Quantificazione degli acidi umici e fulvici in minerali di umato, DOC, materiali umificati e prodotti commerciali contenenti sostanze umiche

Il nuovo metodo standard per la quantificazione degli acidi umici fornisce un'analisi più accurata e precisa rispetto ai metodi esistenti accettati dal regolatore e fornisce anche un metodo standard per la quantificazione dell'acido fulvico idrofobico puro. Il vantaggio di questo protocollo è che fornisce un'analisi gravimetrica delle concentrazioni di acido fulvico umico e idrofobico su base priva di ceneri e il processo di estrazione è stato ottimizzato per ottenere i più alti recuperi di acidi umici e fulvici da campioni. A dimostrare la procedura sarà Ryan Fountain, un chimico analitico del nostro laboratorio di chimica umica.

Per preparare un campione solido, utilizzare un mortaio e un pestello per schiacciare circa cinque grammi del campione da analizzare fino a quando il 100% del campione ben miscelato può passare attraverso un setaccio standard degli Stati Uniti, numero di maglia 200. Per determinare gravimetricamente il contenuto di umidità della polvere, trasferire circa due grammi della polvere campione in una barca di pesatura in alluminio pre-pesata e registrare la massa della barca e del campione. Quindi, posizionare la barca di pesatura in un forno di essiccazione a 102 gradi Celsius per 24 ore.

Il giorno successivo, posizionare la barca in un essiccatore per raffreddare per almeno un'ora prima di pesare e registrare la massa della barca di pesatura e del campione essiccato, quindi utilizzare la formula per determinare il contenuto di umidità come indicato. Per eseguire un'estrazione da un campione solido, pesare circa 2,5 grammi del campione rimanente e registrare il peso a quattro cifre decimali. Quindi, caricare il campione in un pallone Erlenmeyer da un litro e sciacquare la pesata con acqua deionizzata per rimuovere tutto il minerale.

Riempire il becher a un litro con idrossido di sodio 0,1 molare e aggiungere una barra magnetica da cinque a sette centimetri per facilitare una rapida agitazione del campione a 300-400 giri al minuto su una piastra di agitazione. Quando il campione è stato accuratamente miscelato, evacuare lo spazio di testa del pallone con gas azoto, quindi sigillare l'apertura del matraccio con un coperchio ermetico e posizionare il matraccio su una piastra di agitazione per la miscelazione a 300-400 giri al minuto per 16-18 ore. Per l'estrazione di materiale liquido, agitare accuratamente il campione per assicurarsi che il liquido di prova sia miscelato in modo omogeneo, compresi eventuali residui che potrebbero essere caduti sul fondo del contenitore.

Pesare circa cinque grammi del liquido di prova e registrare il peso con quattro cifre decimali. Quindi, aggiungere il liquido a un cilindro graduato da un litro e riempire il cilindro con idrossido di sodio 0,1 molare fino a un volume finale di un litro. Utilizzare una barra di agitazione magnetica per mescolare rapidamente il campione come dimostrato fino a quando il campione di prova non è completamente miscelato prima di trasferire la miscela in un matraccio Erlenmeyer da un litro, quindi evacuare lo spazio di testa con azoto gassoso e mescolare il contenuto del pallone a 300 400 giri al minuto per un'ora, come dimostrato.

Per rimuovere i materiali non solubili dagli estratti alcalini, al termine dell'incubazione di agitazione, trasferire la miscela in apposite provette centrifughe e centrifugare l'intero volume del campione a 4.921x G per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, raccogliere il surnatante alcalino contenente l'acido umico e la frazione fulvica, che contiene l'acido fulvico idrofobo, in un matraccio Erlenmeyer pulito da un litro con una barra magnetica. Per la precipitazione dell'acido umico dalla frazione fulvica, mentre si agita l'estratto alcalino raccolto a 300-400 giri al minuto su una piastra di agitazione, inserire una sonda di pH nella parte centrale della soluzione e aggiungere acido cloridrico concentrato fino a raggiungere un pH stabile di pH 1,0 più o meno 0,1.

Una volta che il pH è stabile, rimuovere la sonda e mescolare la barra, sciacquarli con acqua deionizzata e sigillare il pallone con un coperchio ermetico. Lasciare riposare il matraccio da una a sei ore fino a quando l'acido umico precipitato si è depositato sul fondo prima di centrifugare l'estratto e precipitare l'acido umico a 4.921x G per un'ora. Al termine della centrifugazione, versare i supernatanti contenenti frazione fulvica in un matraccio Erlenmeyer pulito da un litro e sigillare il matraccio con un coperchio ermetico.

Posizionare i tubi della centrifuga contenenti acido umico in un forno di essiccazione a 100 gradi Celsius per 24 ore e assicurarsi che i coperchi siano allentati o rimossi per garantire l'asciugatura. Dopo l'essiccazione, raffreddare i tubi in un essiccatore fino a raggiungere la temperatura ambiente. Dopo il raffreddamento, utilizzare una spatola per trasferire il residuo da ciascun tubo in una singola barca di pesatura tarata per determinare la massa del campione di acido umico estratto.

Per determinare il contenuto di ceneri all'interno del campione, trasferire circa 30 milligrammi di acido umico essiccato in un piatto di ceramica pulito e pre-pesato per determinare la massa del campione di pesatura e del piatto. Quindi, bruciare l'acido umico in un forno a muffola per due ore a 600 gradi Celsius prima di raffreddare il piatto nell'essiccatore. Una volta raffreddato, pesare il piatto e utilizzare la formula per calcolare il rapporto cenere.

Per determinare la massa finale dell'acido umico puro, utilizzare la formula per correggere il contenuto di ceneri. Quindi utilizzare le formule per determinare la concentrazione di acido umico puro. Per preparare una nuova colonna per cromatografia in polimetilmetacrilato DAX8 a bassa pressione, immergere la resina nel metanolo per due ore in un becher prima di risciacquare accuratamente la resina con acqua deionizzata fino a quando tutto il metanolo non viene rimosso.

Quindi rimuovere eventuali piccole particelle di resina che galleggiano sull'acqua. Una volta accuratamente risciacquata, versare la resina risciacquata o rigenerata in una colonna di cromatografia in vetro di 5 per 25 centimetri dotata di un terminale con una fritta da 10 micron per il supporto del letto di resina, lasciando da 2,5 a 5 centimetri nella parte superiore della colonna e sostituire il pezzo superiore sulla colonna. Per rinnovare una resina utilizzata in precedenza o preparare una nuova resina appena lavata, utilizzare la pompa peristaltica per pompare acido cloridrico 0,1 molare a una portata da 35 a 40 millilitri attraverso il fondo della colonna fino a quando il pH dell'effluente è uguale al pH dell'influente, quindi pompare acqua deionizzata nella parte superiore della colonna fino a quando il pH dell'effluente è uguale al pH dell'influente.

Una volta imballato il letto di resina, utilizzare una pompa peristaltica per caricare la frazione fulvica sulla colonna a bassa pressione attraverso la parte superiore della colonna a una portata da 35 a 40 millilitri. Una volta che la frazione fulvica è stata completamente caricata sulla resina, lavare la resina con acqua deionizzata per rimuovere la frazione fulvica idrofila non adsorbita. Lavare la colonna con acqua deionizzata fino a quando l'assorbanza dell'effluente della colonna a 350 nanometri è uguale a quella dell'acqua deionizzata utilizzata per lavare la colonna.

Per desorbire l'HFA, pompare idrossido di sodio 0,1 molare attraverso il fondo della colonna e catturare l'effluente di fulvato di sodio della pompa in un contenitore pulito e di dimensioni sufficienti. Tutto l'HFA è stato desorbito quando l'assorbanza dell'effluente della colonna è uguale all'assorbanza dell'idrossido di sodio 0,1-molare influente a 350 nanometri. Per de-cenere l'HFA mediante protonazione, versare prima la resina a scambio protonico/cationico in un grande becher e coprire e mescolare la resina con acqua deionizzata fresca più volte, versando l'acqua dopo ogni risciacquo fino a quando il colore rosso non è stato completamente rimosso.

Dopo l'ultimo lavaggio, coprire la resina con un acido cloridrico molare e lasciare riposare la miscela per almeno due ore, mescolando ogni 30 minuti. Al termine del trattamento di acidificazione, sostituire l'acido con acqua deionizzata e mescolare energicamente con un'asta di agitazione per 15 secondi prima di lasciare cadere la resina sul fondo del pallone e versare l'acqua. Ripetere il processo fino a quando la conduttività elettrica dell'acqua di risciacquo è inferiore o uguale a 0,7 microSiemens per centimetro e caricare la resina rigenerata in una colonna di 5 per 50 centimetri con una fritta di vetro per trattenere la resina.

Quindi, coprire la resina con acqua deionizzata fresca e passare ripetutamente il fulvato di sodio attraverso il forte catione / resina scambiata con protoni mediante alimentazione per gravità fino a quando la conduttività elettrica dell'effluente è inferiore a 120 microSiemens per centimetro. Per garantire che tutta la FA venga rimossa dalla resina, dopo il passaggio finale, lavare la resina con acqua deionizzata fino a quando l'assorbanza dell'effluente a 350 nanometri è la stessa dell'acqua deionizzata utilizzata per lavare la colonna. Aggiungere il lavaggio e l'eventuale effluente utilizzato per verificare l'assorbanza alla soluzione FA purificata.

Per aiutare con la rimozione della FA, la resina può essere agitata più volte. Utilizzare un evaporatore rotativo a 55 gradi Celsius per concentrare il FA a un volume di circa 15 più o meno due millilitri e trasferire completamente l'intero volume di concentrato fa in un tubo di centrifuga in plastica da 50 millilitri. Asciugare il campione a 60 più o meno tre gradi Celsius per una secchezza costante nel forno di essiccazione e trasferire il tubo all'essiccatore per raffreddare.

Quando il campione si è raffreddato, utilizzare una spatola per raschiare la FA estratta su un pezzo di carta di pesatura pre-pesata e determinare il rapporto ceneri, il peso FA estratto e la percentuale di FA puro nel campione originale, come dimostrato per l'acido umico. In questa tabella vengono mostrati i dati di precisione per il metodo di estrazione di HA e HFA da campioni commerciali liquidi con concentrazioni molto diverse di HA e HFA. La deviazione standard residua per l'HA era inferiore a quella per l'HFA, ma la deviazione standard residua media dell'HFA su tre campioni liquidi era del 6,83%, indicando un alto grado di precisione.

Anche il rapporto di Horowitz era maggiore di due per una sola delle analisi HFA. In questa tabella vengono mostrati i dati di precisione per l'estrazione di HA e HFA da tre campioni di minerale umico. Analogamente all'analisi precedente, ad eccezione dell'HFA estratto dal minerale due e dell'HA dal minerale tre, tutti i rapporti di Horowitz erano inferiori a due, dimostrando l'alto grado di precisione di questo metodo per l'estrazione di HA e HFA da campioni di minerale umico.

In questa analisi, non sono stati osservati additivi biostimolanti vegetali per influenzare in modo significativo il recupero di HA o HFA. In queste tabelle vengono mostrati i recuperi di HA e HFA da campioni liquidi che hanno stimolato prodotti commerciali con concentrazioni molto basse. I recuperi sono stati eccellenti, oscillando tra l'88% e il 97% per l'HA e il 92% e il 104% per l'HFA, ma indicando anche la necessità di eseguire repliche di laboratorio.

Seguendo questa procedura, gli acidi umici e fulvici secchi ottenuti possono essere utilizzati per scopi di caratterizzazione, come il carbonio-13 e la risonanza elettronica NMR protonica e la spettrometria di massa ad altissima risoluzione, tra le altre tecniche utili. E questo può essere utilizzato per la caratterizzazione della chimica dell'humus, nonché strumento utile per scavare in profondità nella relazione struttura-attività con il plant fitness e i meccanismi di difesa delle piante sottostanti.