Analisi cinetica ad alta velocità ad alto rendimento parallela per cleavage del DNA specifico del sito

Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi processo che si traduce in rotture di DNA a doppio filamento, fornisce dati quantitativi dettagliati sulla cinetica. Sebbene questo metodo abbia una risoluzione a singola molecola, misura fino a 1000 DNA in un singolo esperimento, fornendo così buone statistiche. L'applicazione primaria di questo metodo è studiare i meccanismi coinvolti nel legame e nella modifica del DNA.

Ad esempio, siamo interessati a studiare la ricerca del bersaglio del DNA, che è rilevante per tutte le proteine leganti il DNA. Quando si tenta questa tecnica per la prima volta, ricorda che i tether a singola molecola sono delicati e, una volta che si formano, devono essere maneggiati con cura. La giusta proporzione di superfici funzionalizzate è essenziale.

Ci sono alcuni trucchi per rendere il flusso così. Oltre a cambiare i tubi campione durante la raccolta dei dati, la dimostrazione visiva può aiutare qualcuno che non ha bisogno di questa procedura. Per lavare i coperchi, metterli in barattoli di colorazione e sonicarli con etanolo per 30 minuti.

Sciacquarli accuratamente con acqua deionizzata e distillata, quindi immergerli in un idrossido di potassio molare e sonicarli per altri 30 minuti. Ripetere la sequenza di lavaggio, assicurandosi di risciacquare il coperchio scivola con acqua dopo ogni lavaggio. Conservare le foglietti di copertura puliti in barattoli di colorazione con acqua.

Utilizzare un rasoio pulito per tagliare tubi di carico e uscita lunghi otto centimetri e inserirli in fori in uno scivolo di vetro pulito. Epossidico il tubo e lasciare curare per cinque minuti per fissarlo. Applicare il nastro a doppia lato pretagliato con il motivo del canale sui vetrini e lisciarlo con forcep di plastica per ottenere una buona tenuta.

Staccare il supporto dal nastro e applicare uno scivolo di copertura pulito, levigarlo con le forcep. Quindi, epossidico il bordo del coperchio scivolare per sigillare la cellula di flusso e lasciarla curare. Preparare il DNA etichettato per il tethering eseguendo la PCR secondo le indicazioni manoscritte.

Quindi purificare il prodotto PCR con un kit di pulizia PCR. Preparare 10 millilitri di tampone A e degasarlo in un essiccatore sottovuoto per almeno un'ora. Per funzionalizzare la cella di flusso, iniettare 25 microlitri di frammenti anti-digoxigenina e fab in PBS, nel canale di flusso, utilizzando una punta di caricamento del gel per adattarsi ai tubi PE60.

Incubare la cella di flusso a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo l'incubazione, tirare 0,5 millilitri di tampone A attraverso il canale con una siringa, facendo attenzione a non introdurre aria nel canale. Quindi, montagna la cella di flusso su un microscopio invertito.

Collegare il tubo di uscita a una pompa per siringhe e mettere il tubo di ingresso in un tubo di micro centrifuga contenente tampone A.Estrarre manualmente almeno 0,5 millilitri di tampone A per lavare il sistema e innescare la pompa. Quindi lasciare funzionare la pompa a 10 microlitri al minuto per almeno cinque minuti per equilibrare il sistema. Vortice la bottiglia stock di perline, e pipetta 1.6 microlitri delle perline in 50 microlitri di tampone A, quindi vortice di nuovo.

Posizionare le perline su un separatore magnetico e pipettare il tampone. Sospenderli in 50 microlitri del tampone A e vortice. Dopo l'ultimo lavaggio, sospendere di nuovo le perline in 100 microlitri del tampone A per una concentrazione finale di 160 microgrammi per millilitro.

Preparare 480 microlitri di substrato di DNA etichettato con etichetta 0,5 picomolare nel tampone A e pipettare 20 microlitri di sospensione del tallone nel DNA diluito. Posizionare la miscela su un rotatore per tre minuti. Dopo i tre minuti, caricare immediatamente il campione nel canale con una portata di 10 microlitri al minuto per 15 minuti o fino a quando non si osserva un sufficiente tethering del tallone.

Lavare il canale di tutte le perline libere passando il tubo di ingresso a un tubo fresco di tampone A e fluendolo a 50 microlitri al minuto per almeno 10 minuti o fino a quando non si osservano perline allentate. Ed è utile utilizzare una valvola in linea per tagliare il flusso e cambiare i tubi. Commutazione dei tubi in un unico movimento fluido e assicurarsi che i livelli di liquido in tubi campione nuovi e vecchi corrispondano per evitare il riflusso.

Prima di raccogliere i dati, preparare la corretta concentrazione dell'enzima di scissione del DNA e inserire il tubo di ingresso nel campione. Abbassare il magnete sopra la cella di flusso. Impostare la pompa per iniettare 80 microlitri di campione a 150 microlitri al minuto e iniziare la raccolta dei dati.

Un minuto dopo la raccolta dei dati, attiva la pompa. Qui è mostrata un'immagine rappresentativa delle perline tethered prima e dopo la reazione. L'analisi dei dati è stata eseguita per quantificare il numero di perline che rimangono tethered durante la reazione di scissione.

Questa tecnica è stata utilizzata per misurare i tassi di scissione del DNA specifici del sito di Nde1 per concentrazioni proteiche che vanno da 0,25 a quattro unità per millilitro e due diverse concentrazioni di magnesio. Ogni condizione è stata replicata almeno due volte, con alcuni 100-1000 DNA tethered per esperimento. A concentrazioni proteiche sufficientemente basse, il tasso è proporzionale alle proteine e indipendente dal magnesio.

Per alte concentrazioni proteiche, il tasso dipende dal magnesio, ma indipendente dalla concentrazione proteica. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che le bolle d'aria nel tubo e nel canale di flusso possono eseguire l'esperimento. Assicurarsi di non consentire l'ingresso di aria nelle linee durante la commutazione dei tubi e degasare tutti i buffer prima dell'uso.

Il metodo di tethering consente di esplorare l'effetto della tensione nel DNA sulla reazione. Questo può essere ottenuto variando la forza del magnete o applicando il flusso durante la raccolta dei dati.