Name: Test di immunoprecipitazione dellRNA metilato per studiare m5C Modifica in Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Scopri il metodo MeRIP per arricchire RNA metilati e identificare modifiche m5C in Arabidopsis. Questa tecnica combina immunoprecipitazione e sequenziamento per studiare il metiloma trascrittomico.

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Questo lavoro è stato sostenuto da uno stipendio di dottorato IMPRS a E.S, una borsa di studio a lungo termine EMBO per V.P., e fondi interni MPI-MPP a F.K. Parte di questo lavoro è stato finanziato anche attraverso PLAMORF, un progetto che ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea (accordo di sovvenzione n. 810131). Gli autori ringraziano Federico Apelt per l'analisi bioinformatica e i commenti sul manoscritto, e Mathieu Bahin e Amira Kramdi per l'analisi bioinformatica.

1. Preparare l'RNA
<ol><li>Macinare 200 mg di tessuto vegetale in polvere in azoto liquido, assicurandosi che il tessuto rimanga congelato durante tutta la procedura.</li>
	<li>Estrarre l'RNA dal tessuto vegetale desiderato seguendo un protocollo di estrazione acido guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio. Per ridurre la possibilità di contaminare l'RNA con il DNA durante la separazione di fase, utilizzare 1-bromo-3-cloropropano invece del cloroformio.<ol>
<li>Aggiungere 1 mL di reagente di estrazione dell'RNA contenente tiocianato di guanidina e fenolo acido al tessuto vegetale macinato (500 μL per 100 mg di tessuto). Mescolare bene invertendo e assicurarsi che tutto il tessuto sia bagnato. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente per dissociare i complessi di ribonucleoproteina.</li>
		<li>Centrifugare per 10 min a 12.000 x g a 4 °C e trasferire il supernatante su un nuovo tubo da 1,5 ml.</li>
		<li>Aggiungere vigorosamente 200 μL di 1-bromo-3-cloropropano (100 μL per 500 μL di reagente di estrazione dell'RNA) e vortice.</li>
		<li>Centrifugare per 15 min a 12.000 x g a 4 °C e trasferire la fase acquosa superiore (circa 500 μL) in un nuovo tubo da 1,5 ml.</li>
		<li>Aggiungere 1 volume di isopropanolo (500 μL) e 0,1 volume di 3 M di acetato di sodio pH 5,5 (50 μL), mescolare bene invertendo e precipitando 10 min a -20 °C. NOTA: L'uso di acetato di sodio (NaOAc) è raccomandato al fine di migliorare la precipitazione dell'RNA. Il protocollo può essere messo in pausa a questo punto prolungando la precipitazione dell'RNA per alcune ore o anche durante la notte.</li>
		<li>Centrifugare per 30 min a 12.000 x g a 4 °C e scartare il supernatante.</li>
		<li>Lavare il pellet due volte con 500 μL di 80% EtOH, centrifugare per 5 min a 12.000 x g a 4 °C e scartare.</li>
		<li>Lavare il pellet una volta con 500 μL 99% EtOH, centrifugare per 5 min a 12.000 x g a 4 °C e scartare.</li>
		<li>Asciugare il pellet per 5-10 minuti e sciogliere in 30 μL di H2O privo di RNasi. NOTA: Utilizzare invece qualsiasi protocollo di estrazione dell'RNA preferito (ad esempio, un sistema basato su colonne). Se nel protocollo è inclusa una digestione della DNasi, saltarla nel passaggio seguente (passaggio 1.3).</li>
	</ol></li>
	<li>Misurare la concentrazione di RNA (ad esempio, con l'uso di uno spettrofotometro) e digerire 20 μg di RNA con DNasi. NOTA: Il DNA è ricco di m5C e l'anticorpo non distingue tra DNA e RNA.<ol>
<li>In una tipica reazione di DNasi, trattare 10 μg di RNA in una reazione di 50 μL. Mescolare i seguenti componenti e incubare le reazioni a 37 °C per 30 minuti: 10 μg di RNA x μL 10x Tampone di DNasi 5 μL DNasi 1 μL (2 unità) RNasi-free H2O fino a 50 μL</li>
		<li>Rimuovere l'enzima aggiungendo un volume appropriato di reagente di inattivazione della DNasi (se è incluso nel kit DNasi e secondo le istruzioni del produttore) o eseguendo una fase di pulizia (ad esempio, purificazione della colonna o estrazione fenolo /cloroformio).</li>
	</ol></li>
	<li>Controllare la qualità e la purezza dell'RNA isolato per elettroforesi capillare e procedere se il numero di integrità dell'RNA (RIN) è superiore a 7, per garantire che i campioni siano di buona qualità.</li>
	<li>OPTIONAL: Rimuovere l'RNA ribosomiale per arricchire i campioni in contenuto di mRNA utilizzando un kit di rimozione dell'rRNA e secondo il protocollo del produttore.<ol>
<li>Utilizzare l'RNA trattato con DNasi del passaggio precedente per le reazioni di esaurimento dell'rRNA. Eseguire reazioni multiple se la quantità di RNA totale è superiore alla quantità massima suggerita per la reazione.</li>
		<li>Si noti che solo il 5-10% della quantità di input verrà recuperato dopo l'esaurimento dell'rRNA. Procedere con l'RNA impoverito di rRNA (uguale quantità per tutti i campioni) e ignorare le quantità menzionate nei seguenti passaggi, in quanto si riferiscono all'RNA totale. NOTA: Per un confronto e una descrizione dei metodi di esaurimento rRNA disponibili vedere riferimenti 38,39,40. l'rRNA è la maggior parte dell'RNA totale ed è metilato m5C in molti organismi.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare in anticipo le trascrizioni in vitro (IVT) da utilizzare come sequenze di RNA di controllo e aggiungerle nei campioni.<ol>
<li>Produrre due T IVT distinti utilizzando un kit di trascrizione in vitro, uno con nucleosidi non metilati e uno in cui rCTP è sostituito da 5-metil-rCTP, per servire rispettivamente come controlli negativi e positivi nel MeRIP. Le trascrizioni preparate erano quelle di EGFP e Renilla luciferasi. NOTA: Gli TIC non dovrebbero esistere nel trascrittame dell'organismo che si sta analizzando. Se gli TIC provengono dallo stesso modello (ad esempio, entrambi EGFP), aggiungere il controllo positivo e negativo in due campioni diversi. Se la loro sequenza è diversa (ad esempio, EGFP e Renilla), possono essere aggiunti allo stesso campione.</li>
		<li>Picco in ogni campione 0,1 ng IVT per 3 μg di RNA, come controlli.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonicare l'RNA a circa 100 nt frammenti. NOTA: Le condizioni per la tranciatura dell'RNA devono essere regolate in anticipo e differiscono per ogni sonicatore. Per il modello qui utilizzato, la sonicazione viene eseguita con le seguenti condizioni: Potenza di picco 174, Fattore di servizio 10, Cicli / burst 200, 17 min.<ol>
<li>Sonicare la stessa quantità di RNA per tutti i campioni, almeno 12 μg di RNA per campione in 80 μL di volume totale (min 60 μL, max 100 μL), riempito con H2O privo di RNasi.</li>
	</ol></li>
	<li>Confermare l'efficienza della sonicazione e la concentrazione dei campioni di RNA per elettroforesi capillare. La dimensione media dell'RNA frammentato dovrebbe essere di circa 100 nt.</li>
</ol>2. Immunoprecipitazione dell'RNA metilato (MeRIP)
<ol><li>Nei tubi a bassa legatura, aggiungere 9 μg di RNA sonicato e H2O privo di RNasi fino a 60 μL (o più, a seconda della concentrazione).</li>
	<li>Dissociare le strutture secondarie riscaldando l'RNA a 70 °C in un bagno d'acqua per 10 minuti e raffreddando per altri 10 minuti in un mix ghiaccio-acqua.</li>
	<li>Dividere il campione in tre parti: un terzo (20 μL, se nel passaggio 2.1 sono stati prelevati 60 μL) viene salvato in un tubo separato a -80 °C come campione di input. Riempire i restanti 40 μL con H2O senza RNasi fino a 860 μL e quindi dividersi in due tubi a bassa legatura: uno per IP e uno per il controllo Mock (430 μL ciascuno).</li>
	<li>Aggiungere ad entrambi i tubi: 50 μL di tampone MeRIP 10x 10 μL di inibitore della RNasi 10 μL di anticorpo α-m5C (10 μg) nel campione IP per 10 μL di H2O nel campione Mock NOTA: Il clone di anticorpi utilizzato in precedenza non è più disponibile in commercio. Tuttavia, qualsiasi anticorpo monoclonale anti-5-metilcitosina dovrebbe funzionare allo stesso modo. Gli anticorpi devono essere testati per verifica della specificità prima dell'uso per meRIP11,23.</li>
	<li>Sigillare i tubi con parafilm e incubare per 12-14 ore a 4 °C, con rotazione aerea.</li>
	<li>Il giorno dopo, preparare le perline magnetiche G proteiche per il legame.<ol>
<li>Per ogni tubo (controllo IP o Mock), utilizzare 40 μL di perline. Aggiungere la quantità totale di perline (# di tubi x 40 μL, ad esempio, per 2 campioni IP e 2 Mock, sono necessari 160 μL di perline) in un tubo da 15 ml e lavare tre volte con 800 μL di tampone MeRIP 1x per campione (# di tubi x 800 μL buffer, ad esempio 3,2 ml per 2 campioni IP e 2 Mock).</li>
		<li>Eseguire lavaggi a temperatura ambiente per 5 minuti con rotazione aerea, raccogliere le perline con l'aiuto di un rack magnetico e scartare il tampone di lavaggio. Dopo il terzo lavaggio, resuspend le perline nello stesso volume di tampone MeRIP 1x del volume iniziale di perline prelevate (# di tubi x 40 μL, ad esempio 160 μL di tampone MeRIP 1x per 2 campioni IP e 2 Mock). NOTA: La quantità di perline G proteiche utilizzate è determinata dalla capacità di legame delle perline per il tipo di anticorpo specifico e dalla quantità di anticorpi utilizzati. In questo caso, le perline hanno una capacità di legame di circa 8 μg di IgG di topo per mg di perline e 30 mg/mL di concentrazione. Pertanto, 40 μL sono sufficienti per legare circa 9,6 μg di anticorpi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 40 μL di perline rimorsi a ciascun campione IP e Mock e incubare per ulteriori 2 ore a 4 °C, con rotazione aerea.</li>
	<li>Posizionare i tubi su un rack magnetico per 1 minuto e scartare il supernatante o salvarlo come controllo (campione di RNA non legato).</li>
	<li>Lavare le perline 5 volte riutilizzando in 700 μL di 1 tampone MeRIP fornito con 0,01% Tween 20 e incubando per 10 minuti a temperatura ambiente con rotazione aerea.</li>
	<li>Rimescolare le perline lavate in 200 μL di tampone di digestione Proteinasi K e aggiungere 3,5 μL di Proteinasi K. Incubare per 3 ore a 50 °C, tremando a 800 giri/min. Occasionalmente, scorrere manualmente il fondo del tubo se un sedimento di perline si sta formando durante l'incubazione.</li>
	<li>Estrarre l'RNA con l'aggiunta di 800 μL di reagente di estrazione dell'RNA e seguendo un protocollo di estrazione acido guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio, e continuare come nella fase 1.2. Per aumentare la visibilità del pellet di RNA, un co-precipitante colorato può essere aggiunto in isopropanolo nella fase di precipitazione. Rimescolare il pellet in 20 μL di H2O privo di RNasi (o uguale al volume di ingresso mantenuto nel passaggio 2.3).</li>
</ol>3. Analisi a valle
<ol><li>Inviare gli esempi Input e IP per il sequenziamento a estremità singola con 50 basi di lunghezza di lettura (SE50).</li>
	<li>Tagliare gli adattatori finali da 3' utilizzando cutadapt41 e scartare letture inferiori a 48 nt.</li>
	<li>Mappa tagliata legge sul genoma arabidopsis (annotazione TAIR10) utilizzando STAR42 con un taglio del 6% per disallineamenti e dimensione massima dell'introne di 10 kb. Mantieni letture mappate in modo univoco per ulteriori analisi.</li>
	<li>Identificare i frammenti di RNA arricchiti nei campioni IP rispetto all'input utilizzando due metodi distinti e considerare quelli che si trovano significativamente arricchiti da entrambi.<ol>
<li>Innanzitutto, rilevare i picchi merip-seq utilizzando il chiamante di picco MACS243 sugli IP in pool rispetto all'input.</li>
		<li>In secondo luogo, seguire l'analisi per le chiamate di picco MeRIP-seq comedescritto in Meyer etal.<ol>
<li>Utilizzando script R personalizzati, dividere il genoma in distinte finestre da 25 nt e contare il numero di letture mappate in modo univoco per ogni finestra in base alla posizione dell'ultimo nucleotide mappato (poiché le letture provengono da 100 frammenti di RNA nt).</li>
			<li>Calcolare finestre significativamente arricchite in campioni IP rispetto all'input con il test fisher exact. Utilizzare la procedura Benjamini-Hochberg per correggere più test.</li>
			<li>Mantieni i picchi significativamente arricchiti che si estendono su almeno due finestre consecutive e scarta i picchi che coprono una sola finestra.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identificare le regioni annotate del genoma (trascrizioni) con picchi significativamente arricchiti trovati con entrambi i metodi.</li>
	<li>In alternativa o in modo complementare, testare obiettivi di RNA specifici per il loro arricchimento nei campioni IP.<ol>
<li>Trascrivere inversamente l'RNA (stesso volume di campioni Input, IP e Mock) con esameri casuali.</li>
		<li>Eseguire PCR quantitativo in tempo reale sulle destinazioni scelte, confrontando Input, IP e Mock tramite il metodo ΔΔCt. NOTA: Il prodotto generato non deve essere più lungo di 100 bp, poiché questa è la dimensione media della frammentazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+N+6+-Methyladenosine+%28m+6+A%29+Map+Using+Photo-Crosslinking-Assisted+m+6+A+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">High-Resolution N 6 -Methyladenosine (m 6 A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m 6 A Sequencing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.

L'RNA trasporta più di cento distinte modifiche di base4 che formano l'epitranscriptome44. Queste modifiche aggiungono un ulteriore livello di regolazione della traduzione e della segnalazione (rivisto in5,6,8,20,45,46). I primi studi sono stati in grado di rilevare la presenza di modifiche post-trascrizionale sull'RNA28,47, ma gli RNA modificati specifici devono essere identificati per comprendere il ruolo dell'epitranscriptomica. MeRIP è stato progettato come metodo per mappare i siti di metilazione dell'RNA a livello di trascrizione21,22. Può essere adattato a qualsiasi modifica, se è disponibile un anticorpo specifico.
La forza principale di questo protocollo è che è relativamente semplice, sicuro per l'RNA e l'utente (ad esempio, 5-azaC è altamente tossico per le piante e l'uomo) e non richiede informazioni enzimatiche di sequenza o modifica. Inoltre, l'arricchimento delle RNA metilate da parte del PI aumenta le possibilità di rilevati mRNA a bassa abbondanza, a differenza del sequenziamento della bisolfito che non contiene una fase di arricchimento. Quando vengono eseguiti due cicli seriali di MeRIP, l'arricchimento in frammenti di RNA contenenti siti di metilazione aumenta ulteriormentedi 22. Una delle limitazioni del MeRIP, specialmente se applicata agli studi di metilazione dell'mRNA, è l'alta quantità di RNA richiesta come input per il saggio. Il passo di ribodeplezione - o arricchimento poli(A) - ridurrà lo sfondo causato dall'RNA ribosomiale pesantemente modificato, ma rimuove oltre il 90% dell'RNA totale. Anche il DNA deve essere completamente rimosso in quanto ricco di citosi metilate a 5 metilati. Un altro inconveniente è la minore risoluzione della posizione esatta della metilazione. La sonicazione dell'RNA prima dell'incubazione con l'anticorpo aiuta in questa direzione restringendo la regione contenente la modifica a 100-200 nucleotidi. Quando il MeRIP è combinato con il sequenziamento profondo, la risoluzione della previsione del sito m5C aumenta man mano che le letture di sequenziamento formano una distribuzione gaussiana attorno al potenziale sito di metilazione. Inoltre, la specificità dell'anticorpo deve essere confermata prima del test (ad esempio, con test di macchie di RNA dot, eseguite con oligidi sintetizzati con nucleotidi modificati), tuttavia, in che misura un anticorpo può effettivamente distinguere tra modifiche strettamente correlate (ad esempio, m6A e m6Am) è un punto di discussione nelcampo 48,49. Inoltre, gli RNA altamente strutturati potrebbero interferire con l'interazione anticorpo-antigene, un'altra restrizione che viene principalmente affrontata con la frammentazione e la denaturazione dell'RNA prima della PI. Al contrario, il sequenziamento della bisulfite che è anche influenzato da strutture secondarie, non include una fase di frammentazione e questo potrebbe essere uno dei motivi che causa discrepanza tra i siti m5C e gli mRNA previsti dal sequenziamento bisolfito16 e MeRIP-seq11,17. Anche altre modifiche della citosina (ad esempio, hm5C) sono resistenti alla deaminazione mediata dalla bisolfito35.
Le modifiche di MeRIP-seq includono un passaggio di reticolo, sia con l'introduzione di un ribonucleoside fotoattivibile (foto-crosslinking-assisted m6A-seq, PA-m6A-seq 50) o utilizzando la luce UV per creare collegamenti incrociati anticorpo-RNA dopo l'IP (miCLIP49, metodo diverso rispetto al miCLIP descritto nell'introduzione30, ma anche con risoluzione del nucleotide individuale). In futuro, e poiché le conoscenze sulla metilazione dell'RNA si stanno accumulando, potrebbero essere preferibili approcci più mirati, basati sugli enzimi di modifica e/o sulle sequenze di consenso in cui appare la metilazione. L'identificazione delle proteine del lettore è essenziale per la comprensione della funzione molecolare e di segnalazione delle modifiche post-trascrizionale. La tecnologia di sequenziamento dei nanopore consente già l'identificazione diretta di nucleotidi modificati senza trattamento preventivo dell'RNA17, ma c'è ancora spazio per miglioramenti in questo campo per quanto riguarda la profondità della sequenza e l'analisi bioinformatica. Nel complesso, MeRIP-seq è attualmente un approccio consolidato, affidabile e imparziale per identificare le trascrizioni di RNA metilato.

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Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
to:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua 
3Biologie de l&#39;Ecole Normale Sup&#233;rieure (IBENS),&#160;Paris, France

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Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

In tutti e tre i regni della vita, le specie di RNA subiscono modifiche post-trascrizionali e la ricerca su queste modifiche biochimiche funzionalmente rilevanti è chiamata "epitranscriptomica". L'epitranscriptomica è un campo in crescita e sono in fase di sviluppo vari metodi per studiare e mappare le modifiche sulle molecole di RNA (esaminate in1,2). Sono state trovate più di un centinaio di modifiche all'RNA, rilevate in rRNA, tRNA, altri ncRNA, nonché mRNA3,4. Sebbene la presenza e la funzione di modifiche post-trascrittivi chimicamente diverse in tRNA e rRNA siano ampiamentestudiate 5,6,7,8, solo di recente sono state caratterizzate modifiche all'mRNA. Nelle piante, molte modifiche dell'mRNA sono state identificate fino ad oggi, tra cui m7G alla struttura delcappuccio 9,m1A10, hm5C11,12e uridylation13. Tuttavia, solo m6A10,14,15, m5C11,16,17e pseudouridina18 sono stati mappati a livello di trascrizione in Arabidopsis. Le modifiche alla base dell'mRNA post-trascrizionale sono coinvolte in diversi processidi sviluppo 19,20.
Uno degli approcci più comunemente usati nell'epitranscriptomica è l'immunoprecipitazione dell'RNA metilata accoppiata al sequenziamento profondo (MeRIP-seq). MeRIP-seq è stato sviluppato nel 2012 per studiare m6A nelle cellule dimammifero 21,22. Richiede l'uso di un anticorpo per la modifica desiderata e mira ad arricchire per i frammenti di RNA che trasportano i nucleotidi modificati. Di solito è seguito da un sequenziamento profondo per identificare e mappare i frammenti arricchiti o la PCR quantitativa per verificare specifici obiettivi di RNA. L'accuratezza del MeRIP si basa sulla specificità dell'anticorpo per riconoscere il nucleotide modificato rispetto a modifiche simili (ad esempio, m5C e hm5C11,23). Oltre a m6A, MeRIP-seq è stato applicato anche allo studio m1A e m5C metilazione RNA in diversiorganismi 11,17,23,24,25.
La metilazione della citosina alla quinta posizione di carbonio (m5C) è la modificazione del DNA più diffusa26,27 e una delle modifiche più comuni dell'RNAtroppo 3,4. Mentre m5C è stato rilevato in mRNA eucarioti nel 197528, solo di recente hanno studi focalizzati sulla mappatura della modifica a livello di trascrizione, in RNA di codifica e non codifica11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.
I metodi alternativi utilizzati nellaricerca sull'RNAm 5 C includono la conversione chimica delle citosina non metilate in uracili (sequenziamento della bisolfito) e test di immunoprecipitazione basati su un legame irreversibile di una citosina RNA nota metiltransferasi ai suoi bersagli di RNA (miCLIP, aza-IP). In breve, il sequenziamento della bisulfite sfrutta la caratteristica della citosina 5 metilata per essere resistente al trattamento con bisolfito di sodio che deamina citosina non modificata all'uracile. Il metodo è stato sviluppato per la prima volta per il DNA ma adattato anche per l'RNA e molti studi hanno scelto questo approccio per rilevare siti m5C in RNA16,23,29,32,34,35. Sia miCLIP che aza-IP richiedono una precedente conoscenza dell'RNA citosina metiltransferasi e l'uso del rispettivo anticorpo. Nel caso di miCLIP (metilazione crosslinking a risoluzione individuale nucleotidica e immunoprecipitazione), la metiltransferasi porta una singola mutazione amminoacidica in modo che si lega al substrato di RNA ma non può essererilasciata 30. Nell'immunoprecipitazione dell'RNA mediata da aza-IP (immunoprecipitazione dell'RNA mediata da 5-azacidina), il legame irreversibile si forma tra il nucleoside 5-azaC e l'RNA citosina metiltransferasi quando esogenamente fornito 5-azaC è incorporato da RNA polimerasi in una molecola di RNA bersaglio31.
Il vantaggio principale di questi tre metodi è che consentono la mappatura della risoluzione del singolo nucleotide di m5C. Inoltre, miCLIP e aza-IP forniscono informazioni sugli obiettivi specifici di un RNA citosina metiltransferasi selezionato, decifrando più in profondità il meccanismo e il ruolo delle modifiche dell'RNA post-trascrizionale. Tuttavia, l'approccio MeRIP-seq può identificare le regioni m5C a livello di trascrittome senza alcuna conoscenza precedente richiesta ed evita condizioni chimiche e di temperatura difficili, come il trattamento con bisolfito o l'incubazione con 5-azaC. Sia il sequenziamento del MeRIP che quello della bisolfito possono essere inibiti dalle strutture secondariedell'RNA 36. La fase di frammentazione inclusa nel saggio MeRIP prima dell'immunoprecipitazione mira a facilitare il legame anticorpale e ad aumentare la risoluzione dell'identificazione m5C.
Un altro metodo degno di nota è la spettrometria di massa (MS) dei nucleosidi dell'RNA. La SM può rilevare e distinguere qualsiasi tipo di modifica sia sul DNA che sull'RNA. In breve, l'RNA viene estratto e la DNasi digerita, quindi dissaledata e digerita in singoli nucleosidi. I nucleosidi dell'RNA sono analizzati da uno spettrometro di massa. Questo metodo può essere utilizzato per quantificare i livelli di ogni modifica e non si basa su un anticorpo o una conversione chimica. Tuttavia, uno dei principali svantaggi è che fornisce informazioni in blocco sulla presenza di modifiche all'RNA. Per mappare le modifiche, la SM deve essere combinata con la digestione della RNasi e le informazioni di sequenziamento su molecole di RNA specifiche, come nel caso del tRNAumano Leu(CAA)37.
Qui descriviamo e discutiamo il saggio MeRIP utilizzato per studiare lametilazione dell'RNAm 5 C in Arabidopsis17.

<table><tbody><tr><td>anticorpo anti-m5C</td><td>ZymoResearch</td><td>A3001 (fuori produzione), A3002 disponibile</td><td>Clone 10G4 (fuori produzione), 7D21 disponibile</td></tr><tr><td>Chip e reagenti per elettroforesi capillare</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>RNA 6000 Nano kit</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td>TURBO Kit senza DNA</td></tr><tr><td>Co-precipitante di acidi nucleici</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td>Glicoblu, 15 mg/mL</td></tr><tr><td>Kit di trascrizione In vitro</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td>T7 RiboMAX Sistema di produzione di RNA su larga scala</td></tr><tr><td>Provette di reazione a basso legame</td><td>Kisker Biotech</td><td>G017</td><td>Provette per microcentrifuga da 1,7 ml</td></tr><tr><td>Perle magnetiche di proteina G</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td>Dynabeads Proteina G</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>20mg/mL soluzione madre, grado</td></tr> <tr>RNA<td>Inibitore della RNasi</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>RNasin Plus 40 U/&mu; l</td></tr><tr><td>Kit di rimozione dell'rRNA</td><td>Epicentro</td> RZPL11016 <td>Kit di rimozione dell'rRNA Ribo-Zero (foglia vegetale)</td><td></td></tr><tr><td>Provette di sonicazione</td><td>Microprovetta Covaris 520045</td><td></td><td>Fibra AFA Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td></tr><tr><td>Reagente per l'estrazione dell'RNA</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td>Reagente TRIzol</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macchina per elettroforesi capillare</td><td>Sistema di bioanalizzatori</td> <td>Agilent</td><td>G2939BA</td> 2100</tr><tr><td>Rack magnetico</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Microcentrifuga DynaMag-2</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>fuori produzione</td><td>Modello 5417R</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Benchmark</td><td>R4040</td><td>RotoBot Mini</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td>Spettrofotometro</td></tr> <tr><td></td><td>a ultrasuoni focalizzati S220ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td>NanoDrop OneC</td></tr><tr><td>Bagnomaria</td><td>GFL</td><td>1012</td><td>1012 Bagno di incubazione</td></tr></tbody></table>

test di immunoprecipitazione dell'rna metilato per studiare m5c modifica in arabidopsis

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

Le modifiche di base secondarie sull'RNA, come m5C, influenzano la struttura e la funzione delle molecole di RNA modificate. L'immunoprecipitazione e sequenziamento dell'RNA metilato (MeRIP-seq) è un metodo che mira ad arricchire l'RNA metilato e infine identificare trascrizioni modificate. In breve, l'RNA sonicato viene incubato con un anticorpo per citosina 5 metilate e precipitato con l'aiuto di perline proteiche G. I frammenti arricchiti vengono quindi sequenziati e i potenziali siti di metilazione vengono mappati in base alla distribuzione delle letture e al rilevamento dei picchi. MeRIP può essere applicato a qualsiasi organismo, in quanto non richiede alcuna sequenza precedente o modifica della conoscenza enzimatica. Inoltre, oltre alla frammentazione, l'RNA non è sottoposto ad alcun altro trattamento chimico o di temperatura. Tuttavia, MeRIP-seq non fornisce una previsione mono nucleotidica del sito di metilazione come fanno altri metodi, anche se l'area metilata può essere ristretta ad alcuni nucleotidi. L'uso di diversi anticorpi specifici della modifica consente di regolare merip per le diverse modifiche di base presenti sull'RNA, espandendo le possibili applicazioni di questo metodo.

Uno schema del metodo è fornito nella figura 1. I primi passaggi critici del protocollo sono ottenere RNA di buona qualità (RIN ≥ 7) e sonicarlo a circa 100 nt frammenti. L'efficienza di entrambe le fasi viene esaminata da una macchina per elettroforesi capillare a base di chip. Nella figura 2Aviene mostrata una corsa rappresentativa di un buon campione di RNA. Il campione viene diluito 1:10 prima del caricamento sul chip per avere una concentrazione che si trova nell'intervallo di rilevamento del kit utilizzato (5-500 ng/μL). Lo stesso campione viene eseguito anche dopo la sonicazione ed è mostrato nella figura 2B. Si noti la presenza di un picco uniforme spostato a sinistra del diagramma, con una dimensione di circa 100 nucleotidi. La concentrazione inferiore è causata sia dalla perdita di RNA durante la frammentazione, ma anche dall'aumento del volume dei campioni (60-100 μL, fase 1.7.1).
La qualità degli esempi IP e Mock può essere valutata da qRT-PCR. A tal fine, gli TIC a spillo fungono da controlli positivi e negativi: l'IVT metilato, dove in tutte le posizioni di citosina c'è m5C, dovrebbe essere altamente arricchito nel campione IP; al contrario, l'IVT non metilato non dovrebbe avere una differenza tra IP e Mock. I primer utilizzati nel saggio qRT-PCR per i due VTT di controllo(EGFP e Renilla luciferase) sono elencati nella tabella 1. Infatti, come mostrato nella figura 3, circa l'80% dell'IVT metilato è stato recuperato nel campione IP e solo circa il 2% nel Mock. Per il controllo non metilato, il recupero è stato inferiore all'1% sia nei campioni IP che Mock. Ciò verifica l'efficienza del MeRIP che i frammenti di RNA metilati sono stati precipitati e arricchiti, ed è un buon indicatore che i campioni possono essere utilizzati per l'analisi a valle. Inoltre, l'arricchimento delle pieghe dell'IVT non metilato (rapporto IP-Mock) può essere applicato come soglia per stimare la significatività dell'arricchimento nei test qRT-PCR.
Dopo aver allineato le letture al genoma (Figura 4), gli algoritmi di chiamata di picco descritti nei passaggi 3.4.1 e 3.4.2 vengono applicati per identificare le finestre statisticamente significative, arricchite nei campioni IP rispetto all'Input. Le sequenze che corrispondono a queste finestre possono essere utilizzate ulteriormente, ad esempio per cercare motivi conservati correlati alla metilazione11,17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig01.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo MeRIP-seq. I campioni di RNA vengono incubati con un anticorpo per citosina 5 metilati e i complessi vengono abbattuti con perline magnetiche G proteiche che catturano gli anticorpi insieme all'RNA legato. I campioni di RNA eluitati vengono analizzati mediante sequenziamento profondo e qRT-PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig02.jpg"> Figura 2: Risultati rappresentativi dell'analisi della qualità dei campioni di RNA. (A) Profilo rappresentativo di un campione totale qualificato di impianto di RNA. (B) Profilo rappresentativo di un campione di RNA dopo sonicazione a 100 nt frammenti. File di output dal software di elettroforesi capillare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig03.jpg"> Figura 3: analisi qRT-PCR degli IVT di controllo. Le trascrizioni in vitro metilate e non metilate sono state utilizzate rispettivamente come controlli positivi e negativi del saggio MeRIP. Dopo l'immunoprecipitazione, l'IVT metilato è altamente arricchito nel campione IP (verde) ma non nel campione Mock (senza anticorpo anti-m5C; viola). L'IVT non metilato non ha mostrato alcun arricchimento e nessuna differenza tra IP e Mock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig04.jpg"> Figura 4: Leggere l'allineamento prima e dopo merip intorno a una trascrizione rappresentativa. Letture allineate a una trascrizione specifica nell'esempio input (riga superiore) e in due repliche IP (riga centrale e inferiore). La scatola nera mostra una finestra lunga 50 nt arricchita identificata basata su analisi di picco MACS243 e MeRIP-seq22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>bersaglio</td>
			<td colspan="2">Coppia primer</td>
			<td colspan="2">Sequenza del prodotto</td>
			<td>Lunghezza del prodotto</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">EGFP</td>
			<td colspan="2">Per: 5'- GGCAACTACAAGACCCGCGCC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAG GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC</td>
			<td rowspan="2">72 pb</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Renilla luciferasi</td>
			<td colspan="2">Per: 5'- GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACC ATGTTGCCATCAAAATCATGAGAA AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC</td>
			<td rowspan="2">75 pb</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Informazioni sui primer e sui prodotti generati per l'analisi qRT-PCR.
Ricette tampone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/Buffer%20Recipes%20MeRIP.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Il saggio di immunoprecipitazione dell'RNA metilato è un metodo a base di anticorpi utilizzato per arricchire i frammenti di RNA metilati. Accoppiato con il sequenziamento profondo, porta all'identificazione di trascrizioni che trasportano la modifica m5C.

Test di immunoprecipitazione dell'RNA metilato per studiare m5C Modifica in Arabidopsis

Secondary base modifications on RNA, such as m5C, affect the structure and function of the modified RNA molecules. Methylated RNA Immunoprecipitation and ...

L'immunoprecipitazione dell'RNA metilato, chiamata anche MeRIP, è un metodo progettato per identificare i gruppi metilati in interi trascrittomi. Può essere adattato agli estratti di RNA di molti organismi modello. Il metodo è semplice, non richiede alcun trattamento chimico aggressivo e può essere utilizzato per mappare qualsiasi modifica dell'RNA purché la variabile specifica.Per estrarre il campione di RNA, macinare prima 200 milligrammi del campione di tessuto vegetale di interesse in polvere in azoto liquido, facendo attenzione che il tessuto rimanga congelato durante tutta la procedura. Quindi, aggiungi un millilitro di reagente per l'estrazione dell'RNA contenente tiocianato di guanidina e fenolo acido al tessuto vegetale macinato e mescola bene per inversione, assicurandoti che tutto il tessuto sia bagnato. Dopo 10 minuti a temperatura ambiente, centrifugare i campioni e trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri.Aggiungere 200 microlitri di 1-bromo-3-cloropropano al surnatante e agitare energicamente il campione. Separare le fasi mediante centrifugazione e trasferire circa 500 microlitri della fase acquosa superiore in una nuova provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di isopropanolo e 50 microlitri di acetato di sodio a tre molari al campione e mescolare bene per inversione.Incubare il campione per 10 minuti a meno 20 gradi Celsius prima di precipitare l'RNA mediante centrifugazione. Dopo aver scartato il surnatante, lavare il pellet due volte con 500 microlitri di etanolo all'80% e una volta con 500 microlitri di etanolo al 99%. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare il pellet per cinque-10 minuti prima di scioglierlo in 30 microlitri di acqua priva di RNasi.Misurare la concentrazione di RNA su uno spettrofotometro e digerire 20 microgrammi del campione di RNA in una soluzione di acqua DNasi e tampone. Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius, utilizzare un volume appropriato di reagente di inattivazione della DNasi per rimuovere l'enzima e verificare la qualità e la purezza dell'RNA isolato mediante elettroforesi capillare secondo i protocolli standard. Se il numero di integrità dell'RNA del campione digerito con DNasi è superiore a sette, aggiungere almeno 12 microgrammi di ciascun campione di RNA in una nuova provetta.Aumentare il picco di 0,1 nanogrammi di ogni trascritto in vitro precedentemente preparato, uno metilato e uno non metilato, per tre microgrammi di campione di RNA e portare il volume finale in ciascuna provetta a 80 microlitri con acqua priva di RNasi. Quindi sonicare l'intero volume di ciascun campione di RNA in singole provette di sonicazione e confermare l'efficienza della sonicazione e la concentrazione dei campioni di RNA mediante elettroforesi capillare. La dimensione media dell'RNA frammentato dovrebbe essere di circa 100 nucleotidi.Per l'immunoprecipitazione dell'RNA metilato, aggiungere nove microgrammi di ciascun campione di RNA sonicato e fino a 60 microlitri di acqua priva di RNasi in nuove provette individuali a basso legame e riscaldare l'RNA a 70 gradi Celsius in un bagno d'acqua per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, raffreddare i campioni per 10 minuti in un bagno di acqua ghiacciata e trasferire 20 microlitri di ciascun campione in una nuova provetta a basso legame per una conservazione a meno 80 gradi Celsius come input. Aggiungere acqua priva di RNasi ai restanti 40 microlitri di ciascun campione fino a un volume finale di 860 microlitri e dividere ogni campione in una provetta a basso legame per l'immunoprecipitazione e una provetta a basso legame come campione simulato.Aggiungere 50 microlitri di tampone MeRIP 10X e 10 microlitri di inibitore della RNasi a ciascun campione. Quindi, aggiungere 10 microlitri di anticorpi anti-M5C alle provette di immunoprecipitazione e 10 microlitri di acqua alle provette finte. Sigillare le provette con parafilm e incubare i campioni per 12-14 ore a quattro gradi Celsius con rotazione dall'alto.La mattina successiva, aggiungere 40 microlitri di perle a una provetta da 15 millilitri per campione. Lavare le perle con tre lavaggi di cinque minuti con 800 microlitri di tampone MeRIP e rotazione dall'alto per campione per lavaggio, raccogliendo le perle su un magnete dopo ogni lavaggio per consentire lo scartamento del tampone. Dopo il terzo lavaggio, risospendere le perle in 40 microlitri di tampone MeRIP fresco per campione e aggiungere 40 microlitri di perle risospese all'immunoprecipitazione e simulare le provette per un'incubazione di due ore a quattro gradi Celsius con rotazione dall'alto.Al termine dell'incubazione, posizionare le provette su una griglia magnetica per un minuto prima di scartare con cura il surnatante senza disturbare le perle. Lavare le perle cinque volte in 700 microlitri di tampone MeRIP integrato con 0,01%Tween-20 per 10 minuti per lavaggio a temperatura ambiente con rotazione dall'alto. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le perle in 200 microlitri di tampone digestivo proteinasi K e 3,5 microlitri di proteinasi K per un'incubazione di tre ore a 50 gradi Celsius con agitazione a 800 giri al minuto.Al termine dell'incubazione, estrarre l'RNA con 800 microlitri di reagente di estrazione dell'RNA e il protocollo di estrazione acido guanidinio tiocianato fenolo cloroformio come dimostrato. Dopo l'estrazione, risospendere il pellet di RNA estratto in esattamente 20 microlitri di acqua priva di RNasi. In questa figura, viene mostrata una corsa rappresentativa di un buon campione di RNA.Nello stesso campione dopo la sonicazione, si può osservare la presenza di un picco uniforme spostato a sinistra a una dimensione di circa 100 nucleotidi. La concentrazione più bassa è causata sia dalla perdita di RNA durante la frammentazione che dall'aumento del volume del campione. La qualità dell'immunoprecipitazione e dei campioni simulati può essere valutata mediante PCR quantitativa con trascrittasi inversa.In questa analisi rappresentativa, circa l'80% del trascritto metilato in vitro è stato recuperato nel campione di immunoprecipitazione, mentre solo circa il 2% è stato recuperato nel campione simulato. Per il controllo non metilato, il recupero è stato inferiore all'1% sia nell'immunoprecipitazione che nei campioni simulati. Dopo il sequenziamento approfondito e l'allineamento delle letture al genoma, è possibile applicare algoritmi di chiamata dei picchi per identificare le finestre statisticamente significative che sono arricchite nei campioni di immunoprecipitazione rispetto all'input.Utilizzando i dati di sequenziamento, possiamo identificare il motivo per cui si verifica più spesso la metilazione dell'RNA e questo motivo può servire come esca per abbattere specifiche proteine leganti.

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