Test di immunoprecipitazione dell'RNA metilato per studiare m5C Modifica in Arabidopsis
14 maggio 2020
Il saggio di immunoprecipitazione dell'RNA metilato è un metodo a base di anticorpi utilizzato per arricchire i frammenti di RNA metilati. Accoppiato con il sequenziamento profondo, porta all'identificazione di trascrizioni che trasportano la modifica m5C.
L'immunoprecipitazione dell'RNA metilato, chiamata anche MeRIP, è un metodo progettato per identificare i gruppi metilati in interi trascrittomi. Può essere adattato agli estratti di RNA di molti organismi modello. Il metodo è semplice, non richiede alcun trattamento chimico aggressivo e può essere utilizzato per mappare qualsiasi modifica dell'RNA purché la variabile specifica.
Per estrarre il campione di RNA, macinare prima 200 milligrammi del campione di tessuto vegetale di interesse in polvere in azoto liquido, facendo attenzione che il tessuto rimanga congelato durante tutta la procedura. Quindi, aggiungi un millilitro di reagente per l'estrazione dell'RNA contenente tiocianato di guanidina e fenolo acido al tessuto vegetale macinato e mescola bene per inversione, assicurandoti che tutto il tessuto sia bagnato. Dopo 10 minuti a temperatura ambiente, centrifugare i campioni e trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri.
Aggiungere 200 microlitri di 1-bromo-3-cloropropano al surnatante e agitare energicamente il campione. Separare le fasi mediante centrifugazione e trasferire circa 500 microlitri della fase acquosa superiore in una nuova provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di isopropanolo e 50 microlitri di acetato di sodio a tre molari al campione e mescolare bene per inversione.
Incubare il campione per 10 minuti a meno 20 gradi Celsius prima di precipitare l'RNA mediante centrifugazione. Dopo aver scartato il surnatante, lavare il pellet due volte con 500 microlitri di etanolo all'80% e una volta con 500 microlitri di etanolo al 99%. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare il pellet per cinque-10 minuti prima di scioglierlo in 30 microlitri di acqua priva di RNasi.
Misurare la concentrazione di RNA su uno spettrofotometro e digerire 20 microgrammi del campione di RNA in una soluzione di acqua DNasi e tampone. Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius, utilizzare un volume appropriato di reagente di inattivazione della DNasi per rimuovere l'enzima e verificare la qualità e la purezza dell'RNA isolato mediante elettroforesi capillare secondo i protocolli standard. Se il numero di integrità dell'RNA del campione digerito con DNasi è superiore a sette, aggiungere almeno 12 microgrammi di ciascun campione di RNA in una nuova provetta.
Aumentare il picco di 0,1 nanogrammi di ogni trascritto in vitro precedentemente preparato, uno metilato e uno non metilato, per tre microgrammi di campione di RNA e portare il volume finale in ciascuna provetta a 80 microlitri con acqua priva di RNasi. Quindi sonicare l'intero volume di ciascun campione di RNA in singole provette di sonicazione e confermare l'efficienza della sonicazione e la concentrazione dei campioni di RNA mediante elettroforesi capillare. La dimensione media dell'RNA frammentato dovrebbe essere di circa 100 nucleotidi.
Per l'immunoprecipitazione dell'RNA metilato, aggiungere nove microgrammi di ciascun campione di RNA sonicato e fino a 60 microlitri di acqua priva di RNasi in nuove provette individuali a basso legame e riscaldare l'RNA a 70 gradi Celsius in un bagno d'acqua per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, raffreddare i campioni per 10 minuti in un bagno di acqua ghiacciata e trasferire 20 microlitri di ciascun campione in una nuova provetta a basso legame per una conservazione a meno 80 gradi Celsius come input. Aggiungere acqua priva di RNasi ai restanti 40 microlitri di ciascun campione fino a un volume finale di 860 microlitri e dividere ogni campione in una provetta a basso legame per l'immunoprecipitazione e una provetta a basso legame come campione simulato.
Aggiungere 50 microlitri di tampone MeRIP 10X e 10 microlitri di inibitore della RNasi a ciascun campione. Quindi, aggiungere 10 microlitri di anticorpi anti-M5C alle provette di immunoprecipitazione e 10 microlitri di acqua alle provette finte. Sigillare le provette con parafilm e incubare i campioni per 12-14 ore a quattro gradi Celsius con rotazione dall'alto.
La mattina successiva, aggiungere 40 microlitri di perle a una provetta da 15 millilitri per campione. Lavare le perle con tre lavaggi di cinque minuti con 800 microlitri di tampone MeRIP e rotazione dall'alto per campione per lavaggio, raccogliendo le perle su un magnete dopo ogni lavaggio per consentire lo scartamento del tampone. Dopo il terzo lavaggio, risospendere le perle in 40 microlitri di tampone MeRIP fresco per campione e aggiungere 40 microlitri di perle risospese all'immunoprecipitazione e simulare le provette per un'incubazione di due ore a quattro gradi Celsius con rotazione dall'alto.
Al termine dell'incubazione, posizionare le provette su una griglia magnetica per un minuto prima di scartare con cura il surnatante senza disturbare le perle. Lavare le perle cinque volte in 700 microlitri di tampone MeRIP integrato con 0,01%Tween-20 per 10 minuti per lavaggio a temperatura ambiente con rotazione dall'alto. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le perle in 200 microlitri di tampone digestivo proteinasi K e 3,5 microlitri di proteinasi K per un'incubazione di tre ore a 50 gradi Celsius con agitazione a 800 giri al minuto.
Al termine dell'incubazione, estrarre l'RNA con 800 microlitri di reagente di estrazione dell'RNA e il protocollo di estrazione acido guanidinio tiocianato fenolo cloroformio come dimostrato. Dopo l'estrazione, risospendere il pellet di RNA estratto in esattamente 20 microlitri di acqua priva di RNasi. In questa figura, viene mostrata una corsa rappresentativa di un buon campione di RNA.
Nello stesso campione dopo la sonicazione, si può osservare la presenza di un picco uniforme spostato a sinistra a una dimensione di circa 100 nucleotidi. La concentrazione più bassa è causata sia dalla perdita di RNA durante la frammentazione che dall'aumento del volume del campione. La qualità dell'immunoprecipitazione e dei campioni simulati può essere valutata mediante PCR quantitativa con trascrittasi inversa.
In questa analisi rappresentativa, circa l'80% del trascritto metilato in vitro è stato recuperato nel campione di immunoprecipitazione, mentre solo circa il 2% è stato recuperato nel campione simulato. Per il controllo non metilato, il recupero è stato inferiore all'1% sia nell'immunoprecipitazione che nei campioni simulati. Dopo il sequenziamento approfondito e l'allineamento delle letture al genoma, è possibile applicare algoritmi di chiamata dei picchi per identificare le finestre statisticamente significative che sono arricchite nei campioni di immunoprecipitazione rispetto all'input.
Utilizzando i dati di sequenziamento, possiamo identificare il motivo per cui si verifica più spesso la metilazione dell'RNA e questo motivo può servire come esca per abbattere specifiche proteine leganti.
Panoramica
L'assay di immunoprecipitazione dell'RNA metilato (MeRIP) è una tecnica potente per l'arricchimento di frammenti di RNA metilati da interi trascrittomi. Questo metodo, quando combinato con il sequenziamento profondo, consente l'identificazione di trascritti che portano la modifica m 5 C.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Chimica biochimica
- Biologia molecolare
Sfondo
- MeRIP è progettato per identificare i gruppi metilati nell'RNA.
- Il metodo è adattabile a diversi organismi modello.
- Evita trattamenti chimici aggressivi, rendendolo di facile utilizzo.
- Variabili specifiche permettono la mappatura di qualsiasi modificazione dell'RNA.
Scopo dello studio
- Per arricchire i frammenti di RNA metilati.
- Per identificare trascritti con modifiche m 5 C.
- Per facilitare lo studio delle modifiche dell'RNA in vari contesti biologici.
Metodi Utilizzati
- Estrazione di RNA da tessuto vegetale utilizzando tiocianato di guanidina e fenolo acido.
- Sonicazione per frammentare l'RNA a circa 100 nucleotidi.
- Immunoprecipitazione utilizzando un anticorpo anti-M5C.
- Sequenziamento profondo dei campioni di RNA arricchiti.
Risultati principali
- Circa l'80% dei trascritti metilati è stato recuperato nel campione di immunoprecipitazione.
- Meno del 2% dei trascritti metilati è stato recuperato nel campione controllo (mock).
- I controlli non metilati hanno mostrato un recupero inferiore all'1% in entrambe le condizioni.
- Finestre statisticamente significative arricchite nei campioni di immunoprecipitazione sono state identificate mediante algoritmi di rilevamento dei picchi.
Conclusioni
- La MeRIP è un metodo efficace per lo studio della metilazione dell'RNA.
- Questa tecnica fornisce informazioni sulle modifiche dell'RNA in diversi organismi.
- Il sequenziamento profondo migliora la comprensione delle modifiche a livello del trascrittoma.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
MeRIP-seq consente la mappatura su scala trascrittoma di modifiche delle basi dell'RNA, come m5C, senza richiedere conoscenze pregresse sulla sequenza né trattamenti chimici aggressivi. Questa capacità supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nella fase iniziale di scoperta, collegando i cambiamenti epitrascrittomisti agli esiti fenotipici. Il metodo fornisce dati quantitativi e riproducibili di arricchimento che possono guidare lo sviluppo di saggi e la preparazione per lo screening di inibitori o modulatori degli enzimi che modificano l'RNA.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Analizza i paesaggi delle modifiche dell'RNA per chiarire i ruoli funzionali della m5C nella regolazione genica e nell'attività delle vie metaboliche.
- Valore operativo: Permette la riduzione del rischio biologico nei confronti di proteine leganti l'RNA o di metiltransferasi bersaglio attraverso l'arricchimento diretto dei trascritti modificati.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio correlando l'arricchimento di m5C con letture fenotipiche in sistemi rilevanti per le malattie.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera pool di RNA validati ed arricchiti per modifiche da utilizzare in saggi funzionali o di legame successivi.
- Valore operativo: Fornisce un input standardizzato e quantitativo per la normalizzazione dei saggi e la riproducibilità tra diverse campagne di screening.
- Scalabilità: Funziona con RNA frammentato proveniente da diversi sistemi modello, consentendo la validazione incrociata dei bersagli tra specie.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega le scoperte nella fase di ricerca nel campo dell'epitrascrittomica a modelli preclinici attraverso motivi di modificazione conservati.
- De-risking Meccanicistico: Riduce le regioni metilate a finestre di pochi nucleotidi, facilitando la validazione successiva con metodi a risoluzione di base.
- Allineamento del Biomarcatore: Identifica pattern di modificazione che potrebbero fungere da biomarcatori traslazionali quando correlati alla gravità fenotipica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
MeRIP-seq si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test di ipotesi mirate all'ottimizzazione dei composti promettenti, in particolare quando si sospetta che le modifiche dell'RNA siano fattori determinanti nei meccanismi di malattia o nella risposta ai farmaci.
- Biologia della scoperta: Verifica ipotesi sulla funzione delle proteine scrittrici/cancellatrici/lettore misurando i cambiamenti nei paesaggi di modificazione dell'RNA.
- Screening: Prepara frazioni di RNA modificate per l'uso in saggi di immunoprecipitazione dell'RNA, EMSA o saggi di legame al fine di valutare gli effetti dei composti sull'attività enzimatica.
- Analisi: Produce punteggi di arricchimento e chiamate di picco basati sul sequenziamento che consentono confronti quantitativi tra diverse condizioni o contesti genetici.
- Ricerca traslazionale: Collega i cambiamenti di m5C all'attività delle vie metaboliche nei modelli di malattia, quando supportati da dati fenotipici o genetici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l'analisi di qualsiasi modificazione dell'RNA con specificità dipendente da anticorpi, riducendo lo sforzo di sviluppo ripetuto.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nelle reti di regolazione dell'RNA fornendo evidenze dirette dello stato di modificazione.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso un'immunoprecipitazione standardizzata e controlli mock rigorosi.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o abbandono dei target riducendo i rischi associati a quelli i cui effetti fenotipici sono mediati da modificazioni dell'RNA.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei target aggiustata rispetto al rischio, basata sulla prevalenza delle modificazioni e sull'arricchimento funzionale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dell'RNA, nell'immunoprecipitazione e nella preparazione delle librerie per il sequenziamento.
- Presuppone l'accesso a strumentazione per la sonificazione, strumenti per la separazione magnetica e piattaforme di PCR quantitativa o di sequenziamento.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la validazione degli anticorpi, il bloccaggio delle perle e le condizioni di stringenza.
- Deve tenere conto della variabilità nell'efficienza di frammentazione dell'RNA e nell'accessibilità delle modifiche tra diversi tipi di campione.
- È limitato alla mappatura a livello di modificazione piuttosto che a risoluzione singolo nucleotide, in assenza di metodi complementari.
