Name: Preparazione dellestratto proteico e co-immunoprecipitazione da Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Impara la preparazione di estratti proteici e la co-immunoprecipitazione in Caenorhabditis elegans. Questo protocollo ad alto rendimento consente di studiare interazioni proteiche in diversi background genetici.

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Questo lavoro è stato in parte supportato da Kansas INBRE, P20GM103418 a Li e Zinovyeva e R35GM124828 a Zinovyeva. Ringraziamo Min Han per aver generosamente condiviso l'anticorpo anti-AIN-1. Alcuni dei ceppi utilizzati nel corso di questo lavoro sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC), finanziato dall'Ufficio dei programmi di infrastruttura di ricerca del NIH (P40 OD010440).

1. Raccolta di campioni di worm
<ol><li>Seme a stadio misto osincronizzato 13 vermi su piastre solide NGM alla temperatura richiesta e consentire ai vermi di crescere fino allo stadio desiderato. Per la crescita e la manutenzione di base di C. elegans, si prega divedere Stiernagle et al.</li>
	<li>Raccogliere i vermi in un tubo di centrifuga conica da 15 ml lavando le piastre del verme con tampone M9.</li>
	<li>Pelletare i vermi centrifugando a 400 x g a temperatura ambiente (RT) per 2 minuti e scartare il supernatante. NOTA: La dimensione del pellet di verme per la preparazione dell'estratto è compresa tra 100 μL e 500 μL. Un pellet da 300 μL di vermi imballati è raccomandato per esperimenti di immunoprecipitazione a valle e in genere produce ~ 4,5 mg di proteine totali, mentre un pellet da 500 μL produrrà ~ 7,5 mg di proteine totali.</li>
	<li>Eseguire ulteriori lavaggi da 3 a 5 con buffer M9 (vedere tabella 1) o fino a quando il supernatante non è più torbido.</li>
	<li>Eseguire un lavaggio finale con ddH2O.</li>
	<li>Spostare il pellet di verme sciolto su un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml e girare verso il basso a 400 x g a RT per 2 min. Scartare il supernatante rimanente per ottenere un pellet di verme imballato e procedere all'estrazione della preparazione. NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. I pellet di verme possono essere immediatamente congelati in azoto liquido e conservati a -80 °C o in azoto liquido. Si prega di notare che i pellet di vermi possono essere scongelati una sola volta e non possono essere refrozen.</li>
</ol>2. Estrarre la preparazione del pellet di verme
NOTA: La preparazione dell'estratto deve essere eseguita su ghiaccio o a 4 °C.
<ol><li>Se congelato, scongelare il pellet di verme sul ghiaccio. NOTA: Se la dimensione del pellet di verme imballato desiderata di 300 μL non è stata ottenuta durante la raccolta del campione, è possibile formare più pellet più piccoli fino a quando non è presente materiale sufficiente per un'ulteriore estrazione.</li>
	<li>Aggiungere un volume uguale di tampone di lisi ghiacciato 2x (60 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM cloruro di potassio, 0,1% Tritone X, 4 mM cloruro di magnesio, 10% glicerolo, 2 mM DTT con inibitore della RNasi, inibitore della proteasi e inibitori della fosfatasi; vedi tabella 1) e vortice o pipetta su e giù per mescolare. Ruotare il tubo o i tubi verso il basso per raccogliere la miscela nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Spostare la miscela in un tubo privo di RNasi da 1,5 ml contenente perline metalliche (vedi Tabella dei materiali)e mettere il campione nell'omogeneizzatore del mulino perline (vedi Tabella dei materiali)a 4 °C. Assicurarsi che i tappi del tubo siano serrati e che i campioni siano bilanciati all'interno dell'omogeneizzatore.</li>
	<li>Omogeneizzare il campione alla massima velocità (impostando 12) per 4 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il campione dalle perline e posizionarlo in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 ml. In alternativa, un magnete fornito con l'omogeneizzatore può essere utilizzato per rimuovere le perline dal campione.</li>
	<li>Spin verso il basso l'estratto a 19.000 x g per 20 min a 4 °C per chiarire l'estratto proteico.</li>
	<li>Trasferire il supernatante in un tubo fresco da 1,5 ml sul ghiaccio, evitando il riporto del precipitato bianco e torbido che si forma sopra il campione. Il supernatante è ora l'estratto chiarito. NOTA: Salvare 10 μL dell'estratto chiarificato per determinare la concentrazione totale di proteine.</li>
	<li>Utilizzare immediatamente l'estratto per i seguenti esperimenti o congelare l'estratto in azoto liquido e conservare a -80 °C. NOTA: il protocollo potrebbe essere messo in pausa qui. Gli estratti possono essere conservati a temperatura ultra bassa (congelatore a -80 °C o azoto liquido per ~ 6 mesi). Gli estratti congelati possono essere scongelati una volta e non possono essere refrozen.</li>
	<li>Determinare la concentrazione totale di proteine dell'estratto utilizzando un kit di dosaggio della concentrazione proteica compatibile con i detergenti (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.</li>
</ol>3. Immunoprecipitazione
NOTA: Tutte le fasi di immunoprecipitazione per la preparazione dell'estratto devono essere eseguite sul ghiaccio o a 4 °C. Si raccomanda di utilizzare 2 mg di proteine totali per ogni immunoprecipitazione. Tuttavia, sono state eseguite immunoprecipitazioni di successo con 0,8-1 mg di proteine totali. Utilizzare sempre estratti proteici freschi o appena scongelati. Il seguente protocollo è delineato per eseguire l'immunoprecipitazione da 2 mg di proteine totali, o un singolo esperimento di immunoprecipitazione. La quantità di perline e anticorpi può essere aumentata o diminuita di conseguenza per più campioni o se viene utilizzata una diversa quantità di estratto proteico.
<ol><li>Posizionare o scongelare l'estratto proteico sul ghiaccio. Il campione può essere diluito a 10 mg/mL o a 5 mg/mL con tampone di lysis 1x ghiacciato (cfr. tabella 1).</li>
	<li>Rimospendare le perline magnetiche per inversione e trasferire 150 μL della sospensione del 50% delle perline in un tubo da 1,5 ml. Magnetizzare le perline sul ghiaccio contro un supporto magnetico per 1 minuto o fino a quando la soluzione non è chiara. Scartare il supernatante.</li>
	<li>Rimuovere il tubo dal supporto magnetico e lavare le perline in un tampone di lisi 1x utilizzando 2 volumi (cioè 300 μL) di liquami di perline. Ripetere il lavaggio 2 volte per un totale di tre lavaggi.</li>
	<li>Rimescolare le perline in 150 μL di tampone di lysis ghiacciato.</li>
	<li>Trasferire 75 μL del liquame di perline a 2 mg di estratto proteico e incubare a 4 °C per 1 h con delicata agitazione. Salvare la sospensione del tallone rimanente sul ghiaccio per un uso successivo. NOTA: Questo passaggio viene eseguito per ridurre il legame proteico non specifico alle perline durante la fase di immunoprecipitazione.</li>
	<li>Posizionare il tubo con campione sul supporto magnetico sul ghiaccio per 1 minuto o fino a quando le perline non sono completamente magnetizzate e il campione è chiaro. Trasferire il supernatante su un nuovo tubo da 1,5 ml; non disturbare le perline. Questo è il litorato proteico precleato. Risparmia il 10% del campione per l'analisi western delle macchie.</li>
	<li>Aggiungere 20 μg di anticorpo purificato di affinità al lisato precleare e incubare a 4 °C per 1 h con delicata agitazione. NOTA: La quantità di anticorpi utilizzati per l'immunoprecipitazione è specifica dell'anticorpo e della proteina e deve essere determinata empiricamente per garantire un'immunoprecipitazione efficace della proteina bersaglio.</li>
	<li>Aggiungere i restanti 75 μL della sospensione delle perline prelavate (fase 3.5) alla miscela anticorpo/lisato e incubare per 1 h a 4 °C con agitazione delicata.</li>
	<li>Posizionare il tubo nel supporto magnetico sul ghiaccio per 1 minuto o fino a quando le perline non sono completamente magnetizzate e il campione è chiaro. Salvare il supernatante per l'analisi western blot (facoltativo).</li>
	<li>Lavare le perline contenenti l'immunoprecipitato 3x in 450 μL di tampone di lavaggio (30 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM cloruro di potassio, 0,1% Tritone X, 2 mM di cloruro di magnesio, 10% di glicerolo, 1 mM DTT; cfr. tabella 1) sul ghiaccio. NOTA: Ulteriori lavaggi possono essere eseguiti se si preferisce condizioni di lavaggio più rigorose.</li>
	<li>Rimossare il pellet di perline in 20 μL di tampone di carico del gel proteico SDS/BME (vedi Tabella dei materiali)e denaturare bollendo a 95 °C per 5 minuti prima di caricarlo su un gel SDS-PAGE. In alternativa, i campioni denaturati possono essere conservati a -20 °C per diversi mesi. NOTA: Una porzione dell'immunoprecipitato di perline può essere salvata per l'isolamento dell'RNA a valle, se lo si desidera.</li>
</ol>4. Rilevamento western di macchie di campioni IP
<ol><li>Caricare gli esempi IP nel gel SDS-PAGE (vedere Tabella dei materiali). Evitare di trasferire le perline posizionando i tubi IP sul supporto magnetico per 1 minuto prima dell'aspirazione del campione.</li>
	<li>Eseguire l'assorbimentooccidentale 15,16 e la colorazione deglianticorpi 16 con le seguenti modifiche: diluire l'anticorpo ALG-117 1:500 nel 5% di latte secco non grasso (NFDM); diluire l'anticorpoHRPK-1 2 1:1,000 nel 5% NFDM; e diluire l'anticorpoAIN-1 18 1:10.000 nel 5% di NFDM. Gli anticorpi secondari (vedi Tabella dei materiali)sono stati utilizzati secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Rilevare le bande con chemiluminescenza basata su HRP (vedere Tabella dei materiali).</li>
</ol>

<ol><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li>
<li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HRPK-1%2C+a+conserved+KH-domain+protein%2C+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067(2019).</li>
<li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li>
<li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li>
<li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li>
<li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li>
<li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer%3A+an+old+tool+for+a+new+application%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li>
<li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans%3A+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58117(2018).</li>
<li>Larance, M., Bailly, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes.</a> Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).</li>
<li>Ding, L., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GW182+family+proteins+are+crucial+for+microRNA-mediated+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing.</a> Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).</li>
<li>Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Developmental+Timing+Regulator+AIN-1+Interacts+with+miRISCs+and+May+Target+the+Argonaute+Protein+ALG-1+to+Cytoplasmic+P+Bodies+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans.</a> Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).</li>
<li>Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute+Pull-Down+and+RISC+Analysis+Using+2%E2%80%99-O-Methylated+Oligonucleotides+Affinity+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2’-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices.</a> Methods in Molecular Biology. 725, Chapter 16 233-249 (2011).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e759(2008).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359(2010).</li>
<li>Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+conserved+residues+of+the+C.+elegans+microRNA+Argonaute+ALG-1+identify+separable+functions+in+ALG-1+miRISC+loading+and+target+repression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression.</a> PLoS Genetics. 10 (4), 1004286(2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Identification+of+C.+miRISC+Proteins%2C+miRNAs%2C+and+mRNA+Targets+by+Their+Interactions+with+GW182+Proteins+AIN-1+and+AIN-2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2.</a> Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Farboud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Genome+Editing+with+Cas9+Ribonucleoprotein+in+Diverse+Cells+and+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57350(2018).</li>
<li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

C. elegans è un ottimo modello per lo studio delle questioni fondamentali in biologia cellulare, molecolare e dello sviluppo19. Oltre al suo potere come sistema di modelli genetici, C. elegans è suscettibile di approcci biochimici, tra cui, a titolo considerato, immunoprecipitazione e co-immunoprecipitazione proteica. Un potenziale ostacolo quando si conducono esperimenti di immunoprecipitazione è la mancanza di anticorpi specifici per le proteine di interesse. Se non è disponibile alcun anticorpo, è possibile generare anticorpi policlonali o monoclonali personalizzati. Tuttavia, le recenti innovazioni nella tecnologia di editing del genoma hanno permesso ai ricercatori di introdurre rapidamente mutazioni o taggare geni endogeni C. elegans 20,21, facilitando studi che svelano le interazioni genetiche, funzionali e fisiche tra i geni e le proteine codificate. In particolare, l'etichettatura mediata da CRISPR/Cas9 dei geni C. elegans nei loci endogeni ha ridotto la dipendenza degli esperimenti di immunoprecipitazione dalla disponibilità di anticorpi, rendendo gli esperimenti di co-immunoprecipitazione molto più fattibili. I geni C. elegans possono essere taggati con una varietà di tag che vanno da tag fluorescenti come GFP o mCherry a piccoli tag come FLAG e HA. Gli anticorpi che riconoscono questi tag sono prontamente disponibili commercialmente, facilitando gli studi sulle interazioni proteina-proteina attraverso approcci di immunoprecipitazione.
Il protocollo presentato, descritto nella figura 1, può essere eseguito per un numero limitato di campioni o scalato, consentendo fino a 24 preparati campione alla volta. Mentre le caratterizzazioni iniziali delle interazioni proteina-proteina attraverso l'immunoprecipitazione sono tipicamente fatte in background di tipo selvatico in normali condizioni di crescita, gli studi di follow-up richiedono spesso di testare le interazioni proteina-proteina in una varietà di background genetici o in diverse condizioni di crescita. La capacità di preparare contemporaneamente più estrazioni consente di risparmiare tempo e, cosa importante, garantisce la coerenza della preparazione dell'estrazione tra i diversi campioni. È sempre necessario un controllo negativo, con il controllo ideale che è una mutazione nulla nella codifica genica per la proteina di interesse immunoprecipitata (vedi figura 3 e figura 4 per esempi).
Questo protocollo di estrazione consente una rapida preparazione dell'estratto proteico da campioni di C. elegans ed è paragonabile all'omogeneizzazione a base di perline di zirconio8. L'omogeneizzazione delle perline in generale può essere scalata fino a più preparati simultanei di campioni utilizzando una varietà di omogeneizzatori di mulini perline o apparecchiature simili. Tuttavia, alcuni omogeneizzatori più economici per mulini perline possono ridurre il numero di campioni che possono essere lavorati contemporaneamente. In alternativa, il protocollo di estrazione presentato è compatibile con la preparazione dell'estratto a base di dounce, che rappresenta un'alternativa economica. Mentre diversi omogeneizzatori di mulini di perline non sono stati testati, la maggior parte è probabile che sia compatibile con questo protocollo di estrazione proteica, purché si ottiene una completa interruzione dei campioni di C. elegans.
Come presentato, questo protocollo di preparazione dell'estratto è compatibile con più esperimenti a valle, tra cui l'immunoprecipitazioneproteica 2 e il pull-down di microRNA12 e consente la raccolta a valle di componenti di proteine e RNA. Estrae inoltre in modo efficiente proteine nucleari e citoplasmatiche (Figura 2, Figura 3e Figura 4). Allo stesso modo, il protocollo di immunoprecipitazione presentato consente l'isolamento dell'RNA dagli immunopreciti associati alle proteine. Mentre il protocollo di immunoprecipitazione è stato originariamente sviluppato per identificare gli interattori proteici ALG-1, il metodo può essere adattato per testare le interazioni tra qualsiasi proteina di interesse. Infatti, le condizioni di immunoprecipitazione utilizzate hanno funzionato altrettanto bene per l'immunoprecipitazione di ALG-1 (Figura 3) e HRPK-1(Figura 4). Questo protocollo è un ottimo punto di partenza per l'immunopurificazione delle proteine leganti l'RNA. Va notato, tuttavia, che alcuni cambiamenti nella composizione tampone possono essere necessari per altre proteine di interesse. I cambiamenti possono dipendere dalle proprietà fisiche e biochimiche della proteina di interesse e devono essere attuati caso per caso.
Una volta che la proteina bersaglio (qui, ALG-1 o HRPK-1) è immunoprecipitata, l'blotting occidentale può essere utilizzato per testare il co-immunoprecipitato per specifici interattori proteici.
In alternativa, l'immunoprecipitato copurato può essere sottoposto ad analisi di spettrometria di massa per identificare tutte le proteine putative interagenti. Le interazioni co-immunoprecipitazione confermate possono quindi essere esaminate in una varietà di background genetici o condizioni per identificare la potenziale regolazione dell'interazione specifica. Ad esempio, per determinare se hrpk-1 svolge un ruolo nell'assemblaggio miRISC ALG-1/AIN-1, la coprecipitazione ALG-1-AIN-1 è stata valutata sia in uno sfondo di tipo selvaggio che in assenza di HRPK-1 (Figura 3). hrpk-1 è stato trovato dispensabile per l'interazione ALG-1/AIN-12 (Figura 3). Inoltre, la tecnologia di editing del genoma CRISPR/Cas9 può essere utilizzata per generare mutazioni del singolo punto o del dominio nelle proteine di interesse. Ritestare la capacità dei mutanti generati di coprecipitate con i loro interattori proteici può rivelare quali domini o residui mediano l'interazione fisica. Tali studi futuri possono fornire informazioni preziose sul meccanismo della funzione e della regolazione delle proteine. Questi approcci, combinati con il potere della genetica C. elegans, possono fornire importanti intuizioni sui processi molecolari fondamentali che governano lo sviluppo animale e la funzione cellulare.

Identificare le interazioni macromolecolari di una proteina di interesse può essere la chiave per saperne di più sulla sua funzione. Gli esperimenti di immunoprecipitazione e co-immunoprecipitazione possono essere utilizzati per identificare l'intero interamome di una proteina attraverso approcci proteomici sularga scala 1 o per testare specificamente la capacità di una proteina di coprecipitate con un interagente ipotizzato. In C. elegans, entrambi i metodi sono stati utilizzati con successo per saperne di più sull'attività di una varietà di proteine, comprese quelle che funzionano strettamente con i microRNA perregolare l'espressione genica 2,3,4. Gli esperimenti di co-immunoprecipitazione hanno il vantaggio di testare le interazioni proteina-proteina nel loro ambiente cellulare nativo, ma la preparazione degli estratti può essere impegnativa e dispendiosa in termini di tempo. È necessaria un'analisi efficiente del campione, ma bisogna fare attenzione a ridurre al minimo l'interruzione delle interazioni proteina-proteina. Metodi come il douncing5, la sonicazione6,l'omogeneizzazione balch7e l'omogeneizzazione delle perline di zirconia8,9 sono stati utilizzati per preparare con successo gli estratti proteici totali di C. elegans. Questi metodi, ad eccezione dell'omogeneizzazione delle perline di zirconia, hanno limitazioni in termini di numero di campioni che possono essere elaborati contemporaneamente. Presentato è un metodo alternativo che può essere facilmente scalato per consentire una preparazione rapida ad alto contenuto di produzione e estratto proteico da campioni di C. elegans seguita da co-immunoprecipitazione. In particolare, il metodo può preparare fino a 24 campioni alla volta, riducendo notevolmente il tempo necessario per la preparazione dell'estratto. Al contrario, ad esempio, il douncing in genere consente una sola preparazione del campione alla volta. Questo metodo di estrazione può essere utilizzato per preparare estratti da qualsiasi stadio di sviluppo di C. elegans.
Descritto è una procedura dettagliata per la raccolta di campioni animali, la preparazione degli estratti, l'immunoprecipitazione e la presentazione dei dati western di soffiatura per confermare il successo del pulldown proteico e il rilevamento della proteina co-immunoprecipitante di interesse. Per dimostrare l'efficacia del protocollo, sono stati eseguiti due esperimenti di co-immunoprecipitazione tra 1) microRNA Argonaute ALG-1 e AIN-1, un omologo GW182; e 2) ALG-1 e HRPK-1, un interagente ALG-1 appena identificato2. ALG-1 e AIN-1 sono proteine fondamentali che comprendono il complesso silenziatore indotto da microRNA (miRISC) e l'interazione tra queste due proteine èben consolidata 10,11. Il protocollo di preparazione dell'estratto è stato efficace nell'esperimento di co-immunoprecipitazione ALG-1-AIN-1. Questo protocollo ha anche confermato con successo l'interazione tra ALG-1 e il suo interagentore appena identificato, HRPK-12.
In sintesi, il manoscritto descrive un protocollo di preparazione dell'estrazione di C. elegans che può essere scalato fino a elaborare simultaneamente 24 campioni insieme a un protocollo di co-immunoprecipitazione che può essere utilizzato per identificare nuove o confermare interazioni ipotizzate tra proteine. Il protocollo di preparazione dell'estratto è compatibile con una serie di esperimenti a valle, tra cui l'immunoprecipitazioneproteica 2 e i pulldown di microRNA12. Inoltre, il protocollo di immunoprecipitazione può essere adattato per testare le interazioni tra due o più proteine endogene, taggate endogenamente o C. elegans sovraespresse in una varietà di background genetici.

<table><tbody><tr><td>Provetta da 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>STEP 1.2</td></tr><tr><td>2x tampone per campioni Laemmli</td><td>BioRed</td><td>1610737</td><td>STEP 3.11</td></tr><tr><td>4&ndash; 20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>BioRed</td><td>4561096</td><td>STEP 4.1</td></tr><tr><td>anticorpo monoclonale anti-AIN-1</td><td>generato su misura</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2, vedi rif. Zhang et al. 2007</td></tr><tr><td>anticorpo monoclonale anti-ALG-1</td><td>generato su misura da PRF& L</td><td>n/a</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>monoclonale anti-HRPK-1</td> STEP 4.2 <td>generato su misura da PRF& L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm Omogeneizzatore</td><td>MidSci</td><td>BBY24M</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779-5G</td><td>Tabella 1</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A per immunoprecipitazione</td><td>Thermo Fisher</td><td>10002D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>Inibitori della proteasi senza EDTA</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Tabella 1</td></tr><tr><td>Anticorpo GFP (FL)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8334</td><td>Figura 2</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Thermo Fisher</td><td>G33-500</td><td>Tabella 1</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-coniglio di capra, HRP</td><td>BioRed</td><td>1662408</td><td>FASE 4.2</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario IgG (H+L) di capra, HRP</td><td>Thermo Fisher</td><td>31470</td><td>FASE 4.2</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500G</td><td>Tabella 1</td></tr><tr><td>LICOR WesternSure PREMIUM Substrato chemiluminescente, 100 mL Kit</td><td>LI-COR</td><td>926-95000</td><td>STEP 4.3</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato ACS</td><td>VWR</td><td>VWRV0288-500G</td><td>Tabella 1</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio anidro</td><td>Thermo Fisher</td><td>M65-500</td><td>Tabella 1</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga, 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td>STEP 1.6</td></tr><tr><td>Kit di lisi dell'RNA di tipo selvaggio CGC</td><td></td><td></td><td></td> Navy RINO RNA confezione da 50 (1,5 mL)MidSci NAVYR1-RNA STEP 2.3</tr><tr><td>Cocktail di inibitori della fosfatasi 2</td><td>Sigma</td><td>P5726-1ML</td><td>Tabella 1</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della fosfatasi 3</td><td>Sigma</td><td>P0044-1ML</td><td>Tabella 1</td></tr><tr><td></td><td></td> Cloruro di potassio Thermo Fisher P217-500 Tabella 1 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Thermo Fisher</td><td>P285-3</td><td>Tabella 1</td></tr><tr><td>Kit di analisi delle proteine RC DC I</td><td>BioRed</td><td>5000121</td><td>FASE 2.9</td></tr><tr><td>RNaseOUT Inibitore ribonucleasi ricombinante</td><td>Thermo Fisher</td><td>10777019</td><td>Tabella 1</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-500</td><td>Tabella 1</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico anidro</td><td>Thermo Fisher</td><td>S374-500</td><td>Tabella 1</td></tr><tr><td>TritionX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>Tabella 1</td></tr><tr><td>UY38 hrpk-1(zen17)</td><td>disponibile su richiesta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td><td>disponibile su richiesta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT3841 alg-1(tm492)</td><td>disponibile su richiesta</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione dell'estratto proteico e co-immunoprecipitazione da caenorhabditis elegans

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

I metodi di co-immunoprecipitazione sono spesso usati per studiare le interazioni proteina-proteina. La conferma delle interazioni proteina-proteina ipotizzate o l'identificazione di nuove possono fornire informazioni inestimabili sulla funzione di una proteina di interesse. Alcuni dei metodi tradizionali per la preparazione degli estratti richiedono spesso tecniche ad alta intensità di manodopera e dispendiose in termini di tempo. Qui, un protocollo di preparazione degli estratti modificato che utilizza un omogeneizzatore per mulini perline e perline metalliche è descritto come una rapida alternativa ai metodi tradizionali di preparazione delle proteine. Questo metodo di preparazione dell'estratto è compatibile con studi di co-immunoprecipitazione a valle. Ad esempio, il metodo è stato utilizzato per co-immunoprecipitato con successo C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 e due interattori ALG-1 noti: AIN-1 e HRPK-1. Questo protocollo include descrizioni della raccolta dei campioni animali, della preparazione degli estratti, della chiarificazione dell'estratto e dell'immunoprecipitazione proteica. Il protocollo descritto può essere adattato per testare le interazioni tra due o più proteine endogene, taggate endogenamente o sovraespresse di C. elegans in una varietà di background genetici.

Questo protocollo (schematizzato nella figura 1) è stato utilizzato con successo per ottenere estratti proteici totali di C. elegans (Figura 2) per l'immunoprecipitazione a valle didiverse proteine 2 (figura 3 e figura 4). Il protocollo di omogeneizzatore del mulino perline presentato era paragonabile, nell'estrazione totale delle proteine, ai metodi a base di dounce(figura 2)ed estratti in modo efficiente nucleare (COL-19::GFP(NLS)(figura 2)e proteine citoplasmatiche(figura 3 e figura 4). Più campioni di varie dimensioni sono stati estratti simultaneamente (Figura 2). Le proteine argonaute interagiscono con i membri della famiglia delle proteine GW182, formando i miRISC che si legano agli RRNA messaggero bersaglio e reprimeno la loroespressione 10. La figura 3 mostra una co-immunoprecipitazione riuscita dei componenti miRISC centrali ALG-1 e AIN-1, coerente con le precedentirelazioni 11,17. Più recentemente, sono stati compiuti sforzi per identificare ulteriori interattori proteici di Argonaute ALG-1 3 al fine disaperne di più su come la biogenesi e l'attività del microRNA potrebbero essere regolate da fattori ausiliari. La proteina hrpk-1 legante l'RNA è stata identificata negli immunoprecitiALG-1 3. Questa interazione è stata recentemente confermata in un esperimento di immunoprecipitazione HRPK-1reciproco 2. I protocolli di estrazione e immunoprecipitazione presentati hanno recuperato con successo ALG-1 in co-immunopreciti specifici di HRPK-1 (Figura 4). Inoltre, l'interazione ALG-1-AIN-1 è stata testata in una varietà di background genetici e HRPK-1 si è dimostrato non necessario per l'assemblaggio miRISC ALG-1/AIN-12 (Figura 3). Sono forniti dati supplementari per mostrare l'intera membrana sonanale(Figura supplementare 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> Figura 1: Schema del flusso di lavoro per C. elegans estrarre la preparazione e l'immunoprecipitazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> Figura 2: Confronto western di una FPG localizzata nucleare, COL-19::GFP(NLS), livelli in campioni preparati a dounce e omogeneizzati da 250 μL e 100 μL di pellet di verme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> Figura 3: Gw182 omologa AIN-1 co-immunopreciti con ALG-1. Western blotting per proteine ALG-1 e AIN-1 negli immunopreciti ALG-1. La co-immunoprecipitazione ALG-1/AIN-1 non è stata influenzata dall'assenza di hrpk-1. Ingresso = 10% di IP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> Figura 4: Co-immunopreciti ALG-1 con HRPK-1. Viene mostrato l'gonfiore occidentale per HRPK-1 e ALG-1 negli immunopreciti HRPK-1. Ingresso = 10% di IP. * indica la catena pesante degli anticorpi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">M9 buffer (1 L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4
</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>fino a 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2x Tampone di lysis (5 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glicerolo al 100%</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>fino a 5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aggiungi fresco:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inibitore della proteasi senza EDTA</td>
			<td>1 compressa</td>
		</tr>
<tr>
<td>cocktail inibitore della fosfatasi 2</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cocktail inibitore della fosfatasi 3</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Buffer di lysis</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Diluire il buffer di lysis 2x con un volume uguale di ddH20.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Tampone di lavaggio 10 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>300 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glicerolo al 100%</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>fino a 10 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL (aggiungere fresco)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Ricette
Figura supplementare 1. Vengono mostrate le membrane western blot a sondare completo utilizzate per generare figure 2-4. (A) Membrana sondata per la figura 2. Si noti che la membrana è stata tagliata per consentire il sondaggio simultaneo per GFP e Tubulina, riducendo le dimensioni complessive della macchia. (B) Membrana sondata per la figura 3. (C) Membrana sondata per la figura 3. *denota la catena pesante degli anticorpi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo metodo descrive un protocollo per la preparazione di estratti proteici ad alta produttività da campioni di caenorhabditis elegans e successiva co-immunoprecipitazione.

Preparazione dell'estratto proteico e co-immunoprecipitazione da Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

Questo protocollo fornisce una procedura passo-passo per la raccolta dei campioni, la preparazione dell'estratto e l'immunoprecipitazione per la conferma del successo di un pull-down proteico e la rilevazione di proteine co-immunoprecipitate di interesse. La preparazione dell'estratto proteico può essere eseguita per un massimo di 24 campioni ed è compatibile con una serie di applicazioni a valle, tra cui l'immunoprecipitazione e gli esperimenti di pull-down dell'RNA. Questo metodo può essere adattato per facilitare la verifica delle interazioni tra due o più proteine C. elegans endogene, marcate endogenamente o sovraespresse in una varietà di background genetici.La dimostrazione visiva di questo protocollo ha lo scopo di mettere i ricercatori a proprio agio con la preparazione dell'estratto proteico e l'immunoprecipitazione, auspicabilmente incoraggiando coloro che sono nuovi alle tecniche a utilizzarle nella loro ricerca. Per raccogliere un campione di vermi, primo seme in fase mista o vermi sincronizzati su piastre di terreno di crescita di nematodi solidi alla temperatura richiesta e lasciare che i vermi crescano fino allo stadio desiderato. Al termine dell'incubazione, utilizzare un tampone M9 per lavare i vermi in una provetta conica da 15 millilitri e pellettare i vermi mediante centrifugazione.Al termine della centrifugazione, rimuovere il surnatante e lavare i vermi altre tre-cinque volte in tampone M9 fresco per lavaggio. Quando il surnatante non è più torbido, eseguire un ultimo lavaggio con acqua distillata doppia e trasferire il pellet di verme sciolto in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Pellettare i vermi con una centrifugazione aggiuntiva e scartare il surnatante rimanente per ottenere un pellet di vermi impaccato.Per preparare l'estratto dal pellet di verme raccolto, aggiungere un volume uguale di tampone di lisi 2X ghiacciato a un pellet di volume consigliato di 300 microlitri e mescolare energicamente la sospensione risultante. Centrifugare il campione per raccogliere la miscela sul fondo della provetta e trasferire il contenuto della provetta in una provetta da 1,5 millilitri priva di RNAsi contenente perle metalliche. Dopo aver tappato bene la provetta, posizionare il campione in un omogeneizzatore a graniglia a quattro gradi Celsius, facendo attenzione che il campione sia bilanciato all'interno dell'omogeneizzatore.Omogeneizzare il campione alla massima velocità per quattro minuti prima di trasferire il campione in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri senza perline. Centrifugare il campione per chiarificare l'estratto proteico e trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri su ghiaccio senza trasferire il precipitato bianco e torbido nella parte superiore del campione. Mettere da parte 10 microlitri dell'estratto chiarificato per determinare la concentrazione proteica totale secondo i protocolli standard e diluire immediatamente il campione a cinque o 10 milligrammi di proteine per millilitro di tampone di lisi 1X ghiacciato su ghiaccio.Per l'immunoprecipitazione della proteina di interesse, prima risospendere le perle magnetiche per inversione e trasferire 150 microlitri della sospensione di perle 50X in un tubo da 1,5 millilitri. Magnetizzare le perline sul ghiaccio contro un supporto magnetico per circa un minuto. Quando la soluzione è limpida, scartare il surnatante.Rimuovere la provetta dal supporto magnetico e lavare le perle con tre volumi da 300 microlitri di tampone di lisi 1X. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le perle in 150 microlitri di tampone di lisi ghiacciata e trasferire 75 microlitri di impasto perlato in due milligrammi del campione di estratto proteico. Dopo un'incubazione di un'ora a quattro gradi Celsius con una leggera agitazione, posizionare la provetta del campione nel magnete sul ghiaccio per circa un minuto.Quando le perle sono completamente magnetizzate e il campione è limpido, trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri senza disturbare le perline. Mettere da parte il 10% del campione per l'analisi Western blot e aggiungere 20 microgrammi di anticorpo purificato per affinità al lisato pre-autorizzato per un'incubazione di un'ora a quattro gradi Celsius con leggera agitazione. Al termine dell'incubazione, aggiungere i restanti 75 microlitri di sospensione di perle prelavate alla miscela di lisato anticorpale per un'ulteriore incubazione di un'ora a quattro gradi Celsius con una leggera agitazione.Al termine dell'incubazione, riposizionare il campione sul magnete per circa un minuto. Quando le perle sono completamente magnetizzate e il campione è limpido, lavare le perle contenenti l'immunoprecipitato tre volte in 450 microlitri di tampone di lavaggio su ghiaccio. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet di perline in 20 microlitri di tampone di caricamento del gel proteico beta-mercaptoetanolo 2X SDS e far bollire il campione a 95 gradi Celsius per cinque minuti.Per la rilevazione delle proteine immunoprecipitate mediante analisi Western blot, caricare il campione di proteina denaturata su un gel SDS-PAGE senza trasferire le microsfere ed eseguire l'analisi Western blot secondo i protocolli standard utilizzando gli anticorpi appropriati per le proteine di interesse, quindi rilevare le bande utilizzando la chemiluminescenza a base di perossidasi di rafano. Il protocollo dimostrato, nell'estrazione totale delle proteine, è paragonabile ai metodi basati su dounce per l'estrazione efficiente di proteine nucleari e citoplasmatiche. In questa analisi, è stato determinato che le proteine Argonaute interagiscono con i membri della famiglia proteica GW182 formando i complessi di silenziamento indotti da microRNA che si legano agli RNA messaggeri bersaglio e ne reprimono l'espressione.I protocolli dimostrati per l'estrazione e l'immunoprecipitazione possono essere utilizzati anche per recuperare con successo i co-immunoprecipitati specifici di ALG-1 e HRPK-1. Inoltre, i test dell'interazione ALG-1:AIN-1 in una varietà di background genetici hanno rivelato che HRPK-1 non è necessario per l'assemblaggio del complesso di silenziamento indotto dal microRNA ALG-1:AIN-1. È importante assicurarsi che l'estrazione delle proteine e l'immunoprecipitazione vengano eseguite a quattro gradi Celsius o su ghiaccio per mantenere la stabilità dei campioni.Questo preparato di estratto proteico totale è compatibile con l'immunoprecipitazione proteica e gli esperimenti di pull-down dei microRNA utilizzando un oligonucleotide complementare di microRNA e facilita la raccolta a valle di componenti proteici e RNA.

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L'ossidazione fotochimica veloce in vivo delle proteine (IV-FPOP) è una tecnica di impronta proteica radicale idrossile che consente di mappare la struttura delle proteine nel loro ambiente nativo. Questo protocollo descrive l'assemblaggio e l'impostazione del sistema di flusso microfluidico IV-FPOP.

Impronta proteica radicale in vivo Hydroxyl per lo studio delle interazioni proteiche in Caenorhabditis elegans

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare l'estratto nucleare attivo dallo stadio larvale 4 C. elegans e visualizzare l'attività di trascrizione in un sistema in vitro .

Isolamento dell'estratto nucleare attivo di Caenorhabditis elegans e ricostituzione per la trascrizione in vitro

Qui viene presentata una descrizione dell'isolamento semplice e relativamente rapido del DNA genomico di Caenorhabditis elegans da uno o pochi animali utilizzando un kit di tessuti disponibile in commercio. La preparazione del gDNA risultante è un modello adatto per la PCR.

Estrazione su piccola scala di Caenorhabditis elegans DNA genomico

Questo protocollo descrive un test di interferenza dell'RNA e ChIP per studiare l'ereditarietà epigenetica del silenziamento indotto dall'RNAi e le modificazioni della cromatina associate in C. elegans.

Analisi dell'ereditarietà epigenetica transgenerazionale in C. elegans utilizzando un reporter fluorescente e l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)

Questo protocollo descrive un metodo rapido e riproducibile di estrazione e precipitazione a base di solventi organici per purificare polipeptidi simili all'elastina (ELP) da Escherichia coli, offrendo un'alternativa potenzialmente scalabile ai metodi convenzionali di purificazione ELP.

Purificazione efficiente dei polipeptidi simili all'elastina (ELP) da E. coli utilizzando un metodo di estrazione e precipitazione a base di solvente organico

Impara la preparazione di estratti proteici e la co-immunoprecipitazione in Caenorhabditis elegans. Questo protocollo ad alto rendimento consente di studiare interazioni proteiche in diversi background genetici.

Preparazione dell'estratto proteico e co-immunoprecipitazione da Caenorhabditis elegans

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