Name: Quantificazione degli acidi umici e fulvici in minerali di umato, DOC, materiali umificati e prodotti commerciali contenenti sostanze umiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Scopri la quantificazione gravimetrica degli acidi umici e fulvici in campi ambientali come suoli e fertilizzanti. Questo metodo standardizzato offre maggiore precisione rispetto alle tecniche esistenti.

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Gli autori desiderano ringraziare l'Humic Products Trade Association (HPTA) per il loro sostegno nel finanziamento del lavoro che ha portato alla standardizzazione dei metodi descritti in questo documento e anche Lawrence Mayhew e i dottori Dan Olk e Paul Bloom per il supporto tecnico durante il lavoro di standardizzazione.

1. Preparazione solida del campione
<ol><li>Schiacciare circa 5 g del campione da analizzare, utilizzando un mortaio e un pestello, in modo che il 100% del campione frantumato passi attraverso una dimensione della maglia del setaccio standard degli Stati Uniti n. 200 (cioè 74 μm) assicurandosi che la polvere sia ben miscelata.</li>
	<li>Determinare gravimetricamente il contenuto di umidità della polvere.<ol>
<li>Pesare una barca di pesatura in alluminio e registrare la massa (Wwb).</li>
		<li>Trasferire circa 2 g di polvere campione nella barca di pesatura e registrare la massa (Wws + wb).</li>
		<li>Mettere la pesata in un forno di essiccazione per 24 ore a 102 °C (non superare i 102 °C). Dopo 24 ore, togliere la barca di pesatura dal forno di essiccazione e metterla in un essiccatore per raffreddare per almeno 1 ora.</li>
		<li>Pesare e registrare la massa della barca di pesatura e la polvere del campione essiccato (Wds + wb).</li>
		<li>Determinare il contenuto di umidità utilizzando la formula 1.1. Formula 1.1 Contenuto di umidità della polvere campione solida % umidità = (((Wws+wb- Wwb) – (Wds+wb - Wwb))/ (Wws+wb - Wwb)) * 100</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Procedura di estrazione
<ol><li>Campioni solidi<ol>
<li>Pesare circa 2,5 g della polvere del campione setacciato (Wsamp) in una barca di plastica o alluminio e registrare il peso a quattro cifre decimali.</li>
		<li>Caricare il campione in un cilindro graduato da 1 L e riempire il cilindro a 1 L con 0,1 M NaOH (4 g NaOH x L-1).</li>
		<li>Aggiungere una barra magnetica (ad esempio, 5 - 7 cm di lunghezza) e mescolare rapidamente (cioè 300 - 400 giri / min) su una piastra di agitazione fino a quando il campione non è completamente miscelato.</li>
		<li>Trasferire l'intero contenuto della bombola graduata in un matraccio Erlenmeyer da 1 L, evacuare lo spazio di testa del matraccio con gas N2 e coprire l'apertura del matraccio con un coperchio ermetico.</li>
		<li>Posizionare il matraccio Erlenmeyer su una piastra e mescolare a 300 - 400 giri / min per 16 - 18 ore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Campioni liquidi<ol>
<li>Per i materiali liquidi, mescolare accuratamente il campione agitando per assicurarsi che il liquido di prova sia miscelato in modo omogeneo. Assicurarsi che qualsiasi residuo che potrebbe essere caduto sul fondo del contenitore sia accuratamente miscelato.</li>
		<li>Aggiungere circa 5 g del liquido di prova, pesato con 4 cifre decimali (WTL), a un cilindro graduato da 1 L.</li>
		<li>Riempire il cilindro graduato con 0,1 M NaOH fino a un volume finale di 1 L.</li>
		<li>Aggiungere una barra magnetica (ad esempio, 5 – 7 cm di lunghezza) e mescolare rapidamente (ad esempio, 300 - 400 giri / min) su una piastra di agitazione fino a quando il campione di prova non è completamente miscelato.</li>
		<li>Trasferire la miscela in un matraccio Erlenmeyer da 1 L, evacuare lo spazio di testa con gas N2 e coprire l'apertura del matraccio con un coperchio ermetico.</li>
		<li>Posizionare il matraccio Erlenmeyer su una piastra di agitazione e mescolare a 300 - 400 giri / min per 1 ora. NOTA: Dopo questo punto, la gestione dei campioni solidi e liquidi è la stessa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Rimozione di materiali non solubili da estratti alcalini
<ol><li>Al termine dell'agitazione, rimuovere il matraccio dalla piastra di agitazione, trasferire la miscela in appositi tubi centrifughi e centrifugare l'intero volume a 4.921 x g per 30 minuti.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante alcalino contenente l'HA e il FA in un matraccio Erlenmeyer pulito da 1 L contenente una barra magnetica. Scartare il materiale insolubile. La filtrazione attraverso lana di vetro o carta da filtro qualitativa da 2,5 μm è consigliata se le particelle residue non vengono precipitate dopo la centrifugazione.</li>
</ol>4. Precipitazione e separazione di HA da FF
<ol><li>Mentre si mescola l'estratto alcalino a 300 - 400 giri / min su una piastra di agitazione, inserire una sonda di pH nella parte centrale della soluzione (verticalmente) e aggiungere conc. HCl dropwise all'estratto alcalino fino a raggiungere un pH stabile di pH 1,0 ± 0,1.</li>
	<li>Una volta raggiunto un pH di pH 1 e rimasto stabile, rimuovere la sonda di pH dal matraccio, recuperare la barra di agitazione, coprire il matraccio con un coperchio ermetico e lasciare riposare il matraccio fino a quando l'HA precipitato non si è depositato sul fondo del matraccio. NOTA: il tempo necessario a un HA per precipitare e abbandonare la soluzione varia a seconda della fonte e della quantità di HA nel campione. In genere ci vogliono 1 -6 ore perché l'HA precipiti completamente e lasci cadere la soluzione.</li>
	<li>Centrifugare l'estratto e precipitato HA a 4921 x g per 1 ora. Dopo la centrifugazione, versare il surnatante FF in un Erlenmeyer pulito da 1 L e coprire con un coperchio ermetico. NOTA: potrebbe essere necessario un tempo di centrifuga più lungo per imballare l'HA abbastanza saldamente da consentire la decantazione del FF senza includere nessuno degli HA precipitati.</li>
	<li>Posizionare i tubi della centrifuga in un forno di essiccazione tenuto a 100 °C per 24 ore.</li>
	<li>Dopo l'essiccazione, rimuovere i tubi dal forno di essiccazione e metterli in un essiccatore per raffreddare a temperatura ambiente. Dopo il raffreddamento, trasferire quantitativamente il residuo dal tubo raschiandolo dai lati e dal fondo del tubo con una spatola, trasferirlo su una barca di pesatura asfaltata e registrare la massa (WEHA). Questo residuo è il "HA estratto". NOTA: Se nella separazione di HA e FF sono stati utilizzati tubi centrifughi superiori a 50 mL, è conveniente trasferire l'HA precipitato in tubi centrifuga da 50 mL resistenti alla temperatura per il processo di essiccazione. Inoltre, se è disponibile un liofilizzatore, l'HA precipitato può essere liofilizzato. La raccolta dell'HA allo stato liofilizzato è più facile perché l'HA non si attacca al lato dei tubi di plastica e non deve essere rottamato.</li>
</ol>5. Determinazione del tenore di ceneri
NOTA: La procedura per la determinazione del contenuto di ceneri dei campioni essiccati di HA e FA è la stessa. Viene mostrata la procedura che utilizza la notazione per HA.
<ol><li>Trasferire circa 30 mg dell'HA essiccato (WHA) in una vasca di ceramica pulita e pre-pesata (WCD) che era stata precedentemente essiccata in un forno di essiccazione a 100 °C e quindi raffreddata in un essiccatore a temperatura ambiente. Dopo aver registrato la massa combinata dell'HA e della parabola pesati (WHA+CD), bruciare l'HA in un forno a muffola per 2 ore a 600°C. NOTA: per ogni campione di HA, devono essere elaborate tre repliche e il contenuto medio di ceneri utilizzato nel calcolo dell'HA puro.</li>
	<li>Dopo 2 ore, rimuovere il piatto e il contenuto dal forno a muffola e metterlo in un essiccatore per raffreddare. Una volta raffreddato, pesare il piatto con cenere (WASH+ CD) e calcolare il rapporto cenere (Ashrat) utilizzando la formula 1.2: Formula 1.2 Ashrat = (WASH+CD - WCD) / (WHA+CD - WCD)</li>
</ol>6. Determinazione della percentuale di HA estratto purificato
<ol><li>Determinare la massa finale dell'HA puro (WPHA) correggendo il contenuto di ceneri utilizzando la Formula 1.3: Formula 1.3 WPHA = WEHA * (1- Ashrat)</li>
</ol>7. Determinazione della concentrazione (%) di HA puro nel campione originale
<ol><li>Determinare la concentrazione di HA puro utilizzando le Formule 1.4 e 1.5: Formula 1.4: % ha puro in campione solido = (WPHA/Wsamp) * 100 Formula 1.5: % di HA puro in un campione liquido = (WPHA/WTL) * 100</li>
</ol>8. Preparazione della colonna per la purificazione HFA
<ol><li>Preparare una colonna per cromatografia a bassa pressione imballata con resina da polimetilmetacrilato DAX-8. Se la resina non è stata utilizzata in precedenza, immergere la resina in metanolo per 2 ore e quindi risciacquare abbondantemente con H2O deionizzato fino a rimuovere tutto il metanolo.<ol>
<li>Rimuovere le piccole particelle di resina che galleggiano sull'acqua in questo momento. Se la resina è stata utilizzata in precedenza, rigenerarla come descritto al paragrafo 10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una volta accuratamente risciacquata, versare la resina in una colonna di cromatografia in vetro 5 x 25 cm dotata di un terminale con una fritta da 10 μm per il supporto del letto di resina. Lasciare da 2,5 a 5 cm nella parte superiore della colonna per una soluzione priva di resina per consentire la miscelazione del FF prima di entrare nel letto di resina. Montare il pezzo superiore alla colonna e pompare H2O deionizzato attraverso la parte superiore della colonna per imballare il letto di resina DAX-8 utilizzando una pompa peristaltica.</li>
</ol>9. Isolamento dell'HFA
<ol><li>Una volta imballato il letto di resina, caricare l'FF sulla colonna utilizzando una pompa peristaltica, a bassa pressione, attraverso la parte superiore della colonna. Utilizzare una portata di 35 – 40 ml/min. È fondamentale che la parte superiore della resina nella colonna rimanga coperta con soluzione durante l'intera procedura di carico e risciacquo per evitare l'essiccazione della resina e la canalizzazione dell'estratto attraverso il letto di resina.</li>
	<li>Una volta che la frazione fulvica è stata completamente caricata sulla resina, lavare la resina con acqua deionizzata, per rimuovere la "frazione fulvica idrofila" (HyFF) non adsorbita pompandola attraverso la parte superiore della colonna utilizzando la pompa peristaltica a bassa pressione. Utilizzare una portata di 35 – 40 ml/min. Scartare l'effluente contenente HyFF a meno che non venga utilizzato per l'analisi.</li>
	<li>Lavare la colonna con H2O deionizzato fino a quando l'assorbanza a 350 nm dell'effluente della colonna è uguale (ad esempio, entro 0,015 unità di assorbanza) a quella dell'H2O deionizzato utilizzato per lavare la colonna. Utilizzare l'acqua deionizzata per azzerare (cioè in bianco) lo spettrofotometro.</li>
	<li>Desorbire l'HFA mediante eluizione posteriore pompando 0,1 M NaOH attraverso il fondo della colonna utilizzando la pompa peristaltica. Utilizzare una portata di 35 – 40 ml/min. Catturare l'effluente della pompa (il Na-fulvato in un contenitore pulito di dimensioni sufficienti (ad esempio, 2 L Erlenmeyer). NOTA: la maggior parte dell'HFA assorbe fino alla sommità del letto di resina DAX-8. Il desorbimento introducendo 0,1 M NaOH dalla parte inferiore della colonna riduce al minimo la quantità di 0,1 M NaOH necessaria per desorbire completamente la FA.</li>
	<li>Tutto l'HFA è stato desorbito quando l'assorbanza dell'effluente della colonna è uguale all'assorbanza di 0,1 M NaOH influente a 350 nm. Utilizzare 0,1 M NaOH come spazio vuoto spettrofotometrico. Aggiungere l'effluente prelevato per verificare l'assorbanza della soluzione FA desorbita per assicurarsi che tutto il FA venga catturato.</li>
</ol>10. De-ashing HFA mediante protonazione
<ol><li>Passare la soluzione na-fulvato, ripetutamente, per alimentazione per gravità, attraverso una resina a scambio H+ cationico forte (Table of Materials) contenuta in una colonna di 5 × 50 cm, con fritta di vetro per trattenere la resina, fino a quando la conduttività elettrica dell'effluente è <120 μS/cm, misurata con un conduttimetro elettrico. Prima di ogni passaggio, la resina di scambio H+ richiede una ristrutturazione come descritto nella Sezione 11.<ol>
<li>Per garantire che tutto il FA venga rimosso dalla resina dopo il passaggio finale, lavare la resina con acqua deionizzata fino a quando l'assorbanza dell'effluente a 350 nm è la stessa (ad esempio, entro 0,015 unità di assorbanza) dell'acqua deionizzata utilizzata per lavare la colonna. Utilizzare H2O deionizzato come spazio vuoto spettrofotometrico. Aggiungere il lavaggio e le eventuali porzioni di effluente assunte per verificare l'assorbanza alla soluzione FA purificata. Per aiutare con la rimozione di tutta la FA, la resina può essere agitata (ad esempio, usando una lunga asta di vetro o plastica) più volte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Concentrare la FA ad un volume di circa 15 ± 2 mL utilizzando un evaporatore rotante a 55 °C.</li>
	<li>Trasferire completamente il concentrato di FA da 15 mL in un tubo di centrifuga in plastica da 50 mL e asciugare a 60±3 °C a secco costante in un forno di essiccazione. La liofilizzazione è un'alternativa all'essiccazione in forno. Dopo l'asciugatura trasferire il tubo in un essiccatore per raffreddare.<ol>
<li>Rimuovere FA dal tubo raschiando i lati e il fondo del tubo con una spatola e pesare il FA raccolto su carta di pesatura pre-tarata. Questo materiale è il "Extracted FA" (WEFA).</li>
		<li>Determinare il rapporto ceneri (ASHrat) della FA estratta come descritto nella fase 6 per HA e calcolare il rapporto ceneri utilizzando la Formula 1.2. Determinare il peso della FA estratta senza ceneri (WPFA) utilizzando la Formula 1.3, sostituendo il WEFA con il peso del WEHA. Infine determinare la % di FA pura nel campione utilizzando la Formula 1.4 sostituendo WPFA con WPHA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>11. Rigenerazione della resina DAX-8
<ol><li>Rigenerare la resina DAX-8 pompando 0,1 M HCl (8,33 mL concentrato HCl/1000 mL volume finale deionizzato H2O) ad una portata di 35 – 40 mL/min attraverso il fondo della colonna fino a quando il pH dell'effluente è uguale al pH dell'influente. Utilizzare la pompa peristaltica per pompare tutti i reagenti attraverso la colonna DAX-8 durante la rigenerazione.</li>
	<li>Risciacquare la colonna con acqua DI pompandola nella parte superiore della colonna fino a quando il pH dell'effluente è uguale al pH dell'influente (cioè acqua DI).</li>
</ol>12. Rigenerazione della resina a scambio H+ -cationico
<ol><li>Rigenerare la resina a scambio cationico H+ in un processo batch versando la resina in un grande becher (ad esempio, becher di plastica da 4 L), risciacquare più volte coprendo la resina con DI H2O, mescolando e quindi versando l'acqua.</li>
	<li>Coprire la resina con 1 M HCl (83,3 mL di HCl concentrato/1000 mL di volume finale di acqua DI). Lasciare riposare per un minimo di 2 ore con agitazione occasionale (ad esempio, una volta ogni 30 minuti).</li>
	<li>Rimuovere l'acido in eccesso dalla resina versando via l'acido e coprendo la resina con acqua DI. Mescolare energicamente con un'asta di agitazione per 15 s, quindi lasciare cadere la resina sul fondo del pallone e quindi versare l'acqua. Ripetere il processo fino a quando la conduttività elettrica dell'acqua di risciacquo è ≤ 0,7 μS/cm.</li>
	<li>Caricate nuovamente la resina rigenerata nella colonna. Coprire con H2O deionizzato per assicurarsi che la resina rimanga bagnata tra un utilizzo e l'altro.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Le fasi iniziali dell'estrazione e dell'isolamento dell'HA in questo metodo sono relativamente semplici. Poiché l'isolamento dell'HFA comporta la cromatografia su colonna, l'ottenimento di risultati ripetibili comporta una stretta aderenza ai dettagli di ogni fase e pratica. In particolare, una corretta preparazione delle resine è di primaria importanza. È estremamente importante che la resina da polimetilmetacrilato DAX-8 sia preparata e imballata correttamente. Il corretto imballaggio della resina influisce sia sulla resa che sulla qualità dell'HFA. Se esiste una canalizzazione, né il pretrattamento (cioè l'acidificazione) né l'adsorbimento dell'HFA saranno completi e la separazione porterà a risultati imprecisi. Se si osservano canali o spazi nella resina prima del caricamento del campione, la colonna deve essere rimossa e agitata per ridistribuire le perle di resina, consentendo loro di depositarsi senza canali, e quindi reimballata pompando DI H2O pulito attraverso la resina. Inoltre, come indicato nel protocollo, mantenere un volume di liquido sopra la resina quando si carica la FF sulla resina, consentirà alla FF di miscelarsi prima di entrare nella resina e si tradurrà in un adsorbimento più efficace. Per la forte resina a scambio cationico H+ (Table of Materials), la rigenerazione completa non può essere affrettata. Lo scambio Na + / H + richiede tempo e quindi questo è meglio farlo in un trattamento di massa in modo che la resina possa essere miscelata mentre viene ri-acidificata. Miscelare la resina durante il risciacquo con DI H2O aiuta a rimuovere l'eccesso di HCl. Quando si solleva la resina acidificata per rimuovere l'acido in eccesso, mescolare la resina aiuta a rimuovere l'HCl. È estremamente importante rimuovere l'acido fino al punto in cui viene raggiunta una conduttività elettrica di ≤ 0,7 μS/cm. In caso contrario, l'HCl verrà riportato con l'HFA.
Infine, quando si desorbe l'HFA dalla resina DAX-8, una volta che l'assorbanza dell'influente è uguale all'assorbanza dell'effluente, è buona norma lasciare riposare la colonna per un paio d'ore per vedere se verrà rilasciato un ulteriore HFA. Se è così, sarà visto come un ingiallimento del liquido sopra la resina. Se ciò si verifica, l'HFA aggiuntivo può essere rimosso mediante continuo desorbimento fino a quando gli assorbimenti di influenza/effluente non sono di nuovo uguali.
Uno degli svantaggi dell'isolamento HFA è che l'intero processo richiede molto tempo. Il completo desorbimento dell'HFA dalla resina DAX-8 e la completa rimozione dalla resina A scambio H+ si traducono entrambi in un volume significativo di HFA che deve essere ridotto mediante evaporazione rotativa. Questo è sicuramente un collo di bottiglia nell'analisi. Nel tentativo di ridurre questo tempo, è stato suggerito di desorbire l'HFA dalla resina DAX-8 usando acetone anziché 0,1 M NaOH14. Gli autori hanno affermato che utilizzando il 50% di acetone come desorbente al posto di NaOH, è stato ottenuto un risultato HFA simile e il DAX-8 è stato adeguatamente rigenerato e quindi la fase di scambio H + potrebbe essere eliminata. Questa modifica ha comportato un tempo di analisi notevolmente ridotto a causa della diminuzione del volume prodotto e dell'evaporazione rotativa più rapida dell'acetone rispetto all'acqua. Questa modifica merita ulteriori studi.
Questo metodo è limitato all'analisi della materia organica che ha subito il processo di umificazione e, per il caso della torba e dei carboni molli, agli ulteriori processi di torba e sia alla torificazione che alla coalificazione, rispettivamente. L'umificazione è il processo per cui il materiale morto, principalmente vegetale, viene decomposto da una sequenza di microbi che consumano e modificano substrati sempre più recalcitranti. I processi abiotici partecipano anche alle reazioni di decomposizione e risintetizzazione. L'umificazione alla fine si traduce nella produzione di materiali relativamente recalcitranti che comprendono miscele eterogenee di migliaia di molecole che formano una gamma di peso molecolare e contenuti di carbonio, ossigeno e idrogeno che formano HS. Gli HS sono ulteriormente modificati dalla torificazione e dalla coalificazione. Pertanto, questo metodo non è appropriato per i materiali vegetali che sono stati modificati da processi chimici. Ad esempio, il lignosolfonato è ampiamente usato come adulterante HFA. Il lignosolfonato è un sottoprodotto del processo di polpa del solfito. Pertanto, questo materiale non è stato prodotto dal processo di umificazione. Inoltre, ci sono molte sostanze che si legano alla resina DAX-8. Ad esempio, la resina DAX-8 è stata utilizzata per assorbire pesticidi dalla soluzione15. Ovviamente, i pesticidi non sono HS. Pertanto, la legatura di un materiale alla resina DAX-8 non giustifica l'affermazione che si tratti di un HFA. I prerequisiti sono sia la produzione mediante umificazione che il legame alla resina DAX-8.
Man mano che si impara di più sul contributo dei vari componenti di HS in diverse applicazioni, può diventare vantaggioso frazionare ulteriormente HS e quindi modificare il metodo di conseguenza. Così com'è, il metodo non quantifica l'HYFA. Tuttavia, questa frazione potrebbe anche avere attività, ad esempio nella biostimolazione delle piante, dove l'intero FF viene generalmente applicato nei trattamenti agricoli piuttosto che nell'HFA purificato.

Le sostanze umiche (HS) sono residui dinamici che derivano dalla decomposizione microbica e dalla trasformazione di tessuti vegetali morti1,2,3 aumentati con sottoprodotti microbici e biomassa3,4,5 attraverso un processo che viene definito umificazione6. Gli HS sono presenti nei suoli, nelle acque naturali, nei sedimenti lacustri, nelle torbe, nei carboni molli e negli scisti umici e rappresentano circa il 25% del carbonio organico totale sulla terra7. Queste sostanze sono miscele complesse di migliaia di molecole uniche che vengono frazionate in tre frazioni principali in base alle loro diverse solubilità in soluzioni acquose fortemente basiche e acide. Queste frazioni sono acidi umici (HA), che comprendono la frazione solubile in alcali ma acido-insolubile; acidi fulvici (FA), la frazione solubile sia in alcali che in acido; e la frazione di utina, che è insolubile a tutti i valori di pH6,8. La frazione fulvica (FF) è ulteriormente suddivisa nelle frazioni idrofoba FA (HFA) e idrofila (HyFA). Queste frazioni sono definite come la parte del FF che si lega a una resina idrofoba DAX-8 (HFA) e la parte che non si lega alla resina (HyFA).
Le HS sono sempre più utilizzate in agricoltura, dove sono ampiamente utilizzate come biostimolanti delle colture, nella zootecnia, in particolare come additivo per mangimi per il bestiame, nell'estrazione mineraria nei fanghi di perforazione e nel risanamento ambientale come navette elettroniche. Anche la ricerca sull'uso dell'HS nelle applicazioni mediche umane è in aumento.
Esistono molti metodi per la quantificazione di HA e FA. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi non sono né accurati né precisi. Ad esempio, i due metodi più utilizzati per la determinazione dell'HA negli Stati Uniti sono il metodo colorimetrico9 e il metodo del California Department of Food and Agriculture (CDFA), entrambi i quali hanno dimostrato di sovrastimare la quantità di HA in una gamma di fonti di minerali ed estratti dagli Stati Uniti occidentali e dal Canada10. Il metodo colorimetrico o spettrofotometrico è impreciso perché si basa sull'assorbanza di estratti alcalini che includono, oltre a HA, FA e altri cromofori che assorbono tutti alla lunghezza d'onda utilizzata e lo standard non è rappresentativo dei materiali testati10. Il metodo CDFA non è accurato perché non fornisce concentrazioni di HA su base priva di ceneri. Poiché minerali diversi hanno quantità diverse di ceneri, alcune delle quali vengono trasportate con l'estrazione e il processo di estrazione stesso aggiunge cenere, questo metodo non fornisce un valore accurato per le concentrazioni di HA10. In risposta alla necessità di un metodo accurato e preciso, nel 2014 è stata pubblicata una procedura gravimetrica standardizzata basata su quella dettagliata di 11 per affrontare la quantificazione sia di HA che di FA su base ash free12. Questo metodo è stato poi adattato, con piccole modifiche, dall'Organizzazione internazionale per la standardizzazione (ISO) nel 2018 sotto Fertilizzanti e ammendanti come "Determinazione delle concentrazioni di acidi fulvici umici e idrofobici nei materiali fertilizzanti"13.
Questo documento delinea il protocollo per l'estrazione e la quantificazione degli acidi fulvici umici e idrofobici e fornisce dettagli sull'accuratezza e la precisione dei dati prodotti dal metodo.

<table><tbody><tr><td>Amberlite IR 120 H+-resina a scambio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10322</td><td>H+ form</td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>Ohaus</td><td>PA214</td><td>con paravento in vetro</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-14</td><td>minimo 4300 giri/min</td></tr><tr><td>Provette per centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Per adattarsi al rotore selezionato</td></tr><tr><td>Ceramica Crogioli di combustione</td><td>Sigma</td><td>Z247103</td><td></td></tr><tr><td>Colonna per cromatografia per DAX-8</td><td>Diba</td><td>Omnifit 006EZ-50-25-FF</td><td></td></tr><tr><td>Colonna per cromatografia IR 120</td><td>Chemglass</td><td>CG-1187-21 2 pollici per 24 pollici.</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore</td><td>Capitol Scientic</td><td>Kimax 21200-250</td><td>Forno</td></tr> di <tr><td>essiccazione</td><td>a vuoto Fisher Scientific</td><td>Isotemp</td><td>Precision&plusmn; 3? C</td></tr><tr><td>Misuratore di conducibilità elettrica</td><td>HM Digital</td><td>EC-3</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer Flaconi</td><td>Amazon</td><td></td><td>1L, 2L</td></tr><tr><td>HCl concentrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di agitazione magnetica</td><td>Barnstead-Thermolyne</td><td>Targhetta dati 721</td><td></td></tr><tr><td>Barre di agitazione</td><td></td><td></td> magnetiche <td>Questi possono essere ottenuti in molte prese</td></tr><tr><td>Muffola Forno</td><td>Fisher scientific</td><td>Thermolyne Tipo 47900</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>Azoto gassoso</td><td>Praxair</td><td>UNI1066</td><td>Purezza 99,99%</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Cole Parmer</td><td>Masterflex 7518-00</td><td></td></tr><tr><td>Tubo perstatico</td><td>Cole Parmer</td><td>Masterflex Pharmed 06508-17</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di pH</td><td>Oakton Strumenti</td><td>WD-35618--03</td><td></td></tr><tr><td>Evaporatore rotante</td><td>Buchi</td><td>R-210/R-215</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Sanità SCiences</td><td>Ultrospec II</td><td>Doppio fascio da 200 a 900 nm con precisione della lunghezza d'onda di &plusmn; 1 nm e riproducibilità di &plusmn; 0,5 nm.</td></tr></tbody></table>

quantificazione degli acidi umici e fulvici in minerali di umato, doc, materiali umificati e prodotti commerciali contenenti sostanze umiche

Quantification of Humic and Fulvic Acids in Humate Ores, DOC, Humified Materials and Humic Substance-Containing Commercial Products

Lo scopo di questo metodo è quello di fornire una concentrazione accurata e precisa di acidi umici (HA) e/o fulvici (FA) in carboni molli, minerali umici e scisti, torbe, compost e prodotti commerciali contenenti sostanze umiche. Il metodo si basa sull'estrazione alcalina di materiali di prova, utilizzando 0,1 N NaOH come estrattore, e sulla separazione delle sostanze umiche solubili alcaline (HS) da prodotti non solubili mediante centrifugazione. Il pH dell'estratto alcalino centrifugato viene quindi regolato a pH 1 con conc. HCl, che si traduce in precipitazione dell'HA. Gli HA precipitati vengono separati dalla frazione fulvica (FF) (la frazione di HS che rimane in soluzione) mediante centrifugazione. L'HA viene quindi cotto o liofilizzato e viene determinato il contenuto di ceneri dell'HA essiccato. Il peso dell'HA puro (cioè privo di ceneri) viene quindi diviso per il peso del campione e la frazione risultante moltiplicata per 100 per determinare la % HA nel campione. Per determinare il contenuto di FA, l'FF viene caricato su una resina idrofobica DAX-8, che assorbe la frazione FA nota anche come acido fulvico idrofobo (HFA). La restante frazione acida non fulvica, chiamata anche frazione fulvica idrofila (HyFF) viene quindi rimossa lavando la resina con H2O deionizzato fino a quando tutto il materiale non assorbito viene completamente rimosso. La FA viene quindi desorbita con 0,1 N NaOH. Il Na-fulvato risultante viene quindi protonato passandolo su una forte resina a scambio H+. Il FA risultante è cotto o liofilizzato, il contenuto di ceneri determinato e la concentrazione nel campione calcolata come descritto sopra per HA.

I dati sulle prestazioni per il metodo sono forniti nelle tabelle 1 – 5. La precisione del metodo di estrazione di HA e FAH da campioni commerciali liquidi con concentrazioni molto diverse di HA e FHA è riportata nella Tabella 1.
Le deviazioni standard relative (RSD) per HA erano inferiori a quelle per HFA, ma l'RSD HFA medio sui tre campioni liquidi era del 6,83%, il che indica un alto grado di precisione. Il rapporto di Horwitz (HorRat) è un parametro di prestazione normalizzato che indica l'idoneità di un metodo di analisi per quanto riguarda la precisione tra i laboratori. Qui è stato utilizzato per la precisione intra-laboratorio. Il valore < 0,5 può indicare una media non divulgata o un alto livello di esperienza con il metodo. I valori > 2.0 indicano l'eterogeneità dei campioni di prova, la necessità di ottimizzazione del metodo o una formazione più ampia, operando al di sotto del limite di rilevamento o un metodo inapplicabile. Per l'analisi di campioni liquidi, l'HorRat è stato > 2 solo per una delle analisi HFA (Tabella 1).
I dati di precisione per l'estrazione di HA e HFA da tre campioni di minerale umico sono riportati nella tabella 2. Anche in questo caso, ad eccezione dell'HFA estratto da Ore 2 e dell'HA di Ore 3, tutti gli HorRat erano inferiori a 2. Ciò dimostra un alto grado di precisione di questo metodo per l'estrazione di HA e HFA per campioni di minerale umico.
I produttori di biostimolanti vegetali spesso formulano prodotti che contengono HS oltre ad altri ingredienti come alghe, fertilizzanti inorganici, carboni o melassa. La tabella 3 fornisce i risultati di un'analisi dell'inclusione di questi tipi di additivi sulla precisione del metodo. Nessuno degli additivi ha effettuato in modo significativo il recupero di HA o HFA (tabella 3).
La Tabella 4 e la Tabella 5 riportano i recuperi di HA e HFA, rispettivamente, da campioni liquidi che hanno simulato prodotti commerciali con concentrazioni molto basse. I recuperi sono stati eccellenti e variavano tra l'88% e il 97% per l'HA (Tabella 4) e il 92% e il 104% per l'HFA (Tabella 5). I recuperi medi per HA e HFA sono stati rispettivamente del 93% e del 97%, mentre la % RSD per entrambi gli HS è stata inferiore al 5%. Sebbene la precisione sia eccellente, questi dati indicano la necessità di eseguire repliche di laboratorio. Il limite di rilevazione del metodo (MDL) e il limite di quantificazione del metodo erano 4,62 e 1,47 mg/L per l'HA e 4,8 e 1,53 mg/L per l'HFA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="8">Sostanze umiche, %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Materiale</td>
			<td colspan="2">L16 ·</td>
			<td colspan="2">L17 ·</td>
			<td colspan="3">L2 ·</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>HFA ·</td>
			<td>HA ·</td>
			<td>HFA ·</td>
			<td>HA ·</td>
			<td>HFA ·</td>
			<td>HA ·</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Rep 1</td>
			<td>1.44</td>
			<td>17</td>
			<td>6.59</td>
			<td>7.76</td>
			<td>0.36</td>
			<td colspan="2">4.46</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rep 2</td>
			<td>1.39</td>
			<td>16.03</td>
			<td>6.25</td>
			<td>7.79</td>
			<td>0.42</td>
			<td colspan="2">4.93</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rep 3 ·</td>
			<td>1.34</td>
			<td>16.44</td>
			<td>6.02</td>
			<td>7.55</td>
			<td>0.4</td>
			<td colspan="2">4.46</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rep 4</td>
			<td>1.54</td>
			<td>16.75</td>
			<td>6.2</td>
			<td>7.69</td>
			<td>0.33</td>
			<td colspan="2">4.53</td>
		</tr>
<tr>
<td>Significare</td>
			<td>1.43</td>
			<td>16.56</td>
			<td>6.27</td>
			<td>7.7</td>
			<td>0.38</td>
			<td colspan="2">4.6</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">SD</td>
			<td rowspan="2">0.09</td>
			<td rowspan="2">0.42</td>
			<td>0</td>
			<td rowspan="2">0.11</td>
			<td rowspan="2">0.04</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">0.23</td>
		</tr>
<tr>
<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>RSD, %</td>
			<td>6.29</td>
			<td>2.53</td>
			<td>3.8</td>
			<td>1.39</td>
			<td>10.4</td>
			<td colspan="2">4.91</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hor Rat(r)</td>
			<td>1.58</td>
			<td>0.72</td>
			<td>1.25</td>
			<td>0.47</td>
			<td>2.31</td>
			<td colspan="2">1.55</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">
un Le condizioni di estrazione erano 1 g in 1 L 0,1 M NaOH.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Precisione del metodo nell'estrazione e quantificazione di HA e HFA da campioni commerciali liquidi. Le condizioni di estrazione erano 1 g in 1 L 0,1 M NaOH.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="7">Sostanze umiche, %</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Minerale 1</td>
			<td colspan="2">Minerale 2</td>
			<td colspan="2">Ore 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Materiale</td>
			<td>HFA ·</td>
			<td>HA ·</td>
			<td>HFA ·</td>
			<td>HA ·</td>
			<td>HFA ·</td>
			<td>HA ·</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rep 1</td>
			<td>1.75</td>
			<td>67.4</td>
			<td>1.31</td>
			<td>27.01</td>
			<td>1.55</td>
			<td>8.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rep 2</td>
			<td>1.69</td>
			<td>67.63</td>
			<td>1.25</td>
			<td>27.48</td>
			<td>1.41</td>
			<td>7.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rep 3 ·</td>
			<td>1.63</td>
			<td>67.1</td>
			<td>1.27</td>
			<td>27.34</td>
			<td>1.47</td>
			<td>8.35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rep 4</td>
			<td>1.77</td>
			<td>67.59</td>
			<td>1.55</td>
			<td>26.89</td>
			<td>1.51</td>
			<td>7.98</td>
		</tr>
<tr>
<td>Significare</td>
			<td>1.71</td>
			<td>67.53</td>
			<td>1.35</td>
			<td>27.18</td>
			<td>1.49</td>
			<td>8.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.94</td>
			<td>0.14</td>
			<td>0.28</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.73</td>
		</tr>
<tr>
<td>RSD, %</td>
			<td>3.7</td>
			<td>1.39</td>
			<td>10.33</td>
			<td>1.02</td>
			<td>4.02</td>
			<td>9.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>HorRat(r)</td>
			<td>0.99</td>
			<td>0.66</td>
			<td>2.71</td>
			<td>0.42</td>
			<td>1.07</td>
			<td>3.09</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2. Precisione del metodo di estrazione e quantificazione di HA e HFA da minerali umici. Le condizioni di estrazione erano 1 g di campione in 1 L 0,1 M NaOH. (Dati tratti da Lamar et al., 2014)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Replicare</td>
			<td>Adulterante</td>
			<td>HA, %</td>
			<td>FA, %</td>
			<td>Recupero relativo HA, %</td>
			<td>Recupero relativo HFA, %</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Nessuno</td>
			<td>81.61</td>
			<td>12.86</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Nessuno</td>
			<td>80.16</td>
			<td>12.78</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Alga</td>
			<td>80.21</td>
			<td>12.85</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Alga</td>
			<td>80.72</td>
			<td>12.79</td>
			<td>99.5</td>
			<td>99.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Fertilizzante</td>
			<td>80.25</td>
			<td>12.98</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Fertilizzante</td>
			<td>79.57</td>
			<td>123.77</td>
			<td>98.8</td>
			<td>101.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Carbone</td>
			<td>78.79</td>
			<td>12.92</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Carbone</td>
			<td>81.27</td>
			<td>12.84</td>
			<td>98.9</td>
			<td>101.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Melassa</td>
			<td>79.38</td>
			<td>12.99</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Melassa</td>
			<td>81.02</td>
			<td>12.72</td>
			<td>99.2</td>
			<td>100.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Significare</td>
			<td></td>
			<td>80.3</td>
			<td>12.85</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SD</td>
			<td></td>
			<td>0.885</td>
			<td>0.09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">
una concentrazione finale di FA + HA di 2,5 g/L aggiunta a 0,1 M NaOH. (dati tratti da Lamar et al., 2015)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3. Effetto degli adulteranti sulla quantificazione di HA e HFA da una leonardite gascoyne. (Dati tratti da Lamar et al., 2015)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">HA ·</td>
		</tr>
<tr>
<td>ID di esempio</td>
			<td>Estratto, mg</td>
			<td>Recuperato, mg</td>
			<td>Recuperato, %</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>24.6</td>
			<td>23.7</td>
			<td>96.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>22.6</td>
			<td>19.9</td>
			<td>88.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>25.2</td>
			<td>23.6</td>
			<td>93.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>22.5</td>
			<td>21.5</td>
			<td>95.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>23.9</td>
			<td>21.8</td>
			<td>91.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>23.2</td>
			<td>20.8</td>
			<td>89.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>24</td>
			<td>23.2</td>
			<td>96.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Significare</td>
			<td>23.7</td>
			<td>22.1</td>
			<td>93</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD</td>
			<td>1.01</td>
			<td>1.52</td>
			<td>3.43</td>
		</tr>
<tr>
<td>RSD, %</td>
			<td>4.35</td>
			<td>6.88</td>
			<td>3.67</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">(dati tratti da Lamar et al., 2014)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 4. Recupero di HA da spazi vuoti chiodati. (Dati tratti da Lamar et al., 2014)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">FA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ID di esempio</td>
			<td>Estratto, mg</td>
			<td>Recuperato, mg</td>
			<td>Recuperato, %</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>19.9</td>
			<td>19</td>
			<td>95.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>23.1</td>
			<td>22.9</td>
			<td>99.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>20.7</td>
			<td>19.4</td>
			<td>93.72</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>20.5</td>
			<td>19.8</td>
			<td>96.39</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>20.8</td>
			<td>21.6</td>
			<td>103.85</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>21.9</td>
			<td>20.1</td>
			<td>91.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>22.7</td>
			<td>22.3</td>
			<td>98.24</td>
		</tr>
<tr>
<td>Significare</td>
			<td>21.37</td>
			<td>20.73</td>
			<td>96.94</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD</td>
			<td>1.21</td>
			<td>1.53</td>
			<td>3.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>RSD, %</td>
			<td>5.64</td>
			<td>7.36</td>
			<td>4.07</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">(Dati tratti da Lamar et al., 2014)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 5. Recupero di HFA da spazi vuoti chiodati. (Dati tratti da Lamar et al., 2014)

Questo metodo fornisce una quantificazione gravimetrica di sostanze umiche (ad esempio, acidi umico e fulvico) su base priva di ceneri, in materiali secchi e liquidi da carboni molli (cioè lignite ossidata e non ossidata e carbone sub-bituminoso), minerali e scisti umato, torbe, compost e fertilizzanti commerciali e modifiche del suolo.

Quantificazione degli acidi umici e fulvici in minerali di umato, DOC, materiali umificati e prodotti commerciali contenenti sostanze umiche

The purpose of this method is to provide an accurate and precise concentration of humic (HA) and/or fulvic acids (FA) in soft coals, humic ores and ...

Il nuovo metodo standard per la quantificazione degli acidi umici fornisce un'analisi più accurata e precisa rispetto ai metodi esistenti accettati dal regolatore e fornisce anche un metodo standard per la quantificazione dell'acido fulvico idrofobico puro. Il vantaggio di questo protocollo è che fornisce un'analisi gravimetrica delle concentrazioni di acido fulvico umico e idrofobico su base priva di ceneri e il processo di estrazione è stato ottimizzato per ottenere i più alti recuperi di acidi umici e fulvici da campioni. A dimostrare la procedura sarà Ryan Fountain, un chimico analitico del nostro laboratorio di chimica umica.Per preparare un campione solido, utilizzare un mortaio e un pestello per schiacciare circa cinque grammi del campione da analizzare fino a quando il 100% del campione ben miscelato può passare attraverso un setaccio standard degli Stati Uniti, numero di maglia 200. Per determinare gravimetricamente il contenuto di umidità della polvere, trasferire circa due grammi della polvere campione in una barca di pesatura in alluminio pre-pesata e registrare la massa della barca e del campione. Quindi, posizionare la barca di pesatura in un forno di essiccazione a 102 gradi Celsius per 24 ore.Il giorno successivo, posizionare la barca in un essiccatore per raffreddare per almeno un'ora prima di pesare e registrare la massa della barca di pesatura e del campione essiccato, quindi utilizzare la formula per determinare il contenuto di umidità come indicato. Per eseguire un'estrazione da un campione solido, pesare circa 2,5 grammi del campione rimanente e registrare il peso a quattro cifre decimali. Quindi, caricare il campione in un pallone Erlenmeyer da un litro e sciacquare la pesata con acqua deionizzata per rimuovere tutto il minerale.Riempire il becher a un litro con idrossido di sodio 0,1 molare e aggiungere una barra magnetica da cinque a sette centimetri per facilitare una rapida agitazione del campione a 300-400 giri al minuto su una piastra di agitazione. Quando il campione è stato accuratamente miscelato, evacuare lo spazio di testa del pallone con gas azoto, quindi sigillare l'apertura del matraccio con un coperchio ermetico e posizionare il matraccio su una piastra di agitazione per la miscelazione a 300-400 giri al minuto per 16-18 ore. Per l'estrazione di materiale liquido, agitare accuratamente il campione per assicurarsi che il liquido di prova sia miscelato in modo omogeneo, compresi eventuali residui che potrebbero essere caduti sul fondo del contenitore.Pesare circa cinque grammi del liquido di prova e registrare il peso con quattro cifre decimali. Quindi, aggiungere il liquido a un cilindro graduato da un litro e riempire il cilindro con idrossido di sodio 0,1 molare fino a un volume finale di un litro. Utilizzare una barra di agitazione magnetica per mescolare rapidamente il campione come dimostrato fino a quando il campione di prova non è completamente miscelato prima di trasferire la miscela in un matraccio Erlenmeyer da un litro, quindi evacuare lo spazio di testa con azoto gassoso e mescolare il contenuto del pallone a 300 400 giri al minuto per un'ora, come dimostrato.Per rimuovere i materiali non solubili dagli estratti alcalini, al termine dell'incubazione di agitazione, trasferire la miscela in apposite provette centrifughe e centrifugare l'intero volume del campione a 4.921x G per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, raccogliere il surnatante alcalino contenente l'acido umico e la frazione fulvica, che contiene l'acido fulvico idrofobo, in un matraccio Erlenmeyer pulito da un litro con una barra magnetica. Per la precipitazione dell'acido umico dalla frazione fulvica, mentre si agita l'estratto alcalino raccolto a 300-400 giri al minuto su una piastra di agitazione, inserire una sonda di pH nella parte centrale della soluzione e aggiungere acido cloridrico concentrato fino a raggiungere un pH stabile di pH 1,0 più o meno 0,1.Una volta che il pH è stabile, rimuovere la sonda e mescolare la barra, sciacquarli con acqua deionizzata e sigillare il pallone con un coperchio ermetico. Lasciare riposare il matraccio da una a sei ore fino a quando l'acido umico precipitato si è depositato sul fondo prima di centrifugare l'estratto e precipitare l'acido umico a 4.921x G per un'ora. Al termine della centrifugazione, versare i supernatanti contenenti frazione fulvica in un matraccio Erlenmeyer pulito da un litro e sigillare il matraccio con un coperchio ermetico.Posizionare i tubi della centrifuga contenenti acido umico in un forno di essiccazione a 100 gradi Celsius per 24 ore e assicurarsi che i coperchi siano allentati o rimossi per garantire l'asciugatura. Dopo l'essiccazione, raffreddare i tubi in un essiccatore fino a raggiungere la temperatura ambiente. Dopo il raffreddamento, utilizzare una spatola per trasferire il residuo da ciascun tubo in una singola barca di pesatura tarata per determinare la massa del campione di acido umico estratto.Per determinare il contenuto di ceneri all'interno del campione, trasferire circa 30 milligrammi di acido umico essiccato in un piatto di ceramica pulito e pre-pesato per determinare la massa del campione di pesatura e del piatto. Quindi, bruciare l'acido umico in un forno a muffola per due ore a 600 gradi Celsius prima di raffreddare il piatto nell'essiccatore. Una volta raffreddato, pesare il piatto e utilizzare la formula per calcolare il rapporto cenere.Per determinare la massa finale dell'acido umico puro, utilizzare la formula per correggere il contenuto di ceneri. Quindi utilizzare le formule per determinare la concentrazione di acido umico puro. Per preparare una nuova colonna per cromatografia in polimetilmetacrilato DAX8 a bassa pressione, immergere la resina nel metanolo per due ore in un becher prima di risciacquare accuratamente la resina con acqua deionizzata fino a quando tutto il metanolo non viene rimosso.Quindi rimuovere eventuali piccole particelle di resina che galleggiano sull'acqua. Una volta accuratamente risciacquata, versare la resina risciacquata o rigenerata in una colonna di cromatografia in vetro di 5 per 25 centimetri dotata di un terminale con una fritta da 10 micron per il supporto del letto di resina, lasciando da 2,5 a 5 centimetri nella parte superiore della colonna e sostituire il pezzo superiore sulla colonna. Per rinnovare una resina utilizzata in precedenza o preparare una nuova resina appena lavata, utilizzare la pompa peristaltica per pompare acido cloridrico 0,1 molare a una portata da 35 a 40 millilitri attraverso il fondo della colonna fino a quando il pH dell'effluente è uguale al pH dell'influente, quindi pompare acqua deionizzata nella parte superiore della colonna fino a quando il pH dell'effluente è uguale al pH dell'influente.Una volta imballato il letto di resina, utilizzare una pompa peristaltica per caricare la frazione fulvica sulla colonna a bassa pressione attraverso la parte superiore della colonna a una portata da 35 a 40 millilitri. Una volta che la frazione fulvica è stata completamente caricata sulla resina, lavare la resina con acqua deionizzata per rimuovere la frazione fulvica idrofila non adsorbita. Lavare la colonna con acqua deionizzata fino a quando l'assorbanza dell'effluente della colonna a 350 nanometri è uguale a quella dell'acqua deionizzata utilizzata per lavare la colonna.Per desorbire l'HFA, pompare idrossido di sodio 0,1 molare attraverso il fondo della colonna e catturare l'effluente di fulvato di sodio della pompa in un contenitore pulito e di dimensioni sufficienti. Tutto l'HFA è stato desorbito quando l'assorbanza dell'effluente della colonna è uguale all'assorbanza dell'idrossido di sodio 0,1-molare influente a 350 nanometri. Per de-cenere l'HFA mediante protonazione, versare prima la resina a scambio protonico/cationico in un grande becher e coprire e mescolare la resina con acqua deionizzata fresca più volte, versando l'acqua dopo ogni risciacquo fino a quando il colore rosso non è stato completamente rimosso.Dopo l'ultimo lavaggio, coprire la resina con un acido cloridrico molare e lasciare riposare la miscela per almeno due ore, mescolando ogni 30 minuti. Al termine del trattamento di acidificazione, sostituire l'acido con acqua deionizzata e mescolare energicamente con un'asta di agitazione per 15 secondi prima di lasciare cadere la resina sul fondo del pallone e versare l'acqua. Ripetere il processo fino a quando la conduttività elettrica dell'acqua di risciacquo è inferiore o uguale a 0,7 microSiemens per centimetro e caricare la resina rigenerata in una colonna di 5 per 50 centimetri con una fritta di vetro per trattenere la resina.Quindi, coprire la resina con acqua deionizzata fresca e passare ripetutamente il fulvato di sodio attraverso il forte catione / resina scambiata con protoni mediante alimentazione per gravità fino a quando la conduttività elettrica dell'effluente è inferiore a 120 microSiemens per centimetro. Per garantire che tutta la FA venga rimossa dalla resina, dopo il passaggio finale, lavare la resina con acqua deionizzata fino a quando l'assorbanza dell'effluente a 350 nanometri è la stessa dell'acqua deionizzata utilizzata per lavare la colonna. Aggiungere il lavaggio e l'eventuale effluente utilizzato per verificare l'assorbanza alla soluzione FA purificata.Per aiutare con la rimozione della FA, la resina può essere agitata più volte. Utilizzare un evaporatore rotativo a 55 gradi Celsius per concentrare il FA a un volume di circa 15 più o meno due millilitri e trasferire completamente l'intero volume di concentrato fa in un tubo di centrifuga in plastica da 50 millilitri. Asciugare il campione a 60 più o meno tre gradi Celsius per una secchezza costante nel forno di essiccazione e trasferire il tubo all'essiccatore per raffreddare.Quando il campione si è raffreddato, utilizzare una spatola per raschiare la FA estratta su un pezzo di carta di pesatura pre-pesata e determinare il rapporto ceneri, il peso FA estratto e la percentuale di FA puro nel campione originale, come dimostrato per l'acido umico. In questa tabella vengono mostrati i dati di precisione per il metodo di estrazione di HA e HFA da campioni commerciali liquidi con concentrazioni molto diverse di HA e HFA. La deviazione standard residua per l'HA era inferiore a quella per l'HFA, ma la deviazione standard residua media dell'HFA su tre campioni liquidi era del 6,83%, indicando un alto grado di precisione.Anche il rapporto di Horowitz era maggiore di due per una sola delle analisi HFA. In questa tabella vengono mostrati i dati di precisione per l'estrazione di HA e HFA da tre campioni di minerale umico. Analogamente all'analisi precedente, ad eccezione dell'HFA estratto dal minerale due e dell'HA dal minerale tre, tutti i rapporti di Horowitz erano inferiori a due, dimostrando l'alto grado di precisione di questo metodo per l'estrazione di HA e HFA da campioni di minerale umico.In questa analisi, non sono stati osservati additivi biostimolanti vegetali per influenzare in modo significativo il recupero di HA o HFA. In queste tabelle vengono mostrati i recuperi di HA e HFA da campioni liquidi che hanno stimolato prodotti commerciali con concentrazioni molto basse. I recuperi sono stati eccellenti, oscillando tra l'88% e il 97% per l'HA e il 92% e il 104% per l'HFA, ma indicando anche la necessità di eseguire repliche di laboratorio.Seguendo questa procedura, gli acidi umici e fulvici secchi ottenuti possono essere utilizzati per scopi di caratterizzazione, come il carbonio-13 e la risonanza elettronica NMR protonica e la spettrometria di massa ad altissima risoluzione, tra le altre tecniche utili. E questo può essere utilizzato per la caratterizzazione della chimica dell'humus, nonché strumento utile per scavare in profondità nella relazione struttura-attività con il plant fitness e i meccanismi di difesa delle piante sottostanti.

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Quantificazione degli acidi umici e fulvici in minerali di umato, DOC, materiali umificati e prodotti commerciali contenenti sostanze umiche (Video) | JoVE Journal

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