per bilanciare le differenze di segnale.
- Applicazione del protocollo a vari tipi di cellule, incluse le cellule tumorali.
- Trattamento cellulare e centrifugazione per la preparazione del campione.
Risultati principali
- Quantificazione riuscita degli stati redox in cellule intatte.
- Applicabilità dimostrata su diversi tipi di cellule.
- Fornito informazioni sui meccanismi fisiologici dello stress ossidativo.
- Consentito il monitoraggio dei cambiamenti redox in tempo reale.
Conclusioni
- Questo protocollo è efficace per valutare lo stato redox nelle cellule.
- Offre uno strumento prezioso per studiare i meccanismi dello stress ossidativo.
- Il metodo può essere adattato per varie applicazioni di ricerca.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Assessing subcellular redox dynamics enables mechanistic de-risking in target validation by linking oxidative stress pathways to disease phenotypes. This method supports predictive confidence in preclinical models through quantitative, ratiometric readouts of cellular oxidation states. It provides translational continuity from discovery to lead identification by monitoring redox changes in living systems without disrupting cellular physiology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying redox shifts in response to oxidative stressors like H2O2.
- Operational Value: Enables functional target validation via subcellular compartment-specific resolution of roGFP signal.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by establishing dose-response relationships between oxidant exposure and GFP oxidation ratios.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline redox states in MDA-MB-231 cells.
- Operational Value: Delivers assay standardization through ratiometric measurement that corrects for expression variability and photobleaching.
- Scalability: Supports platform reuse across cell types and organisms as demonstrated in breast cancer and bacterial models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Biomarker Alignment: Connects redox measurements to disease-relevant systems using triple-negative breast cancer as a pathophysiological model.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by monitoring real-time redox changes during disease progression.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking by linking oxidative stress mechanisms to functional cellular outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work by providing redox status as a quantifiable biomarker.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring oxidation/reduction ratios in live cells.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility through flow cytometry-compatible sample preparation and gating strategies.
- Analytics: Delivers quantitative readouts via mean fluorescent intensity ratios of oxidized versus reduced roGFP forms.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling real-time monitoring of redox changes in disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for oxidative stress assessment across multiple projects and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in oxidative stress mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of redox measurements across experimental conditions.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early pathway de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative redox response thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, flow cytometry, and adenoviral transduction techniques.
- Needs instrumentation for dual-excitation fluorescence detection (405 nm and 488 nm) and emission at 525 nm.
- Demands cross-team standardization of transduction protocols, H2O2 treatment timing, and ratio calculation methods.
- Involves adaptation considerations for different subcellular targeting of roGFP constructs beyond cytosolic expression.
- Includes practical limitations such as cytotoxicity at high multiplicity of infection, requiring optimization for each cell type.
