Preparazione dell'estratto proteico e co-immunoprecipitazione da Caenorhabditis elegans

Questo protocollo fornisce una procedura passo-passo per la raccolta dei campioni, la preparazione dell'estratto e l'immunoprecipitazione per la conferma del successo di un pull-down proteico e la rilevazione di proteine co-immunoprecipitate di interesse. La preparazione dell'estratto proteico può essere eseguita per un massimo di 24 campioni ed è compatibile con una serie di applicazioni a valle, tra cui l'immunoprecipitazione e gli esperimenti di pull-down dell'RNA. Questo metodo può essere adattato per facilitare la verifica delle interazioni tra due o più proteine C. elegans endogene, marcate endogenamente o sovraespresse in una varietà di background genetici.

La dimostrazione visiva di questo protocollo ha lo scopo di mettere i ricercatori a proprio agio con la preparazione dell'estratto proteico e l'immunoprecipitazione, auspicabilmente incoraggiando coloro che sono nuovi alle tecniche a utilizzarle nella loro ricerca. Per raccogliere un campione di vermi, primo seme in fase mista o vermi sincronizzati su piastre di terreno di crescita di nematodi solidi alla temperatura richiesta e lasciare che i vermi crescano fino allo stadio desiderato. Al termine dell'incubazione, utilizzare un tampone M9 per lavare i vermi in una provetta conica da 15 millilitri e pellettare i vermi mediante centrifugazione.

Al termine della centrifugazione, rimuovere il surnatante e lavare i vermi altre tre-cinque volte in tampone M9 fresco per lavaggio. Quando il surnatante non è più torbido, eseguire un ultimo lavaggio con acqua distillata doppia e trasferire il pellet di verme sciolto in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Pellettare i vermi con una centrifugazione aggiuntiva e scartare il surnatante rimanente per ottenere un pellet di vermi impaccato.

Per preparare l'estratto dal pellet di verme raccolto, aggiungere un volume uguale di tampone di lisi 2X ghiacciato a un pellet di volume consigliato di 300 microlitri e mescolare energicamente la sospensione risultante. Centrifugare il campione per raccogliere la miscela sul fondo della provetta e trasferire il contenuto della provetta in una provetta da 1,5 millilitri priva di RNAsi contenente perle metalliche. Dopo aver tappato bene la provetta, posizionare il campione in un omogeneizzatore a graniglia a quattro gradi Celsius, facendo attenzione che il campione sia bilanciato all'interno dell'omogeneizzatore.

Omogeneizzare il campione alla massima velocità per quattro minuti prima di trasferire il campione in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri senza perline. Centrifugare il campione per chiarificare l'estratto proteico e trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri su ghiaccio senza trasferire il precipitato bianco e torbido nella parte superiore del campione. Mettere da parte 10 microlitri dell'estratto chiarificato per determinare la concentrazione proteica totale secondo i protocolli standard e diluire immediatamente il campione a cinque o 10 milligrammi di proteine per millilitro di tampone di lisi 1X ghiacciato su ghiaccio.

Per l'immunoprecipitazione della proteina di interesse, prima risospendere le perle magnetiche per inversione e trasferire 150 microlitri della sospensione di perle 50X in un tubo da 1,5 millilitri. Magnetizzare le perline sul ghiaccio contro un supporto magnetico per circa un minuto. Quando la soluzione è limpida, scartare il surnatante.

Rimuovere la provetta dal supporto magnetico e lavare le perle con tre volumi da 300 microlitri di tampone di lisi 1X. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le perle in 150 microlitri di tampone di lisi ghiacciata e trasferire 75 microlitri di impasto perlato in due milligrammi del campione di estratto proteico. Dopo un'incubazione di un'ora a quattro gradi Celsius con una leggera agitazione, posizionare la provetta del campione nel magnete sul ghiaccio per circa un minuto.

Quando le perle sono completamente magnetizzate e il campione è limpido, trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri senza disturbare le perline. Mettere da parte il 10% del campione per l'analisi Western blot e aggiungere 20 microgrammi di anticorpo purificato per affinità al lisato pre-autorizzato per un'incubazione di un'ora a quattro gradi Celsius con leggera agitazione. Al termine dell'incubazione, aggiungere i restanti 75 microlitri di sospensione di perle prelavate alla miscela di lisato anticorpale per un'ulteriore incubazione di un'ora a quattro gradi Celsius con una leggera agitazione.

Al termine dell'incubazione, riposizionare il campione sul magnete per circa un minuto. Quando le perle sono completamente magnetizzate e il campione è limpido, lavare le perle contenenti l'immunoprecipitato tre volte in 450 microlitri di tampone di lavaggio su ghiaccio. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet di perline in 20 microlitri di tampone di caricamento del gel proteico beta-mercaptoetanolo 2X SDS e far bollire il campione a 95 gradi Celsius per cinque minuti.

Per la rilevazione delle proteine immunoprecipitate mediante analisi Western blot, caricare il campione di proteina denaturata su un gel SDS-PAGE senza trasferire le microsfere ed eseguire l'analisi Western blot secondo i protocolli standard utilizzando gli anticorpi appropriati per le proteine di interesse, quindi rilevare le bande utilizzando la chemiluminescenza a base di perossidasi di rafano. Il protocollo dimostrato, nell'estrazione totale delle proteine, è paragonabile ai metodi basati su dounce per l'estrazione efficiente di proteine nucleari e citoplasmatiche. In questa analisi, è stato determinato che le proteine Argonaute interagiscono con i membri della famiglia proteica GW182 formando i complessi di silenziamento indotti da microRNA che si legano agli RNA messaggeri bersaglio e ne reprimono l'espressione.

I protocolli dimostrati per l'estrazione e l'immunoprecipitazione possono essere utilizzati anche per recuperare con successo i co-immunoprecipitati specifici di ALG-1 e HRPK-1. Inoltre, i test dell'interazione ALG-1:AIN-1 in una varietà di background genetici hanno rivelato che HRPK-1 non è necessario per l'assemblaggio del complesso di silenziamento indotto dal microRNA ALG-1:AIN-1. È importante assicurarsi che l'estrazione delle proteine e l'immunoprecipitazione vengano eseguite a quattro gradi Celsius o su ghiaccio per mantenere la stabilità dei campioni.

Questo preparato di estratto proteico totale è compatibile con l'immunoprecipitazione proteica e gli esperimenti di pull-down dei microRNA utilizzando un oligonucleotide complementare di microRNA e facilita la raccolta a valle di componenti proteici e RNA.