Name: Isolamento dei nuclei di tessuti adiposi per applicazioni genomiche a singola cellula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Scopri un protocollo per isolare nuclei da adipociti maturi con sorting a fluorescenza per analisi transcriptomiche a singola cellula. Questo metodo riduce aggregati e detriti cellulari, facilitando studi sull'eterogeneità del tessuto adiposo.

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Ringraziamo David Reynolds, del nucleo di Albert Einstein Genomics, e Jinghang shang dal Flow Cytometry Core per il supporto tecnico. Riconosciamo il sostegno dei National Institutes of Health (NIH) (DK110426) e dei Pilot and Feasibility Grants dell'Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) e del New York Obesity Research Center (DK026687) (tutti a K.S.). Vorremmo anche ringraziare Albert Einstein Cancer Center (CA013330) per il supporto di base.

La cura e la sperimentazione degli animali sono state eseguite secondo procedure approvate dal Comitato istituzionale per la cura degli animali e l'uso presso l'Albert Einstein College of Medicine.
1. Preparazione di digestione tissutale e buffer di lisi
<ol><li>Preparare il buffer di digestione dei tessuti.<ol>
<li>Preparare 1 mL di tampone di digestione per ogni grammo di tessuto adiposo.</li>
		<li>Pesare 1.5 U/mL collagenae D e 2.4 U/mL dispase II e aggiungere fosfato buffersa salina (PBS).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare il buffer di preparazione dei nuclei (NPB).<ol>
<li>Preparare 10 m HEPES, 1,5 mm di cloruro di magnesio, 10 mM di cloruro di potassio, 250 mM di saccarosio e 0,1% NP-40 in acqua priva di nuclea. Mescolare bene. Il saccarosio può richiedere più tempo per sciogliersi rispetto agli altri componenti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare la soluzione 9A (Bovine Serum albumin) dello 0,5%.<ol>
<li>Preparare 0,5% DI BSA in PBS contenente EDTA. Si consiglia di utilizzare PBS di grado di coltura cellulare filtrato sterile (vedere Tabella dei materiali).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Digestione enzimatica del tessuto adiposo
<ol><li>I topi dissetati per estrarre il tessuto adiposo secondo Aune et al.13. Raccogliere il tessuto isolato in un piatto contenente PBS. Trasferire il tessuto in un tovagliolo di carta per asciugare. Quindi mettere il tessuto in un piatto pulito.</li>
	<li>Aggiungere il cloruro di calcio al tampone di digestione ad una concentrazione finale di 10 mM. Aggiungere un piccolo volume di tampone di digestione al piatto e tritare accuratamente il tessuto adiposo. Il volume del buffer di digestione richiesto sarà basato sulla quantità di tessuto isolato. Di solito viene utilizzato 1 mL o meno.</li>
	<li>Aggiungere circa la metà della quantità di buffer di digestione preparato (ad es. 10 mL per cinque topi) al tessuto macinato. Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire il campione in un tubo di centrifuga conica da 50 mL. Aggiungere la quantità residua di tampone per lavare il piatto e trasferirlo al tubo da 50 mL contenente il campione. Pipette su e giù più volte. Poi incubare con agitazione a 200-210 rpm a 37 gradi centigradi per 12-15 min.</li>
</ol>3. Isolamento degli Adipociti
<ol><li>Dopo l'incubazione, aggiungere 0,5% BSA a un rapporto 1:1 al campione. Mescolare bene pipetting su e giù più volte. Centrifugare il campione a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT) per ruotare verso il basso la frazione vascolare stroposta (SVF). La frazione adipocite rimarrà nello strato superiore del campione.</li>
	<li>Posizionare un filtro cellulare di 40 m sopra un tubo di centrifuga conica da 50 mL e filtrare il campione, raccogliendo lo strato superiore e lasciando dietro di sé l'SVF nella parte inferiore del tubo. Trasferire lo strato superiore (frazione adipocite) in un nuovo tubo capovolgendo il filtro sopra il tubo e utilizzando 0,5% BSA per invertire il filtro e raccogliere il campione nel tubo.</li>
	<li>Portare il volume totale dello 0,5% di BSA a 10-15 mL in base alle dimensioni del campione e alla pipetta su e giù con una pipetta sierologica o scuotere brevemente su e giù per mescolare il campione. Centrifugare nuovamente il campione a 300 x g per 5 min a RT.</li>
</ol>4. Isolamento dei nuclei
<ol><li>Utilizzare una punta di pipetta a foro largo e trasferire con attenzione lo strato superiore del campione su un filtro cellulare di 100 m posto sopra un nuovo tubo prechilled sul ghiaccio, lasciando dietro di sé qualsiasi SVF residua.</li>
	<li>Risciacquare/lavare il filtro con una quantità sufficiente di NPB e scartare il filtro. Da questo passo in avanti hanno il campione sul ghiaccio il più spesso possibile e lavorare rapidamente per evitare perdite e/o nuclei malsani. È utile prechill microcentrifuga tubi da utilizzare in passi futuri sul ghiaccio.</li>
	<li>Mettere il campione sul ghiaccio per non più di 2 min con l'inversione delicata intermittente del tubo da mescolare. Il tempo di incubazione sul ghiaccio deve essere ottimizzato per le dimensioni del campione e il tipo di adipociti. Centrifuga a 1.000 x g a 4 gradi centigradi per 10 min.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di NPB. Trasferire il campione in un tubo di microcentrismo pulito. Durante il trasferimento, evitare di toccare le pareti del tubo, che contengono detriti e lipidi. Aggiungete al campione l'inibitore di 0,6 U/L RNase e mescolate. Centrifuga di nuovo a 1.000 x g a 4 gradi centigradi per 10 min. NOTA: la velocità e il tempo di centrifugazione devono essere ridotti in questa fase per i campioni più piccoli.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere in 1 mL di Nuclei Wash Buffer (2% BSA/PBS - 0,6 U/ Sl RNase inibitore).</li>
	<li>Filtrare due volte in un tubo pulito con filtri impilabili da 30 m. Lavare il filtro con un piccolo volume di Nuclei Wash Buffer. In alternativa, per i campioni più piccoli, utilizzare un filtro di 30 m che si inserisce in un tubo di microcentrifuga e filtrare direttamente in esso.</li>
	<li>Confermare il successo dell'isolamento dei nuclei sani.<ol>
<li>Macchia redigere una piccola aliquota del campione con trypan e usa un contatore cellulare automatizzato per valutare la dimensione media dei morti e la percentuale di cellule morte. La dimensione media dei morti per un campione che contiene per lo più nuclei deve variare tra 7-10 m. La dimensione dei nuclei è di solito di circa 8 m.</li>
		<li>Macchiare una piccola aliquota del campione con DAPI ed esaminare al microscopio con un obiettivo 20x o superiore. La membrana nucleare deve essere intatta e i nuclei devono essere rotondi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Pulizia FACS e fase di concentrazione dei nuclei
<ol><li>Procedere immediatamente al passo FACS per pulire i nuclei e rimuovere eventuali detriti in eccesso. Il buffer di raccolta deve contenere Nuclei Wash Buffer. Durante FACS il buffer viene diluito. Preparazione di una maggiore concentrazione di BSA e RNase inibitore per tenere conto della diluizione durante lo smistamento è utile. Il blocco di raccolta FACS deve essere in modalità di raffreddamento.</li>
	<li>Dopo lo smistamento dei nuclei, centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 gradi centigradi per concentrare il campione. Ricostituire in un volume appropriato di Nuclei Wash Buffer per ottenere una concentrazione di 500-1.500 nuclei/ . Non tentare di rimuovere tutti i supernatali. In questo modo si tradurrà in perdita di nuclei.</li>
	<li>Utilizzare un emocitometro e un'aliquota macchiata DAPI per un conteggio finale e per visualizzare i nuclei. Quindi procedere immediatamente con snRNA-seq secondo il protocollo del produttore.</li>
</ol>

<ol><li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).</li>
<li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).</li>
<li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).</li>
<li>Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+evidence+for+active+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+metabolically+active+brown+adipose+tissue+in+healthy+adult+humans%3A+effects+of+cold+exposure+and+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity.</a> Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).</li>
<li>Yoneshiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruited+brown+adipose+tissue+as+an+antiobesity+agent+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+brown+adipose+tissue+by+a+%CE%B23-adrenergic+receptor+agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).</li>
<li>Song, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-+and+high-thermogenic+brown+adipocyte+subpopulations+coexist+in+murine+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).</li>
<li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CL316%2C243+and+cold+stress+induce+heterogeneous+expression+of+UCP1+mRNA+and+protein+in+rodent+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+stress+induces+glycolytic+beige+fat+formation+via+a+myogenic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state.</a> Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PloS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Transcriptional+and+Epigenomic+Profiling+from+Specific+Cell+Types+within+Heterogeneous+Tissues+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige%2Fbrite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nature Communications. 8, 14049(2017).</li>
<li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).</li>
<li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+full-length+total+RNA+sequencing+uncovers+dynamics+of+recursive+splicing+and+enhancer+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs.</a> Nature Communications. 9 (1), 619(2018).</li>
<li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+chromatin+landscapes+of+human+immune+cell+development+and+intratumoral+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion.</a> Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li>
<li>Peterson, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+quantification+of+proteins+and+transcripts+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells.</a> Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Viene presentato un metodo semplice e robusto per isolare i singoli nuclei e studiare l'eterogeneità del tessuto adiposo. Rispetto al sequenziamento dell'RNA di tessuto intero, questo flusso di lavoro offre una visione imparziale dell'eterogeneità cellulare e dei marcatori specifici della popolazione. Questo è significativo e innovativo per il progresso della biologia adipocite, metabolismo molecolare, e la ricerca sull'obesità.
Questo protocollo è particolarmente ottimizzato per l'applicazion...

Gli studi hanno dimostrato che il tessuto adiposo marrone (BAT) ha una notevole capacità di dissipare energia. Esistono due tipi di adipociti termogenici con caratteristiche dello sviluppo distinte che esistono sia nei roditori che negli esseri umani: adipociti beige e adipociti bruni classici. Mentre gli adipociti bruni classici si trovano per lo più in depositi BAT interscapitolare, gli adipociti beige emergono sporadicamente nel tessuto adiposo bianco (WAT) in risposta ad alcuni segnali fisiologici, come l'esposizione cronica al freddo, un processo chiamato "marrone" o "sbiancamento". Attraverso l'uso di immagini avanzate, è ormai chiaro che gli esseri umani adulti hanno depositi sostanziali di UCP1- BAT, soprattutto nella regione supraclavicolare1,2,3.4 La quantità di BAT umano adulto è inversamente correlata all'adiposità e può essere aumentata da segnali esterni, come l'esposizione cronica al freddo5,6 o z3-adrenergic recettore agonista7. Il dispendio energetico mediato da BAT può offrire un approccio praticabile per combattere l'obesità.
Fino a poco tempo fa, gli adipociti termogenici sono stati considerati una popolazione omogenea. Tuttavia, studi hanno rivelato l'esistenza di più sottotipi o sottopopolazioni distinti nell'origine dello sviluppo, nell'uso del substrato e nel trascrittoma8,9,10. Per esempio, un tipo di adipocito beige che utilizza preferibilmente glucosio per la termogenesi, l'adipocito g-beige, è stato recentemente descritto10. La comprensione incompleta dei tipi di cellule nel tessuto adiposo marrone e beige e la mancanza di marcatori specifici costituiscono una barriera critica allo studio delle loro funzioni biologiche.
I metodi tradizionali per isolare le sottopopolazioni di cellule si basano sull'espressione di pochi geni marcatori noti. I recenti progressi nella genomica a singola cellula consentono l'uso di dati di espressione genica globale di singole cellule per fornire una stima imparziale del numero di sottopopolazioni in un tessuto. L'obiettivo finale di questo protocollo è quello di determinare tutti i sottotipi di tessuto adiposo sotto vari stimoli termogenici ad una risoluzione a cella singola. A differenza di altri tessuti e tipi di cellule, determinare i sottotipi cellulari del tessuto adiposo è difficile a causa della fragilità degli adipociti pieni di lipidi. Questo documento introduce un protocollo robusto per isolare singoli nuclei dal tessuto adiposo per l'applicazione a valle al sequenziamento dello snRNA. È importante sottolineare che la letteratura recente che confronta i set di dati di sequenziamento dell'RNA a nuclei singoli (snRNA-seq) e di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) ha rivelato che il snRNA-seq è paragonabile allo scRNA-seq nel rilevamento del tipo di cellula e superiore nella copertura cellulare per un tessuto complesso come il cervello11. Questo protocollo combina un metodo di centrifugazione a gradiente di densità ottimizzato per i tessuti adiposi di Rosen et al.12 con un passo di "pulizia" nuclei con un MoFlo XDP High Speed Sorter. Come si è visto nei risultati rappresentativi, un'analisi di 7.500 nuclei singoli del tessuto adiposo bruno intersbattiare del topo ha identificato più tipi di cellule all'interno di adipociti bruni apparentemente omogenei. Nel complesso, questo protocollo semplice e robusto può essere applicato per studiare l'organizzazione a livello tissutale di adipociti e cellule residenti adiposi, l'identificazione di geni marcatori specifici del sottotipo e la fenotipizzazione dello sviluppo di topi adipose-selettivi/transgenici.

<table><tbody><tr><td>autoMACS Soluzione di risciacquo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>PBS con EDTA; filtrato sterile</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare 100 &mu; m</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare 40&mu; m</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics (30 &mu; m)</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Contatore di celle automatizzato</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Filtri intelligenti MACS (30 &; micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td>Filtri impilabili</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>MoFloXDP Cell Sorter</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Protettore Inibitore della RNasi</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher</td><td>S5-3</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento dei nuclei di tessuti adiposi per applicazioni genomiche a singola cellula

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

I grassi marroni e beige sono tessuti adipose specializzati che dissipano l'energia per la termogenesi da vie indipendenti e dipendenti da UCP1 (Uncoupling Protein-1). Fino a poco tempo fa, gli adipociti termogenici erano considerati una popolazione omogenea. Tuttavia, studi recenti hanno indicato che ci sono più sottotipi o sottopopolazioni che sono distinti nell'origine dello sviluppo, nell'uso di substrati e nel trascrittoma. Nonostante i progressi nella genomica a singola cellula, la decomposizione imparziale dei tessuti adiposi in sottotipi cellulari è stata difficile a causa della natura fragile degli adipociti pieni di lipidi. Il protocollo presentato è stato sviluppato per aggirare questi ostacoli isolando efficacemente i singoli nuclei dal tessuto adiposo per applicazioni a valle, incluso il sequenziamento dell'RNA. L'eterogeneità cellulare può quindi essere analizzata mediante sequenziamento dell'RNA e analisi bioinformatiche.

I nuclei di adipociti non ordinati contengono detriti e doppietti che creano rumore e un elevato background nel sequenziamento a valle dell'RNA a cellule singole. La strategia rappresentativa del gate FACS è illustrata nella Figura 1. I nuclei sono stati selezionati per la prima volta in base alla dispersione in avanti (FSC) e alla dispersione laterale (SSC)(A),quindi sono stati selezionati solo i singlet in base alla combinazione di larghezz...

Questa pubblicazione descrive un protocollo per l'isolamento dei nuclei dagli adipociti maturi, la purificazione mediante lo smistamento attivato dalla fluorescenza e la trascrittomica a livello di cellula.

Isolamento dei nuclei di tessuti adiposi per applicazioni genomiche a singola cellula

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

La decomposizione del tessuto adiposo in sottotipi è stata impegnativa perché la natura fragile dell'adipocite. Questo protocollo è stato sviluppato per superare questo problema con un efficace isolamento di singoli nuclei. Questo flusso di lavoro fornisce nuclei singoli altamente purificati con aggregati nucleari e detriti cellulari ridotti al minimo.Questo è vantaggioso per la profilazione del trascritoma a cella singola di migliaia di cellule. Questo protocollo semplice e robusto può essere applicato per studiare l'organizzazione a livello tissutale dell'adipocite nelle loro cellule residenti adipose. E in particolare, allo sviluppo fenotipizzazione, knockout adiposo e topi transgenici.La dimostrazione visiva di questo protocollo è fondamentale in modo che le persone che non hanno molta esperienza nella gestione dell'adipocite possano replicarsi e comprendere l'eterogeneità degli adiposi. Dopo aver raccolto il tessuto adiposo dai topi, asciugarlo con un tovagliolo di carta e posizionare in un piatto pulito. Aggiungere cloruro di calcio al tampone di digestione a una concentrazione finale di 10 mM.Quindi, aggiungere un piccolo volume al tessuto e tritarlo accuratamente. Aggiungere circa la metà della quantità di tampone di digestione preparato al tessuto tritato. E utilizzare una pipetta sierologica per trasferire il campione in un tubo di centrifuga da 50 ml.Lavare il piatto con il tampone rimanente e aggiungerlo al tubo da 50 ml. Pipettare il campione su e giù più volte. Quindi, incubarlo per 12-15 minuti a 37 gradi Celsius mentre trema a 200-210 giri/min.Dopo l'incubazione, aggiungere lo 0,5%BSA al campione con un rapporto volume 1 a 1 e mescolare bene con la pipettazione. Centrifugare il campione a 300 xg per cinque minuti a temperatura ambiente per far girare verso il basso la frazione stromovascolare lasciando la frazione adipocite in cima. Filtrare la frazione superiore attraverso un filtro cellulare da 400 m in un tubo da 50 ml.Quindi capovolgere il filtro sul tubo e trasferire gli adipociti su un nuovo tubo utilizzando lo 0,5%BSA per lavare in retromarcia il filtro. Portare il volume totale della BSA a 10-15 mL e pipettare il campione su e giù con pipetta sierologica. Quindi, centrifugarlo di nuovo a 300 xg per cinque minuti a temperatura ambiente.Dopo la centrifugazione, utilizzare una punta di pipetta ad ampio foro per trasferire con cura lo strato superiore del campione in un filtro cellulare da 100 m sopra un nuovo tubo pre-refrigerato su ghiaccio. Risciacquare il filtro con una quantità sufficiente di tampone di preparazione dei nuclei, quindi scartarlo. Da questo passo avanti, tieni un campione sul ghiaccio e lavora rapidamente.Lasciare il campione sul ghiaccio per un massimo di due minuti invertendo a intermittenza il tubo per mescolare. Quindi, centrifuga a 1000 xg e 4 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in 1 mL di tampone di preparazione dei nuclei.Trasferire il campione su un tubo di microcentrifugo pulito, occupandosi di evitare di toccare le pareti del vecchio tubo. Aggiungere 0,6 unità per inibitore della RNasi L e mescolarlo. Quindi, centrifugare il campione per altri 10 minuti.Rimuovere il supernatante e rimescolare un pellet e 1 mL di tampone di lavaggio dei nuclei. Filtrare due volte il campione in un tubo pulito utilizzando filtri impilabili da 30 m. Quindi, lavare i filtri con circa 300 L di tampone di lavaggio dei nuclei.Per confermare il corretto isolamento dei nuclei sani, macchiare una piccola aliquota del campione con trypan e utilizzare un contatore di celle automatizzato per valutare la dimensione media dei morti e la percentuale di cellule morte. Macchiare una piccola aliquota del campione con DAPI ed esaminarla al microscopio con un obiettivo 20X o superiore. I nuclei dovrebbero essere rotondi e avere una membrana nucleare intatta.Le frecce bianche indicano nuclei senza membrana intatta. Dopo aver ripulito i nuclei con FACS, concentrare questo campione centrifugando a 500 xg per cinque minuti a 4 gradi Celsius. Quindi, ricostituirlo in un volume appropriato di tampone di lavaggio dei nuclei.Per ottenere una concentrazione da 50 a 1500 nuclei per L e procedere con nuclei monochirro RNA seq. Per rimuovere detriti cellulari e farsa, i nuclei adipocite vengono ordinati per dimensioni e granularità per escludere aggregati e multipli nucleari. E infine per gli eventi positivi DAPI.Questa strategia di classificazione si traducono in nuclei singoli altamente purificati con aggregati e detriti minimi. Se ispezionati per microscopia, i nuclei ordinati devono essere rotondi e avere una membrana intatta. Una corretta purificazione dei nuclei può anche essere eseguita con qRT-PCR in tempo reale usando primer per il nascente mRNA Ucp1, un gene marcatore per gli adipociti marroni.La piattaforma del cromo determinò un trascrittame di 7500 nuclei dal tessuto adiposo bruno interscapulare murino. Sette diversi tipi di cellule sono stati rivelati con riduzione della dimensionalità t-SNE e clustering k-means. Tutti gli ammassi espressero Fabp4, un gene pan adipocite e un sottoinsieme espressero un alto livello di mRNA Ucp1.Nuclei isolati e poi confermati anche se questo protocollo può essere sottoposto praticamente a qualsiasi piattaforma di espressione genica a livello di singola cellula, incluso il cromo della genomica 10x.

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JoVE Journal

Genetics

Genetica

Grazie al collegamento drastica e negativa tra obesità e altre patologie concomitanti, la ricerca sul adiposo giochi di ruolo nella malattia e la salute generale è garantito. Presentiamo un protocollo per l'isolamento e l'escissione di depositi adiposi consentano lo studio della adiposo usare in situ e metodi in vitro.

Localizzazione, identificazione, e l&#39;escissione dei Depositi Murine adipose

L'isolamento dei nuclei singoli si basa sulla dissociazione e sulla permeabilizzazione a base di detersivo della membrana cellulare, passaggi che necessitano di ottimizzazione e soggetti a introdurre artefatti tecnici. Dimostriamo un protocollo detergente e privo di enzimi per un rapido isolamento dei nuclei intatti direttamente dall'intero tessuto, producendo nuclei adatti per singolo nucleo RNA-seq (snRNA-seq) o ATAC-seq.

Isolamento nuclei dal tessuto intero utilizzando un metodo detergente e senza enzimi

Questo protocollo descrive l'approccio tecnico per isolare sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi di tessuto adiposo bianco (WAT) murino intra-addominale mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o separazione di microsfere immunomagnetiche.

Isolamento di sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi adiposi intra-addominali murini

Questo studio descrive un nuovo metodo per isolare gli adipociti bruni murini per l'analisi dell'espressione genica e proteica.

Isolamento di adipociti bruni da tessuto adiposo bruno interscapolare murino per l'analisi dell'espressione genica e proteica

Qui, presentiamo un protocollo per isolare nuclei di alta qualità da reni di topo congelati che migliorano la rappresentazione dei tipi di cellule renali midollari ed evitano gli artefatti di espressione genica dalla dissociazione enzimatica del tessuto.

Isolamento dei nuclei dal rene di topo adulto per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo

Qui, presentiamo un protocollo per isolare i nuclei da tessuti epatici congelati e archiviati per RNA-seq a nucleo singolo, ATAC-seq e multiomici articolari (RNA-seq e ATAC-seq).

Isolamento di nuclei da tessuto epatico congelato per multiomiche monocellulari

Presentiamo un protocollo per il dosaggio della cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alto rendimento (ATAC-seq) specificamente sugli adipociti utilizzando la selezione del nucleo con tessuti adiposi isolati da topi reporter transgenici con marcatura a fluorescenza nucleare.

ATAC-seq adipocita-specifico con tessuti adiposi mediante selezione del nucleo attivato dalla fluorescenza

Qui, presentiamo un protocollo che descrive la preparazione dei nuclei cellulari. Dopo la microdissezione e la dissociazione enzimatica del tessuto cardiaco in singole cellule, le cellule progenitrici sono state congelate, seguite dall'isolamento di cellule vitali pure, che sono state utilizzate per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo e dal test a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con analisi di sequenziamento ad alto rendimento.

Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per il profilo dell'epigenoma e dell'espressione genica a risoluzione di singole cellule

Lo studio descrive un protocollo semplice, rapido e parzialmente automatizzato per isolare nuclei di alta qualità da tessuti di mammiferi congelati per il sequenziamento dell'RNA di singoli nuclei a valle.

Un protocollo semplice, rapido e parzialmente automatizzato per l'isolamento di singoli nuclei da tessuti di mammiferi congelati per il sequenziamento di singoli nuclei

La biologia del tessuto adiposo intermuscolare (IMAT) è in gran parte inesplorata a causa della limitata accessibilità del tessuto umano. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei nuclei e la preparazione della libreria di IMAT umano congelato per il sequenziamento di RNA a singoli nuclei per identificare la composizione cellulare di questo deposito adiposo unico.

Isolamento di nuclei dal tessuto adiposo intermuscolare umano e sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo a valle

Scopri un protocollo per isolare nuclei da adipociti maturi con sorting a fluorescenza per analisi transcriptomiche a singola cellula. Questo metodo riduce aggregati e detriti cellulari, facilitando studi sull'eterogeneità del tessuto adiposo.

Isolamento dei nuclei di tessuti adiposi per applicazioni genomiche a singola cellula

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